苏云金芽孢杆菌BT蛋白动物安全性试验.pdf

Vol.9 No.4Aug.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月文章编号：2096-0387（2023）04-04苏云金芽孢杆菌 BT 蛋白动物安全性试验刘鼎阔1,3,4，董惠峰1，宁未萌2,3,4，刘阔2,3,4，刘芳1,3,4，李源1,3,4，胡鹏程1,3,4*（1.鼎正新兴生物技术（天津）有限公司，天津 300383；2.天津农学院，天津 300393；3.天津市生物饲料添加剂企业重点实验室，天津 300383；4.天津市饲用小分子蛋白工程中心，天津 300383）摘 要：目的：明确高剂量条件下苏云金芽孢杆菌发酵液中 BT 蛋白对哺乳动物的生物安全性。方法：健康小鼠随机分为 4 组，每组 10 只；实验组分别按 0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 灌服 Bt 发酵上清液，每天一次，连续给药 7 天；空白对照组正常饲养，不灌胃。结果：实验组与对照组血常规、血液生化分析等检测数据差异不显著；灌胃后解剖小鼠，无明显可见的病理变化；取心、肝、脾、肺、肾做组织切片，通过显微镜观测仍未见病理变化。结论：小鼠能够耐受高剂量苏云金芽孢杆菌发酵液中的 BT 蛋白。关键词：苏云金芽孢杆菌；BT 蛋白；生物安全性中图分类号：S482.7；R595.4 文献标识码：ATheAnimalSafetyTestofBacillus thuringiensisBTProteinLIU Dingkuo1,3,4,DONG Huifeng1，NING Weimeng2,3,4,LIU Kuo2,3,4，LIU Fang1,3,4,LI Yuan1,3,4,HU Pengcheng1,3,4*（1.Dingzheng Xinxing Biotechnology(Tianjin)Co.,Ltd.,Tianjin 300383,China;2.Tianjin Agricultural College,Tianjin 300393,China;3.Tianjin Key Laboratory of Biological Feed Additives,Tianjin 300383,China;4.Tianjin Feed Small Molecule Protein Engineering Center,Tianjin 300383,China）Abstract:Objective:In order to clarify the biological safety of BT protein in Bacillus thuringiensis fermentation broth for mammals at high doses.Methods:The experiment is designed as follows:Healthy mice are randomly divided into 4 groups of 10 mice in each group.The experimental group is administered Bacillus thuringiensis fermentation supernatant once a day at 0.2 mL/kg,0.6 mL/kg and 1.0 mL/kg for 7 days.The blank control group is fed normally and dont gavage.Results:The test results show that blood routine and blood biochemical analysis are not significantly different between the experimental group and the control group;After gastric gavage dissecting the mice,there are no obvious pathological changes;The heart,liver,spleen,lungs,and kidneys are taken as tissue sections,and no pathological changes are seen by microscopic observation.Conclusion:This shows that the mice are able to tolerate the BT protein in the fermentation broth of Bacillus thuringiensis at high doses.Keywords:Bacillus thuringiensis;BT protein;biosecurity苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在营养生长阶段会产生外泌型的 VIP 蛋白，进入出芽生殖期后在芽孢内会伴生一种特殊的伴孢晶体 CRY 蛋白，这些蛋白均具有杀虫效果，统称 BT 蛋白1。BT 蛋白的杀虫机制已经得到广泛研究，基本途径为虫体的中肠上皮细胞存在特异位点，可以在与 BT 蛋白结合后引起膜穿孔，最终导致虫体死亡2-4。该机制主要作用于鳞翅目昆虫，因哺乳动物的肠细胞表层不含 BT 蛋白受体，所以人和家畜动物对这种蛋白不敏感，因此 BT 蛋白作为一种无害杀虫剂在杀虫领域得到广泛应用5-6。但是BT 蛋白的毒理作用是否会因为其在体内积累而引起哺乳动物的病变目前尚无确定结论，所以本文旨在通过加大苏云金芽孢杆菌浓度，选择健康小鼠为靶动物，了解 BT 蛋白纯化液对动物的临床表现、生理生化指标作者简介：刘鼎阔（1982），男，内蒙古赤峰人，硕士，高级兽医师，研究方向为饲用微生物添加剂。通信作者：胡鹏程（1988），男，山西忻州人，硕士，兽医师，研究方向为工业微生物改造及其产物。E-mail：wwwakkdrp 。40生物化工2023 年的影响，为该产品在临床上的应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器雌性健康小鼠 40 只（实验动物许可证：SYXK(京)2020-0053），体重 18 22 g；苏云金发酵 BT 蛋白纯化液，鼎正新兴生物技术（天津）有限公司；蛋白胨、酵母粉，天津市北联精细化学品开发有限公司。SHY-2A 恒温水浴摇床，上海比郎仪器制造有限公司；H1850R 低温离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Countess 3 血球计数仪，赛默飞世尔科技公司；FDC NX500iVC 血生化仪，富士胶片医疗系统有限公司；HS-3315 组织切片机，北京莱博瑞杰科技有限公司；ECLIPSE SI 显微镜，尼康精机（上海）有限公司。1.2 方法1.2.1 试验动物分组将试验小鼠随机分为 4 组，每组 10 只，分组情况见表 1。表 1 试验动物分组与处置组别动物 数/只试验处理CK10正常饲养，不给药A110每天 1 次，灌服，连续给药 7 d，药品剂量 0.2 mL/kgA210每天 1 次，灌服，连续给药 7 d，药品剂量 0.6 mL/kgA310每天 1 次，灌服，连续给药 7 d，药品剂量 1.0 mL/kg1.2.2 观察指标一般动物安全性实验观察周期在 7 28 d，本实验考虑发酵制品储存周期不宜过久，且储存期越长，污染风险越高；另考虑 BT 蛋白在胃肠环境极易吸收，7 d足以产生足够的积累，所以确定第 7 d 观察相关指标。1.2.2.1 临床观察试验期间每日观察受试动物是否出现与药物相关的不良反应，如呼吸与行为异常、精神抑制及排粪异常等情况。1.2.2.2 体重对试验前及试验结束后受试小鼠称量体重，做好记录。1.2.2.3 血样分析（1）采血及处理方法。所有动物分别在给药前和给药结束后采血，分两管放置；其中 1 管为带抗凝剂的离心管，用于血常规分析；另一管不带抗凝剂，血液样品于室温下静置 2 h，2 500 r/min 离心 5 min，取上层血清，-20 保存，用于血液生化指标分析。（2）血常规分析。取加抗凝剂管全血进行白细胞计数（WBC）、白细胞分类 嗜中性粒细胞（NE）、淋巴细胞（LY）、单核细胞（MO）、嗜酸性粒细胞（EO）、嗜碱性粒细胞（BA）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、血小板计数（PLT）等指标分析。（3）血液生化指标分析。取血清进行丙氨酸氨基转换酶（ALT）、天门冬氨酸转换酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等指标分析。1.2.2.4 解剖学检查对靶动物进行大体解剖学检查，对心、肝、脾、肺、肾等脏器有选择地做病理学剖检和病变组织观察，了解该制剂临床应用的安全性。1.3 统计分析数据以均值 标准差格式展示，采用 SPSS 13.0中卡方检验分析组间差异，P 0.05 和 P 0.01 分别表示差异显著和极显著。2 结果与分析2.1 给药后临床观察各组动物给药后的呼吸、行为、精神、排粪、食欲等均正常，未出现不良反应。2.2 给药前后体重变化给药前和给药后动物体重结果见表2。结果表明，给药前后各组小鼠的体重差异不显著（P 0.05）。2.3 血常规分析结果各组小鼠的血常规指标检测结果见表 3。从表 3中可以看出，各剂量组给药前后的血常规指标与正常组比较差异不显著（P 0.05），说明 Bt 发酵纯化上清液在 0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 剂量范围对血液常规指标没有明显的影响。2.4 血液生化分析结果小鼠的血液生化指标检测结果见表 4。从表 4 中可以看出，各剂量组给药前后的血液生化指标与正常组比较差异不显著（P 0.05），说明 Bt 发酵纯化上第 4 期41刘鼎阔等：苏云金芽孢杆菌BT蛋白动物安全性试验清液在 0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 剂量范围对血液生化指标没有明显的影响。2.5 尸体解剖及组织观察结果1.0 mL/kg 剂量组和对照组的心、肝、脾、肺、肾的组织切片见图 1。大体剖检结果和组织学检查均无明显的肉眼可见病理变化。表 3 不同剂量 Bt 发酵纯化上清液对小鼠血常规指标的影响组别WBC/（109/L）白细胞分类/%RBC/（1012/L）HGB/（g/L）HCT/%PLT/（109/L）NELYMOCK14.721.1238.465.1759.355.352.000.566.781.00117.414.3036.173.55426.6028.05A114.351.3939.535.4158.375.482.100.646.701.01109.4010.7435.903.64409.8029.93A215.091.4838.316.2259.855.911.840.686.881.18111.6416.3535.315.12420.0932.86A314.41.1.3940.304.4357.634.442.070.896.931.01115.6014.6837.185.17423.9028.95表 4 不同剂量 Bt 发酵纯化上清液对小鼠血液生化指标的影响组别AST/（IU/L）ALT/（IU/L）BUN/（mmol/L）Cr/（mol/L）ALB/（g/L）TP/（g/L）CHO/（mmol/L）TG/（mmol/L）CK110.1021.9379.8810.042.170.41168.1819.3436.606.6254.606.931.880.130.270.07A1105.7021.0676.2811.592.260.40167.1616.0936.106.3357.405.851.800.120.280.07A276.7018.6876.6014.012.140.40166.2716.4934.407.4155.305.741.840.130.250.06A3107.9013.8976.2613.892.300.47165.3214.5035.005.2455.104.381.860.200.260.07（a）心脏（b）肝脏（c）脾脏（d）肺脏（e）肾脏图 1 组织切片表 2 给药前和给药后小鼠体重变化（单位：g）组别体重平均日增重给药前给药后A119.880.7922.252.200.34A221.000.9022.482.230.35A319.830.8422.061.660.32CK19.880.7322.151.760.32（下转第45页）第 4 期45李陇梅等：正交法优化废弃卤虫冻干保护剂参考文献1 李荣超,隋丽英,张波,等.天津塘沽盐场卤虫种群生态调查 J.天津科技大学学报,2018,33(5):57-62.2 李亚男,辛乃宏.卤虫养殖技术现状及影响因素 J.海湖盐与化工,2003(5):25-28.3 陈合,李串娜,舒国伟,等.正交法优化保加利亚乳杆菌冻干保护剂 J.陕西科技大学学报(自然科学版),2013,31(2):89-92.4 KESSLER W J,SHARMA P,MUJAT M,et al.Advances in instrumental analysis applied to the development of lyophilization cyclesM/VARSHNEY D,SINGH M.Lyophilized Biologics and Vaccines.New York:Springer New York,2015.5 天津瑞普生物技术股份有限公司.一种犬干扰素冻干制品:105801683AP.2016-07-27.6 杨虎虎,刘志远,张翠萍,等.不同保护剂对血管性血友病因子制品冻干、干热灭活活性的影响 J.中国输血杂志,2016,29(9):913-914.表 1 正交实验设计及结果序号A海藻糖质量分数/%B蔗糖质量分数/%C甘露醇质量分数/%D精氨酸质量分数/%YDHA/（g/kg）YEPA/（g/kg）YVC/（mg/kg）11（15）1（10）1（8）1（1.5）2.61.131.3212（15）2（10）2（1.8）2.41.232.8313（20）3（12）3（2.0）2.71.229.042（20）1212.61.431.5522134.92.640.8623324.41.337.173（25）1322.91.435.1832233.01.937.0933113.21.729.2K17.7 8.1 10.5 8.4 K211.9 10.3 8.2 9.7 K39.1 10.3 10.0 10.6 R1.4 0.7 0.8 0.7 K13.5 3.9 5.6 4.2 K25.3 5.7 4.3 3.9 K35.0 4.2 3.9 5.7 R0.6 0.6 0.6 0.6 K193.1 97.9 109.1 92.0 K2109.4 110.6 93.5 105.0 K3101.3 95.3 101.2 106.8 R5.4 5.1 5.2 4.9 3 结论综上所述，Bt 发酵纯化上清液按 0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 剂量给药，小鼠体态特征与对照组相比未见异常；血常规、血液生化分析等检测结果显示两组差异不显著；给药结束后解剖小鼠，制作组织切片，通过 10 倍和 40 倍显微镜观测仍未见病理变化。由此说明，Bt 发酵纯化上清液的生物安全性极高。参考文献1 黄慧敏,曾远婷,王磊.苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展 J.广东化工,2021,48(10):86-87.2 程桂阳.Bt 菌发酵液水溶性活性物质的检测和应用 D.桂林:桂林理工大学,2019.3 赵奎军,邢亚楠,韩岚岚,等.苏云金芽胞杆菌 Bt20 菌株发酵条件的优化 J.东北农业大学学报,2014,45(7):45-53.4 王鹤茹,刘燕舞.Bt 生物农药发酵研究进展 J.安徽农业科学,2010,38(19):10116-10117.5 陈在佴,吴继星,张志刚,等.我国苏云金杆菌液体深层发酵研究十年进展(1990-2000)J.中国生物防治,2002(1):33-35.6 胡飞,徐婷婷,苏贤岩,等.苏云金杆菌微型颗粒剂对玉米鳞翅目害虫的防治效果 J.中国生物防治报,2023,39(1):46-53.（上接第 41 页）