松嫩平原天然芦苇种群的DNA甲基化多态性分析.pdf

甲基化是一种与细胞和生物体适应紧密关联的表观遗传修饰.本文以松嫩草原多年生草本植物芦苇()为研究对象探讨了 甲基化在松嫩平原 种天然种群(标记为、和)内和种群间的多态性.采用甲基敏感扩增多态性()方法在 个芦苇种群中发现 个种群的 甲基化多态性水平较高而 和 种群内个体间甲基化变异相对较高.鉴于 种群在高 土壤中生长而其他 个种群来自低 土壤至少部分 甲基化变异可能是由盐碱化土壤条件诱导产生的.此外发现 检测到的甲基化多态性与 和 检测到的遗传变异密切相关.特异性甲基化多态性条带的同源性分析表明与已知功能基因具有同源性的基因主要参与细胞代谢和应激反应.关键词:表观遗传变异适应天然种群盐碱胁迫芦苇中图分类号:文献标志码:文章编号:()复制后 位胞嘧啶甲基的添加是大多数真核生物常见的 修饰在高等植物中也普遍存在.胞嘧啶 甲基化在调节基因活性、维持基因组完整性以及响应生物及非生物胁迫等方面具有重要作用.甲基化调控基因表达且植物体中改变的 甲基化模式(表观等位基因)可以通过有机体遗传给后代因此 甲基化模式的改变可能在植物适应中发挥重要作用.此外在环境条件改变的情况下 甲基化变异比序列变异更容易发生.近年来很多研究证实了 甲基化能够在应对逆境中发挥重要作用王子苑等发现低磷胁迫致高羊茅总甲基化率下降.因此推测磷胁迫诱导的高羊茅 甲基化的改变很可能参与了其对环境的适应性调节.李增强等的研究结果揭示了 甲基化水平变化在响应红麻铅胁迫中发挥了重要的作用.卢海等通过 分析发现红麻幼苗根系的 甲基化水平在镉胁迫的条件下被显著提高同时存在表达量差异的 甲基化相关基因中有 个与抗性密切相关.由此可知 甲基化主要是通过调节关键基因的表达促进生态适应.然而自然植物群体中的 甲基化多态性的细节仍有待深入研究.技术即甲基化敏感扩增多态性()技术是利用对 甲基化敏感且能够识别相同的限制性酶切位点即 位点的两种同裂酶 和 对基因组 进行酶切和连接再通过有无谱带来分析 序列中的 位点所出现的不同程度的甲基化状态.由于其技术操作简单且多态性高广泛应用于多种植物基因组 甲基化水平的检测.芦苇 野生芦苇属多年生植物之一是一种广泛分布于全球的湿地植物对恶劣环境具有显著的适应性.因此芦苇作为一种建群植物在中国东北松嫩草原盐碱侵蚀的广阔土地上发挥着重要作用.团队之前已经利用不同的分子标记证明了芦苇天然种群内和种群间存在较高水平的遗传多样性.鉴第 期 于英杰等:松嫩平原天然芦苇种群的 甲基化多态性分析于以胞嘧啶 甲基化改变呈现的自然发生的表观遗传变异存在于迄今为止所研究的所有植物物种中在对比环境条件下评估芦苇 甲基化多态性的模式和程度有着重要意义.本文采用 技术结合改进的记录分析规则研究了松嫩草原芦苇天然种群内和种群间胞嘧啶 甲基化变异的水平和模式并分析了它们与同一组植物测定的遗传变异的相关性.材料与方法.实验材料本研究的样本取自 个天然芦苇种群包括生长在低 土壤上的、正常土壤上的 以及生长在高 土壤上的 和.个种群均分布在中国东北部的松嫩草原(北纬 、东经)区域.从 个种群中随机选择相同发育阶段的膨大叶片分别在、和 中抽取、和 个个体储存在液氮中.尽量扩大被选择个体之间的距离(至少 间隔)以避免收集到从同一根状茎无性生长繁殖的植株.实验方法.标记用改良的 法提取基因组 再以苯酚萃取法进行纯化.采用凝胶电泳和光谱法检测 的质量和数量.技术操作程序包括以下步骤:酶切及连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、记带和数据整理通过对凝胶测序来分析 扩增产物.其中本文所用到的接头序列和预扩增引物序列分别见表 和表.而选择性扩增部分则首先用 对 选择性扩增引物组合进行了初步试验使用从单一样本中提取的两个独立的 对引物进行筛选.经过筛选最终选定了 对引物.这些引物均产生了大量的离散条带并且在两个 样本间高度重复的引物.扩增片段经银染色显色.表 所用接头序列.接头序列/表 预扩增引物.预扩增引物序列 /.数据分析为确保记录条带的可重复性所有样本进行了两组独立的 扩增在 图谱中所有条带被转化为二进制字符矩阵“”表示有带“”表示没有带.采用改进的分析规则排除了遗传变异的混杂效应.具体而言对于同时出现在两条谱线(和)的条带即/(/)模式记为()对于只出现在 或只出现在 中的条带即/(/)或/(/)模式分别记为()和()对于 和 中均不存在条带的情况即/(/)模式记为().然后按照如前所述 和 的分析方法对数据进行分析.吉林师范大学学报(自然科学版)第 卷.多态性 甲基化条带的分析和测序本研究中需要分离的目标条带为种群特异的或富集的甲基化多态性条带指的是只由于胞嘧啶甲基化差异而存在或不存在并且在一个种群中至少存在于 的个体中的条带.用尖锐刀片将这些条带从银染过的凝胶上剪下采用相应的 预扩增引物组合对其重新扩增.产物的片段大小经琼脂糖凝胶电泳验证并克隆到 克隆载体(上海生工)上.克隆的 片段经测序后使用 网站(:./)上的 程序进行同源性分析.结果与分析.引物组合的选择通过将 条 引物和 条/引物进行组合而成的 对引物进行检测筛选出了 对引物序列见表.基于两个技术重复间条带清晰且可重复的标准从、和 这 个种群的 个无性系中共获得 条带.每对引物扩增的条带数从 条至 条不等其中引物组合“”产生的条带数最多为 条占比.而“”产生的条带数最少为 条占比.引物组合“”扩增后的结果如图 所示.表 选择性扩增引物.名称 引物/引物条带数图 东北松嫩草原的 个芦苇天然种群 个个体的 图谱(箭头代表典型的甲基化多态性).(.).().基于甲基化敏感多态性和甲基化不敏感多态性数据进行聚类分析和主坐标分析基于 相似性系数对从 个芦苇天然陆地种群 个个体中获得的 个条带进行分析得第 期 于英杰等:松嫩平原天然芦苇种群的 甲基化多态性分析到了遗传相似性矩阵.通过 聚类算法将 个个体分为 类(甲基化敏感多态性)和 类(甲基化不敏感多态性)其中两个种群(和)的个体组成与其种群起源相对应(图 和图).而种群 和 尽管位于相对接近的地理位置却在 和 中分别形成了三个和两个亚群(图 和图).在 和 分析中基于 检验原始遗传相似性矩阵与同源相关矩阵之间的相关性极显著(.)从而证明了研究结果的可靠性.图 松嫩草原 个天然芦苇种群 个个体的甲基化敏感扩增多态性的 树图分析.图 松嫩草原 个天然芦苇种群 个个体的甲基化不敏感扩增多态性的 树图分析.吉林师范大学学报(自然科学版)第 卷基于 和 数据采用主坐标分析方法()对芦苇无性系个体和种群间的关系进行了分析(图 和图).显然 完全证实了 聚类分析的结果.分析表明地理位置是导致群体间遗传分化的主要因素.图 松嫩草原 个天然芦苇种群 个个体的甲基化敏感扩增多态性的主坐标分析.图 松嫩草原 个天然芦苇种群 个个体的甲基化不敏感扩增多态性的主坐标分析.、和 内部及之间的 检验 检验通常被用来检测各标记的显著性和相关性.本文尝试用这种方法评估、和 的 矩阵之间的相关性发现基于 检验每个标记都非常显著(表).研究结果表明不同种群内和种群间都存在显著的甲基化变异且甲基化变异与 和 高度相关.表 、和 的 检验.第 期 于英杰等:松嫩平原天然芦苇种群的 甲基化多态性分析.芦苇种群间遗传分化的相关因素分析基于四个芦苇种群(、和)个单株的 和 聚类分析和主坐标分析结果发现芦苇种群间遗传分化的主要因素是地理位置(表).在 和 以及 聚类树中 组个体的遗传分化水平不高而 组(和)个体没有按照其位置进行聚类(图 表)这可能是由于高 影响组内的单一甲基化变异所致(表).同时 相对于 表现出较高的甲基化水平而这两种生境的 相当接近(表)这说明在遗传分化过程中还涉及其他环境因素如干旱和盐胁迫.表 松嫩草原 种芦苇天然种群土壤 与地理位置.表 检测到的芦苇天然种群的 个单株的条带总数和 甲基化数目.(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()()(.)(.)(.)().吉林师范大学学报(自然科学版)第 卷续表(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)().(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)().第 期 于英杰等:松嫩平原天然芦苇种群的 甲基化多态性分析续表(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)()(.)(.)(.)(.)().注:为在/和/两条泳道上出现的条带为只在/泳道出现而/泳道不出现的条带为只在/泳道出现而/泳道不出现的条带为在/和/中都不出现的条带.分离条带的序列分析在 条表型特异性 条带中 条与 数据库中已知的功能序列具有显著的同源性由于其中 条序列是调控基因 条是反转录转座子的编码序列表明了与芦苇种间遗传分化相关的基因组位点很可能并不是随机的.具体来说有位点编码液泡质子焦磷酸酶 基因、依赖性谷氨酸合成酶基因、参与应激相关通路的 蛋白、磷酸葡萄糖酸酶/磷酸甘酸酶家族蛋白、含有/结构域的蛋白质以及逆转录转座子元件的两个同源物(表).因此芦苇群体水平上的甲基化差异可能是因为调控基因和转座元件发挥了重要作用这可能是胁迫诱导的定向突变或环境引起的随机突变的结果.表 从 电泳结果中分离出的特异性条带的 信息.条带名称预测同源性 .()()()./.().()()/吉林师范大学学报(自然科学版)第 卷续表 条带名称预测同源性.:.()()/.()()结论与讨论在本文的前期工作中我们已经明确利用 标记和 标记检测了 个相同芦苇个体的遗传多样性和遗传分化这种方法是有效的并且两种标记之间存在高度的相关性.本文所使用的 对分析牧草 甲基化变异来说是一个含有丰富信息的表观遗传标记其在揭示植物群体内遗传多样性以及群体间遗传分化方面与 和 的结果非常相似.然而 检测到的不同种群中存在的甲基化变异水平高于在 和 中的发现其中包括 检测到的 多样性水平高于用 和 检测到的结果基于 数据的种群聚类更紧密这些均表明 技术可以更有效地研究环境条件改变引起的芦苇甲基化多态性和遗传变异.另外通过四个芦苇种群(、和)个单株的 和 聚类分析和主坐标分析发现 和 之间的聚类分析和主坐标分析相似表明在应对极端环境的过程中 甲基化修饰依赖于遗传变异的调控.而通过对从芦苇种群中选出的种群特有的一些条带进行测序进一步证实了 甲基化变异在响应环境胁迫中可能做出的贡献.序列同源性分析也证明了具有调控功能的基因组位点可能优先经历了芦苇的基因组分化和适应性进化.本文研究了 甲基化在松嫩平原 种芦苇天然种群内和种群间的多态性结果表明在高 土壤中生长的 种群比来自低 土壤的其他 个种群呈现更高的种群内个体间甲基化变异程度表明部分 甲基化变异可能是由盐碱化土壤条件诱导产生的.此外还发现了与已知功能基因具有同源性的基因主要参与细胞代谢和应激反应.参 考 文 献 .():.():.:.赵一博辛翠花赵慧等.甲基化在植物响应重金属胁迫中的作用.种子():.():.:.():.():.().():.:.():.():.王子苑舒健虹吴佳海等.低磷胁迫下高羊茅生理响应及基因组 甲基化多态性分析.中国草地学报():.李增强丁鑫超卢海等.铅胁迫下红麻生理特性及 甲基化分析.作物学报():.第 期 于英杰等:松嫩平原天然芦苇种群的 甲基化多态性分析卢海李增强唐美琼等.红麻 甲基化响应镉胁迫及甲基化差异基因的表达分析.作物学报():.:.():.():.韩雅楠赵秀娟蔡禄.技术在植物抗逆性方面的应用.生物技术通报():.李卫国常天俊龚红梅.技术及其在植物遗传学研究中的应用.生物技术():.().():.():.:.():.().():.(.):.()./.()().:(责任编辑:徐 娜)