太行铁线莲的繁殖技术初探.pdf

第3 8 卷第3 期2023年7 月文章编号：2 0 96-47 49(2 0 2 3)0 3-0 3 45-0 9引文格式：郑妍，刘志杰，张存石，刘冬云.太行铁线莲的繁殖技术初探J.林业与生态科学，2 0 2 3，3 8（3）：3 453 53.ZHENG Yan,LIU Zhijie,ZHANG Cunshi,LIU Dongyun.A preliminary investigation on the propagation technologyof Clematis kirilowiiJJ.Forestry and Ecological Sciences,2023,38(3):345-353.林业与生态科学FORESTRY ANDECOLOGICAL SCIENCESDOI:10.13320/ki.hjfor.2023.0043Vol.38 No.3Jul.2 0 2 3太行铁线莲的繁殖技术初探郑妍，刘志杰，张存石，刘冬云（河北农业大学园林与旅游学院，河北保定0 7 10 0 0）摘要：为研究太行铁线莲的最佳繁殖方式，建立组织培养体系，以太行铁线莲的种子和带芽茎段为试材，分别进行了不同激素处理、不同水温浸种处理和不同贮藏方式处理的种子萌发试验，并采用4因素3 水平正交设计对其插繁殖技术进行研究。结果表明，太行铁线莲种子经50 mg/L6-BA浸种处理2 4h后发芽率最高，为59.3 3%；以插穗顶部蘸取清水后扦插在草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1上，有利于其生根；太行铁线莲带芽茎段以0.1%HgCl2消毒7 min时，出芽率最高。腋芽诱导最佳培养基为：MS十1.0 mg/L6-BA+0.05mg/LNAA,不定芽增殖最佳培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+1.0mg/LKT。关键词：铁线莲；种子萌发；扦插；组织培养中图分类号：S682.39文献标志码：AA preliminary investigation on the propagationtechnology of Clematis kirilowiZHENG Yan,LIU Zhijie,ZHANG Cunshi,LIU Dongyun(College of Landscape Architecture and Tourism,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)Abstract:In order to study the best propagation method and establish a tissue culture systemfor Clematis kirilowi,seeds and germinated stem segments of C.kirilozwi were used astest materials for seed germination tests with different hormone treatments,different watertemperature immersion treatments and different storage treatments,and a 4-factor 3-level or-thogonal design was used to study the propagation technique of its cuttings.The resultsshowed that the highest germination rate of 59.33%was achieved after the seeds of C.kiril-ozwi were dipped at 50 mg/L 6-BA for 24 hours.The cuttings were dipped in water at thetop of the spike and rooted on grass charcoal:perlite:vermiculite=1:1:l,and thehighest germination rate was achieved when the sprouted stem segments of C.kirilowii weredisinfected with 0.1%HgCl2 for 7 minutes.The best medium for axillary shoot inductionwas MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,and the best medium for adventitious shoot收稿日期：2 0 2 2-0 6-2 7基金项目：河北省铁线莲属植物种质资源收集与新种质创新（2 0 3 2 6 3 3 9D）。第一作者：郑妍（1997-），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向为园林植物育种。通信作者：刘冬云（197 1-），女，河北石家庄人，副教授，硕士生导师，研究方向为地被植物资源收集及育种。346proliferation was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L KT.Keywords:Clematis kirilowi;seed germination;cuttings;tissue culture林业与生态科学第3 8 卷太行铁线莲（Clematiskirilowi）国内分布广泛，主要分布于河北、山东、山西、安徽等地。作为毛科（Ranunculaceae)铁线莲属（Clematis)中的野生植物，适应性极强，在河北省海拔2 0 0 1540 m的山地、河边、灌木丛等均有分布。太行铁线莲全株可人药，具有抗菌、消炎、镇痛等多种有效成分，花量密集，覆盖度高，攀援能力强，常作为垂直绿化材料用于廊架、墙体的装饰，是良好的园林绿化材料2 。中国作为野生铁线莲属植物资源最为丰富的国家，在对其引种驯化和资源开发利用方面研究较少3 。河北省内野生花卉资源丰富，但部分种子难以萌发，生长周期较长，导致其园林应用受限，资源开采利用率低4。但近些年来对于铁线莲属植物的研究主要集中于分类、种质资源调查和药用价值方面，有关育种和繁殖方面的研究较少。为此，对太行铁线莲的不同繁殖方式进行研究，旨在为铁线莲的引种、繁殖及种质资源开发利用提供理论依据。1材料与方法1.1材料供试的太行铁线莲种子及插条均为野生状态下采自河北省邯郸市磁县炉峰山。选取生长健壮、无病虫害的植株作为母株，于2 0 2 0 年7 月采集太行铁线莲当年生半木质化枝条，经消毒后在河北省保定市河北农业大学园林智能温室进行扦插和组织培养；并于2 0 2 0 年10 月收集种子，经不同处理后进行种子萌发试验。1.2方法1.2.1种子萌发试验前，将太行铁线莲种子在室温下用3 0%的过氧化氢溶液（H202）浸种消毒3 0min后,用蒸馏水冲洗3 5次后进行如下处理。(1)不同激素对种子萌发的影响。将消毒好的种子分别置于GA：（10、2 0、50、10 0、2 0 0 m g/L)和6-BA(10、2 0、50、10 0、2 0 0 m g/L)中2 4h。以蒸馏水浸种处理作为对照。处理完成的种子经蒸馏水冲洗3次后,播种至草炭：珍珠岩=3：1的基质中，每处理50 粒种子，重复3 次，下同。(2)不同水温浸种处理对种子萌发的影响。将消毒好的种子分别置于15、2 0、2 5、3 0、3 5不同水温梯度中 2 4 h。(3)不同贮藏方式对种子萌发的影响。将消毒好的种子分别置于常温、4冷藏、一2 0 冷冻中贮藏6 0 d，4层积沙藏和地窖层积沙藏中分别贮藏6 0 d和9 0 d。（4)指标测定。定期对种子的萌发情况进行观察、记录，以连续5d没有种子发芽作为发芽结束标志。计算种子发芽率、发芽势和发芽指数。发芽率=种子发芽数/供试种子数10 0%（1)发芽势=规定时间内种子发芽数/供试种子数100%(2)发芽指数=ZGt/Dt(3)式中：G,为在时间t日的发芽种子个数;D,为相应的发芽日数。1.2.2扦插繁殖以采集枝条的基部、中部及顶部作为插穗，将其剪至57 cm,并以保留1个节点、12 片叶子为宜，芽距上部平切口1cm，距下部斜切口45cm，剪取时注意切口平滑，后根据试验设计速蘸后进行扦插，扦插深度为插穗的1/2 2/3。(1)试验设计。试验以激素种类（A）、激素浓度(B)、插穗部位(C)和基质配比(D)为影响因素，每个因素设计3 个水平，构成4因素3 水平的L。（3*)正交试验设计，如表1所示，每处理2 5根插穗，并设置3次重复。第3 期编号No.A112131425262738393(2)指标测定。扦插6 0 d后对生根插穗进行移栽并统计生根插穗数、平均根长、平均根数、生根指数Q值及移栽6 0 d后插穗成活数。生根指数Q值=生根率X50%十平均根长25%+平均根数2 5%(4)1.2.3组织培养将天气晴朗时采回的太行铁线莲枝条进行修剪后，浸泡于洗洁精水中3 0 min，去掉表面杂尘后，用蒸馏水冲洗5次，洗净后备用。(1)外植体处理。将处理好的外植体置于7 5%酒精中灭菌10 s，无菌水冲洗3 4次后，再分别倒人0.1%HgCl2浸泡3、5、7、9min，期间可轻微摇晃使外植体与HgCl2充分接触，立即用无菌水冲洗57 次后接种于MS培养基内。每处理3 0 个外植体，重复3 次。3 0 d后统计污染率、出芽率和褐化率。(2)腋芽诱导萌发培养。以MS为基本培养基，附加不同梯度水平的6-BA（0.5、1.0、2.0 m g/L)和NAA(0.05、0.1、0.5m g/L)诱导腋芽萌发。每处理3 0 个外植体，重复3 次。3 0 d后统计并记录诱导率率及新芽的生长情况。Table 2 Germination characteristics of Clematis kirilowii seeds under different hormone treatments处理浓度/(mg L-1)TreatmentConcentration对照0赤霉素GA:1020郑妍，等.太行铁线莲的繁殖技术初探表1L，(3*)正交试验设计Table 1 L,(3t)Orthogonal experimental design因素与水平处理Factors and levelsTreatments激素浓度/插穗部位激素种类(mg L-1)BC112233122331132132347基质配比DArea ofHormone kindHormoneconcentration1IBA2IBA3IBA3NAA1NAA2NAA2IBA+NAA3IBA+NAA1IBA+NAA表2 不同激素处理下太行铁线莲种子的萌发特性发芽率/%发芽势/%Germination rateGermination energy20.002.31e18.671.76d44.001.15bc41.673.18b40.670.67cd38.002.31bcSubstrate ratecuttings0基部100中部200顶部0中部100顶部200基部0顶部100基部200中部(3)萌发芽的继代增殖培养。以MS为基本培养基，附加不同梯度水平的6-BA（1.0、2.0、3.0mg/L)、NA A(0.0 5、0.1、0.2 m g/L)和 KT(0.5、1.0、2.0 m g/L)进行萌发芽的继代增殖培养。每处理3 0 个不定芽，重复3 次。3 0 d后统计并记录增殖系数和不定芽生长情况。(4)生根培养。以1/2 MS为基本培养基，附加不同梯度水平的IBA(1.0、2.0、3.0 m g/L)和NAA(0.1、0.2、0.3 m g/L)诱导不定芽生根。每处理3 0株，重复3 次。统计并记录生根状况，统计生根率、平均根数、平均不定根根长和生根苗生长情况。1.2.4数据统计分析采用Excel软件整理原始数据，SPSS24.0软件统计数据并进行差异显著性分析、方差分析、极差分析和多重比较。2结果与分析2.1种子萌发2.1.1不同激素对种子萌发的影响理下太行铁线莲种子的萌发特性，见表2。发芽指数Germination index2.340.73de9.070.35a6.57 0.47b草炭：珍珠岩=1：1草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1河沙河沙草炭：珍珠岩=1：1草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1河沙草炭：珍珠岩=1：1不同激素处348处理Treatment细胞分裂素6-BA注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著（PCDBDCABDCBA349移栽成活率/%生根指数Q值TransplantingRooting index Qsurvival rate10.94e77.78a24.81bc23.33c22.62bcd47.62bc12.88de38.89bc19.71cde50.00bc16.84cde27.78c39.06a75.00a18.53cde24.44c29.27b61.11ab太行铁线莲扦插正指标平均根长/cm平均根数/条AverageAverageroot lengthroot number3.264.553.085.443.275.444.436.673.695.113.123.892.483.562.654.782.794.113.534.443.994.782.662.330.901.000.451.551.511.881.784.34生根指数Q值Rooting index Q19.4620.9615.4419.9716.4821.0222.3226.9028.9522.9127.1318.0112.471.9511.698.89ACDB移栽成活率/%Transplantingsurvival rate49.5863.8943.3362.9638.8932.5941.1142.0453.5245.5057.5436.9814.6331.3016.4325.98BDCA350由表6 可知，激素种类在生根率和生根指数Q值方面的影响占主导地位，主次水平均为：激素种类插穗部位 基质配比 激素浓度；对平均根长和平均根数而言，基质配比对其影响最大，插穗部位次之；激素浓度对移栽成活率的影响起主导作用。根据K1、K 2 和K3可得出获生根率最高的组合为A:BC.D2。但本试验中未设置该组合，由于激素浓度对于生根效果的影响最小,因此可以选取0 mg/LTable 7Effect of various sterilization time on stems with buds of Clematis kirilowi消毒时间/minDisinfection time3579由表7 可知，消毒时间的不同对太行铁线莲的污染率、出芽率和褐化率影响显著。随着消毒时间的增加，太行铁线莲的污染率呈下降趋势，褐化率呈上升趋势。消毒时间为3 min时污染率显著高于其他消毒时间，褐化率最低，分别为2 6.3 3%和9.69%。消毒时间为7 min时，出芽率较消毒时间为5min时差异不显著，出芽效果最好较消毒时间Table 8 Germination of axillary buds of Clematis kirilowi stems with buds under different hormone combinations6-BA/(mg L-1)编号Concentration ofNo.6-BA10.520.530.541.051.061.072.082.092.0注：生长非常好（十十十十十)；较好（十十十十)；一般（十十十)；差（十十）;非常差（十）。下同。通过试验发现，太行铁线莲的带芽茎段在添加不同浓度6-BA和NAA组合的MS培养基中培养8 d时，腋芽开始有不同程度的萌发。由表8 可知,在添加 1.0 mg/L6-BA 和0.0 5 mg/L的NAA的MS培养基中腋芽的诱导效果最好，诱导率最高，为8 0.3 0%。0.5mg/L和2.0 mg/L的林业与生态科学IBA+NAA替代2 0 0 mg/LIBA+NAA,即:太行铁线莲以插穗顶部蘸取清水后扦插在草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1上，可获得较高生根率，与本试验处理7 结果一致。2.3组织培养2.3.1外植体处理带芽茎段培养的影响，见表7。表7 不同消毒时间对太行铁线莲带芽茎段培养的影响污染率/%Contamination rate26.332.16a16.711.53b13.640.96b12.430.95b表8 不同激素组合下太行铁线莲带芽茎段腋芽萌发情况NAA/(mg L-1)长势Concentration ofGermination rateNAA0.050.100.500.050.100.500.050.100.50第3 8 卷不同消毒时间对太行铁线莲出芽率/%褐化率/%Budding rateBrowning rate63.981.15b9.691.19c67.321.94ab15.961.96b70.131.04a16.230.97b56.221.76c31.351.33a3min差异显著，为7 0.13%，且污染程度较轻。消毒时间为9min时，褐化程度最高为3 1.3 5%，显著高于消毒时间为7 min时。因此，以0.1%HgCl2消毒7 min时，太行铁线莲带芽茎段的出芽率最高，灭菌效果最好。2.3.2腋芽诱导萌发培养不同激素组合下太行铁线莲带芽茎段腋芽萌发情况，见表8。诱导率/%生长速度GrowthGrowth speed47.686.80cd+43.584.39cde+27.104.07e+80.306.02a+66.667.43ab+53.524.34bcd+73.584.18a+61.974.74abc+35.595.91de+6-BA与0.5mg/L的NAA组合时,诱导率较低，分别为2 7.10%和3 5.59%，显著低于其他组合。培养基在添加1.0 mg/L和2.0 mg/L的6-BA时，带芽茎段所诱导出的新芽长势较0.5mg/L时旺盛，较高浓度的NAA对出芽产生抑制作用。综上所述，最适合太行铁线莲带芽茎段腋芽诱导的培养为：叶色Colour较快嫩绿中等绿慢绿快浓绿快浓绿中等绿中等绿较快嫩绿慢黄第3 期MS+1.0mg/L6-BA+0.05 mg/LNAA,此时诱导率最高，且新芽长势好，生长速度快，叶色浓绿。Table 9 Proliferation of axillary buds of Clematis kirilowii under different hormone combinations6-BA/(mg L-1)编号No.Concentration of6-BAZ11.0Z21.0Z31.0Z42.0Z52.0Z62.0Z73.0Z83.0Z93.0由表9可知，将太行铁线莲单个腋芽接种于MS培养基中,不同浓度配比的6-BA、NA A 和KT对不定芽的增殖效果存在差异。各处理均能促进不定芽增殖，以MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA十1.0 mg/LKT的增殖效果最佳，增殖系数最高，为3.3 1，显著高于其他处理，且不定芽生长状Table 10Duncan test on three concentration levels of 6-BA,NAA and KT of Clematis kirilowii激素种类Types of hormones6-BANAAKT郑妍，等.太行铁线莲的繁殖技术初探2.3.3不定芽增殖不定芽增殖情况，见表9。表9不同激素组合下太行铁线莲不定芽增殖情况NAA/(mg L-1)KT/(mg L-I)Concentration of Concentration ofNAA0.050.100.200.050.100.200.050.100.20表10 太行铁线莲6-BA、NA A 和KT浓度水平Duncan检验激素浓度/(mg L-1)Concentration of hormone1.002.003.000.050.100.200.501.002.00351不同激素组合下太行铁线莲增殖系数不定芽生长情况MultiplicationGrowth statusKTcoefficient0.51.940.20bc1.01.780.19ab2.01.390.22c1.03.310.32a2.02.360.17ab0.51.420.21c2.02.470.22bc0.52.640.17ab1.01.330.10c态较好，生长速度快，叶片为绿色。Z5、Z7 和Z8的增殖系数均在2.0 以上，植株生长状况良好。MS十3.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/LKT的增殖效果最差，增殖系数仅为1.3 3，不定芽长势差。不同激素组合下太行铁线莲不定芽增殖系数极差分析，见表10。平均值Average1.702.362.152.572.261.382.002.142.07生长速度较快，不定芽细，叶片绿色(+)生长速度一般，不定芽较粗，叶片绿色(+)生长速度快，不定芽较粗，叶片浓绿(+)生长速度快，不定芽粗，叶片绿色(+)生长速度较快，不定芽较粗，叶片嫩绿(+）生长速度较快，不定芽细，叶片黄绿(+)生长速度快，不定芽细，叶片黄绿(+)生长速度较快，不定芽粗，叶片浓绿(+)生长速度一般，不定芽细，叶片绿色(+)0.05水平Level in 0.05baabaabaaa0.01水平Level in 0.01BAABAABAAA352由表10 可知，6-BA浓度为2.0 mg/L时增殖系数最高，为2.3 6，与1.0 mg/L6-BA有极显著差异。高浓度NAA不利于太行铁线莲不定芽的增殖，极显著低于其他浓度水平，以0.0 5mg/LNAA增殖效果最佳。各浓度KT均无显著作用，以1.0mg/LKT的增殖系数最高，为2.14。根据多重比较得出的最优水平组合为：2.0 mg/L6-BA、0.0 5mg/LNAA和1.0 mg/LKT。综上所述,MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+1.0mg/LKT的培养基最适宜太行铁线莲的不定芽增殖。3讨论与结论3.1讨论种子自身原因所导致的休眠是影响其萌发的主要原因，对于不同特性的种子，人工打破种子休眠的方式不同，常见的有刻伤种皮、热水浸种、化学药剂腐蚀种皮、层积处理和激素处理等 5-6 。烟草种子以过氧化氢作引发液，增加了种皮透性，还促进了GA：的传号信导，提高了引发效果，促进了生长调节剂和营养物质的吸收7。本试验结果表明，太行铁线莲对于过氧化氢与GA3的增效作用不显著。温水浸种可起到与激素相似的促进作用，与层积沙藏均可软化种皮，加速种子内部新陈代谢，促进生长所需物质的合成，茶树种子以4冷藏法和湿沙埋藏法为最佳贮藏办法 8-10 。本研究发现，温水浸种和层积沙藏均可在一定程度上打破太行铁线莲种子休眠，但发芽率低于激素处理。较低浓度的GA：更有利于促进萌发，但6-BA相较于GA3对太行铁线莲种子萌发的促进作用显著，这一观点与粉绿铁线莲和大叶铁线莲认为GA3更能促进铁线莲种子萌发的观点不同，还需根据其生根机制对不同激素的响应进行研究 11-12 。植物自身的特性导致了扦插结果有一定的差异性，但在一定的有效浓度内,IBA和NAA均可提高部分藤本植物的扦插成活率 13 。李林芳认为不同种类的铁线莲因生理特性差异对不同外源激素的响应程度也不同 14。不同基质或不同配比都会产生不同的理化性质从而影响植物扦插成活率，甚至基质在扦插中的作用有时会高于激素处理，阮丽丽和刘冰等研究表明通气、保水保湿、排水良好的基质对林业与生态科学于铁线莲扦插生根也有重大影响 15-16 。本试验通过主次效应分析可知，激素种类在生根率和生根指数Q值方面的影响占主导地位，主次水平均为：激素种类 插穗部位 基质配比 激素浓度。因此，基质配比对于太行铁线莲的扦插生根有重要作用，但不如激素种类和插穗部位作用显著，这与林茂认为基质相较于IBA浓度和NAA浓度2 个因素，对蒜香藤的生根率影响更大，观点不符 17 。组织培养作为一种较为理想的繁殖方式，材料来自单一的个体，可以解决播种、扦插等繁殖成活率低且繁殖系数小的问题，实现工厂化生产 18 。HgCl2既达到一定的消毒效果，又不损伤外植体，常与7 5%酒精组合以达到最佳消毒效果 19-2 0 。MS培养基是多数铁线莲腋芽诱导和增殖培养的最佳培养基，同时植物生长调节剂的种类及浓度配比是影响外植体的形态建成的关键 2 1。太行铁线莲的诱导率随着6-BA浓度水平的增加，诱导率呈先上升后下降的趋势，以1.0 mg/L6-BA时为最高，且随着NAA浓度的增加而降低。说明较高浓度的6-BA和NAA均会抑制太行铁线莲的出芽，这一点与成璐的观点一致 2 1。在继代增殖过程中添加适当浓度的KT不仅促进细胞分裂的作用，还可以诱导芽的分化和发育，但KT对太行铁线莲不定芽增殖的作用不大，未能起到促进不定芽增殖的效果 2 2 。3.2结论本研究表明，以播种、扦插的方式繁殖太行铁线莲均获得成功，为其在生产实践中提供了最佳的繁殖方式。太行铁线莲种子不易萌发，不同处理下的种子萌发效果差异显著，激素处理和不同水温浸种处理较贮藏方式处理的促进作用明显，当GA3浓度范围在10 2 0 mg/L，6-BA 浓度范围在10 10 0mg/L时，对打破太行铁线莲种子休眠作用显著。其中,以50 mg/L6-BA和10 0 mg/L6-BA处理后发芽率均在50.0 0%以上。水温过高会破坏胚的活性，对于太行铁线莲种子，15浸种2 4h获得的发芽率、发芽势和发芽指数显著高于其他温度处理，分别为50.0 0%、54.6 7%和3.7 1。常温贮藏和一2 0贮藏过程中抑制了种子的呼吸作用，促使营养物质消耗的增加，使其发芽率和发芽势低于对照组，发芽率分别为15.6 4%和11.3 3%。扦插繁殖的数量第3 8 卷第3 期往往受到限制，影响其生根率和生根指数Q值的主次水平顺序为：激素种类 插穗部位 基质配比激素浓度，通过0 mg/LIBA+NAA+顶部+草炭：珍珠岩：蛭石=1：1：1的扦插组合，生根率可达7 4.0 8%，显著高于其他处理，可应用于生产实践中进行园林应用推广。太行铁线莲的带芽茎段在MS培养基上可获较高的诱导率和增殖系数，出芽时间短，添加0.2、0.5mg/LNAA溶液对其腋芽萌发和增殖产生的抑制作用高于0.0 5、0.1mg/LNAA，说明较低浓度的NAA溶液对其腋芽生长过程中具有促进作用，即经过0.1%HgCl消毒7min培养于MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA，腋芽诱导的效果最佳，诱导率最高，后培养于MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+1.0mg/LKT,可获得较多不定芽，为建立其组织培养体系提供了科学依据。参考文献：1徐凌川，张永清，孙法丽.太行铁线莲资源调查及其药用价值J.中国野生植物资源，19 9 6 15（3）：17-2 0.2 章银柯，江燕.我国铁线莲属植物研究现状及其园林应用 J.北方园艺，2 0 0 7(3）：12 2-12 4.3 曹冰.铁线莲属植物的研究现状及园林应用 J.中国林副特产，2021(2):3739.4 高群英.河北省野生花卉资源的研究及园林应用 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