舒筋活血胶囊通过JAK2_STAT3通路缓解大鼠膝骨关节炎的机制研究.pdf

天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期舒筋活血胶囊通过JAK2/STAT3通路缓解大鼠膝骨关节炎的机制研究李宏军1，钱亮2，邓新超2，余庭2，吴岩2，吴红丽2摘要：目的探讨舒筋活血胶囊调控酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）信号通路对大鼠膝骨关节炎（KOA）的影响及其机制。方法采用Hulth法制备大鼠KOA模型，将60只大鼠分为假手术组（Sham组）、KOA 组、舒筋活血胶囊组（SJHX 组）（472.5 mg/kg 舒筋活血胶囊灌胃）、AG490 组（5.0 mg/kg 的 JAK2 抑制剂AG490腹腔注射），每组15只。HE染色与番红O-固绿染色观察滑膜组织与软骨组织病理变化，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清白细胞介素（IL）-10、IL-1、肿瘤坏死因子（TNF-）水平，免疫荧光法检测M1/M2型巨噬细胞极化，免疫组化染色检测IL-1、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、基质金属蛋白酶（MMP）-13蛋白表达，Western blot检测JAK2/STAT3通路相关蛋白。结果与Sham组比较，KOA组大鼠关节面不平整，滑膜组织与软骨组织结构破坏，病理评分增加，血清IL-1、TNF-水平明显升高，IL-10水平降低，滑膜组织IL-1、iNOS、MMP-13、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平及M1、M2型巨噬细胞、M1/M2比值升高（P0.05）；与KOA组比较，SJHX组与AG490组大鼠滑膜组织与软骨组织病理损伤减轻，病理评分降低，血清IL-1、TNF-水平降低，IL-10水平升高，滑膜组织IL-1、iNOS、MMP-13、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平及M1巨噬细胞、M1/M2比值降低（P0.05）。结论舒筋活血胶囊可通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活，调节M1/M2巨噬细胞极化，改善KOA大鼠滑膜炎症状。关键词：骨关节炎，膝；活血舒筋；巨噬细胞；Janus激酶2；STAT3转录因子；舒筋活血胶囊中图分类号：R684.3文献标志码：ADOI：10.11958/20221924Mechanism of Shujin Huoxue Capsule in relieving knee osteoarthritis inrats through JAK2/STAT3 pathwayLI Hongjun1,QIAN Liang2,DENG Xinchao2,YU Ting2,WU Yan2,WU Hongli21 Department of Wound Repair and Peripheral Vascular Disease,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430030,China;2 Department of Orthopedics,the Eighth Hospital of WuhanAbstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Shujin Huoxue Capsule on knee osteoarthritis(KOA)in rats by regulating tyrosine protein kinase 2(JAK2)/signal transduction and transcription-activating protein 3(STAT3)signaling pathway.MethodsThe Hulth method was used to prepare rat KOA model.Sixty rats were divided into the Shamgroup,the KOA group,the Shujin Huoxue Capsule(SJHX)group(472.5 mg/kg Shujin Huoxue Capsule gavage)and theAG490 group(5.0 mg/kg JAK2 inhibitor AG490 intraperitoneally)with 15 rats in each group.The pathological changes ofsynovial tissue and cartilage tissue were observed by HE staining and Safranin O-fast green staining.Serum levels ofinterleukin-10(IL-10),IL-1b and tumor necrosis factor-a(TNF-a)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).M1/M2 macrophage polarization was detected by immunofluorescence assay.The expression levels of IL-1,inducible nitric oxide synthase(iNOS)and matrix metalloproteinase 13(MMP-13)were detected by immunohistochemicalstaining.JAK2/STAT3 pathway related proteins were detected by Western blot assay.ResultsCompared with the Shamgroup,the articular surface was uneven in rats of the KOA group.The synovial tissue and cartilage tissue were destroyed,pathological scores were increased.Serum levels of IL-1 and TNF-were obviously increased,and the level of IL-10 wasobviously reduced.Expression levels of IL-1,iNOS,MMP-13,p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 in synovial tissue,andthe proportions of M1,M2 macrophages and M1/M2 were obviously increased(P0.05).Compared with the KOA group,thepathological damage of synovial tissue and cartilage tissue was reduced in the SJHX group and the AG490 group.Pathological scores were reduced.Serum levels of IL-1 and TNF-were obviously reduced,and the level of IL-10 wasobviously increased.Expression levels of IL-1,iNOS,MMP-13,p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3 in synovial tissue,andthe proportions of M1,M2 macrophages and M1/M2 were obviously reduced(P0.05).ConclusionShujin HuoxueCapsule can improve the symptoms of synovitis in KOA rats by inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signaling pathwayand regulating the polarization of M1/M2 macrophages.基金项目：武汉市卫生和计划生育委员会科研项目（WZ17Q11）作者单位：1武汉市第一医院创面修复与周围血管病科（邮编430030）；2武汉市第八医院骨科作者简介：李宏军（1981），男，副主任医师，主要从事膝骨关节病防治方面研究。E-mail：实验研究961Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是常见的慢性关节炎，主要表现为关节滑膜炎症、软骨丢失、软骨下骨改变等特征1。先天免疫在KOA的进展中发挥重要作用，巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，在不同模式刺激下可极化为不同的表型，M1型巨噬细胞促进炎性因子分泌，加重炎症反应，M2型巨噬细胞诱导生长因子，具有抗炎和促进组织修复作用，巨噬细胞极化与 KOA 的发生发展密切相关1-2。研究发现，酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）信号通路参与调控巨噬细胞极化3。JAK2/STAT3信号通路还参与软骨破坏的过程，抑制JAK2/STAT3通路的激活可降低炎症反应，改善佐剂性关节炎的软骨损伤4。舒筋活血胶囊由红花、狗脊、槲寄生等中药组成，具有舒筋活络，活血散瘀的功效，在临床上用于治疗KOA、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等5-6。舒筋活血胶囊对KOA巨噬细胞极化的影响及作用机制尚不清楚，本研究旨在探索舒筋活血胶囊对KOA巨噬细胞极化的影响及可能的作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1动物与药物SD雄性大鼠60只，SPF级，67周龄，200230 g，购自广东至远生物医药科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（粤）2021-0057，适应性饲养1周后开始实验。舒筋活血胶囊（0.35 g，国药准字Z20050630）购自湖南德康制药股份有限公司。1.1.2主要试剂与仪器JAK2抑制剂AG490购自碧云天生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、番红O-固绿软骨染色液购自上海源叶生物科技有限公司；兔抗鼠CD68、CD206、F4/80 一抗、Alexa Fluor488 标记与 AlexaFluor647标记的羊抗兔IgG二抗购自Abcam公司；大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-、白细胞介素（IL）-1、IL-10酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗鼠IL-1、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）一抗购自Santa Cruz 公司；兔抗鼠基质金属蛋白酶（MMP）-13、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、-actin一抗及HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自索莱宝生物科技有限公司。垂直电泳系统购自 Bio-rad 公司，共聚焦显微镜及正置显微镜购自日本Olympus 公司，Varioskan LUX 多功能酶标仪购自 ThermoFisher Scientific公司。1.2研究方法1.2.1实验动物分组及模型制备按照随机数字表法将大鼠分为假手术组（Sham组）、KOA组、舒筋活血胶囊组（SJHX组）、JAK2 抑制剂组（AG490 组），每组 15 只。采用 Hulth法7-8制备KOA模型，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，选取右膝关节，打开关节腔，切断内侧半月板前角以及前交叉和内侧副韧带，再切除内侧半月板。Sham组打开关节腔后不做处理，再缝合关节囊及皮肤，术后给予大鼠40万U青霉素臀大肌注射3 d，术后自由活动，6周后造模结束。实验药物剂量根据人与大鼠体表面积换算来确定，造模结束后，SJHX组大鼠给予472.5 mg/（kgd）舒筋活血胶囊，灌胃给药，每日 1 次，AG490 组使用 5.0 mg/kg 的 JAK2 抑制剂AG490腹腔注射，Sham组与KOA组大鼠给予等量的生理盐水，每日1次，连续给药8周。1.2.2标本采集末次给药24 h，摘眼球取血后，3 000g离心15 min，取血清，-80 保存。每组随机（抽签法）抽取5只大鼠，剥离右侧膝关节滑膜及软骨组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。另外10只大鼠取滑膜组织，-80 保存。1.2.3滑膜组织与软骨组织病理学观察将石蜡膜包埋的组织与软骨组织切片，经脱蜡水化后，分别采用HE染色与番红O-固绿染色，观察滑膜组织与软骨组织病理变化，并进行Krenn滑膜炎评分与Mankin评分。1.2.4血清IL-10、IL-1、TNF-水平检测根据试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清IL-10、IL-1、TNF-水平。1.2.5滑膜组织免疫荧光染色取大鼠滑膜组织冰冻切片，使用 0.3%PBST 透化后分别加入 CD68（1 100）、CD206（1 500）、F4/80（1 500）一抗孵育，再加入荧光标记的IgG二抗（1 1 000），孵育，DAPI复染细胞核，共聚焦显微镜下拍照，计算CD68+（M1）、CD206+（M2）占F4/80+（M0）细胞比例数，并根据各组细胞比例数，计算M1/M2比值。1.2.6免疫组化染色检测IL-1、iNOS以及MMP-13蛋白表达滑膜组织切片经脱蜡及抗原修复后，分别加入IL-1、iNOS、MMP-13抗体稀释液（1 1 000稀释），再加入二抗（1 1 500稀释）室温孵育1 h，PBS洗涤后DAB显色，苏木素复染，IL-1、iNOS、MMP-13 蛋白阳性表达为棕黄色颗粒，采用Image J软件分析，计算积分光密度，对IL-1、iNOS、MMP-13蛋白表达定量分析。1.2.7Western blot检测蛋白表达取大鼠滑膜组织，加入液氮研磨后，加入RIPA裂解液离心提取总蛋白。经定量分析后，取30 g蛋白煮沸变性，进行SDS-PAGE电泳并转膜，封闭后分别加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3（均1 1 000稀释）及-actin（1 1 500稀释）一抗，4 孵育过夜，加入二抗（1 2 000）37 孵育1 h，ECL显色后，以-actin为内参，采用Imge J软件分析蛋白相对表达。1.3统计学方法采用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据用xs表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠滑膜组织HE染色结果Sham组大Key words:osteoarthritis,knee;activating blood and relaxing muscle tendon;macrophages;Janus kinase 2;STAT3transcription factor;Shujin Huoxue Capsule962天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期鼠滑膜和软骨组织结构正常，滑膜细胞排列整齐，软骨表面光滑，KOA组大鼠关节表面不平整，滑膜增生肥厚，细胞形态不规则，局部炎性浸润明显，Krenn评分较Sham组增加（P0.05）；SJHX组与AG490组大鼠滑膜厚度减少，炎性浸润减轻，Krenn 评分较KOA组降低（P0.05）；见图1、表1。2.2各组大鼠软骨组织番红 O-固绿染色结果比较Sham组可见正常软骨组织被染成红色，结构规则，关节面正常，软骨下骨为绿色；KOA组关节面不平整，见明显的结构破坏和关节间隙狭窄，Mankin评分较Sham组升高（P0.05）；SJHX组与AG490组软骨损伤明显改善，Mankin评分较KOA组下降（P0.05）；见图2、表1。2.3各组大鼠血清 IL-10、IL-1、TNF-水平比较与Sham组比较，KOA组大鼠血清IL-1、TNF-水平升高，IL-10水平降低（P0.05）；与KOA组比较，SJHX 组、AG490 组血清 IL-1、TNF-水平降低，IL-10水平升高（P0.05），见表2。2.4各组大鼠滑膜组织IL-1、iNOS、MMP-13蛋白表达比较与Sham组比较，KOA组大鼠滑膜组织中阳性颗粒增多，IL-1、iNOS、MMP-13 表达水平增加；与KOA组比较，SJHX组、AG490组大鼠滑膜组织阳性颗粒减少，IL-1、iNOS、MMP-13表达水平降低；见图3、表3。2.5各组大鼠滑膜组织免疫荧光染色结果F4/80+为未分化巨噬细胞 M0，CD68+、CD206+分别为 M1、M2型巨噬细胞。与Sham组比较，KOA组M1、M2型巨噬细胞及M1/M2比值升高（P0.05）；与KOA组比较，SJHX组、AG490组的M1型巨噬细胞及M1/M2比值降低（P0.05），M2 差异无统计学意义（P0.05）；见图4、5，表4。2.6各组大鼠 JAK2/STAT3 通路相关蛋白表达比较KOA组大鼠滑膜组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值高于Sham组（P0.05）；与KOA组比较，SJHX组、AG490组大鼠滑膜组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P0.05）；见图6、表5。3讨论滑膜炎是KOA的病理表现之一，滑膜炎的炎症反应与KOA的严重程度密切相关，高发病率、高致残率是KOA的特点，目前尚缺乏有效的治疗方法9。中医学认为KOA属“痹证”、“骨痹”范畴，以肝Sham组KOA组SJHX组AG490组Fig.1Pathological changes of synovium detected by HE staining ineach group(200)图1HE染色检测各组大鼠滑膜组织病理变化（200）SJHX组AG490组Sham组KOA组Fig.2Pathological changes of cartilage tissue of rats detected bysafranine O-solid green staining(200)图2番红O-固绿染色检测各组大鼠软骨组织病理变化（200）组别Sham组KOA组SJHX组AG490组FKrenn评分0.000.004.601.20a2.400.60ab2.600.80ab29.071Mankin评分0.000.005.801.65a3.601.00ab3.401.15ab22.729Tab.1Comparison of Krenn score and Mankin scorebetween the four groups of rats表1各组大鼠Krenn评分与Mankin评分比较P0.01；a与Sham组比较，b与KOA组比较，P0.05。（n=5，分，xs）组别Sham组KOA组SJHX组AG490组FIL-10/（g/L）23.564.5111.342.33a18.354.74ab20.124.63b22.797IL-1/（ng/L）12.265.3685.427.41a47.466.15ab48.435.63ab349.636TNF-/（g/L）16.154.3139.545.75a20.364.82b22.475.23ab62.044Tab.2Comparison of serum levels of IL-10,IL-1 andTNF-between the four groups表2各组大鼠血清IL-10、IL-1、TNF-水平比较（n=15，xs）P0.01；a与Sham组比较，b与KOA组比较，P0.05。963Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9Sham组KOA组SJHX组AG490组Fig.3Expression of IL-1,iNOS and MMP-13 in synovial tissue of rats detected by immunohistochemistry(200)图3免疫组化检测大鼠滑膜组织IL-1、iNOS、MMP-13蛋白表达（200）IL-1iNOSMMP-13CD68+红色DAPI蓝色F4/80+绿色MergeSham组KOA组SJHX组AG490组Fig.4Immunofluorescence staining of synovial tissue F4/80+/CD68+in each group(400)图4各组大鼠滑膜组织F4/80+/CD68+免疫荧光染色（400）964天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期CD206+红色DAPI蓝色F4/80+绿色MergeSham组KOA组SJHX组AG490组Fig.5Immunofluorescence staining of synovial tissue F4/80+/CD206+in each group(400)图5各组大鼠滑膜组织F4/80+/CD206+免疫荧光染色（400）p-JAK2JAK2p-STAT3STAT3-actinABCDA：Sham组；B：KOA组；C：SJHX组；D：AG490组。Fig.6Western blot detection of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3protein expression in each group图6Western blot检测各组p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达组别Sham组KOA组SJHX组AG490组Fp-JAK2/JAK20.320.040.810.10a0.510.06ab0.530.05ab46.055p-STAT3/STAT30.190.040.650.08a0.370.05ab0.350.04ab60.386Tab.5Comparison of protein expression levels of p-JAK2,JAK2,p-STAT3 and STAT3 in synovium ofrats between the four groups表5各组大鼠滑膜组织p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达比较（n=5，xs）P0.01；a与Sham组比较，b与KOA组比较，P0.05。组别Sham组KOA组SJHX组AG490组FIL-10.210.050.860.11a0.450.08ab0.470.09ab49.731iNOS0.330.060.760.12a0.520.10b0.550.11b15.461MMP-130.150.040.930.15a0.370.07ab0.350.05b71.280Tab.3Expression levels of IL-1,iNOS and MMP-13 insynovial tissue of rats in each group表3各组大鼠滑膜组织IL-1、iNOS、MMP-13蛋白表达（n=5，xs）P0.01；a与Sham组比较，b与KOA组比较，P0.05。组别Sham组KOA组SJHX组AG490组FM1/%5.461.1520.553.34a12.452.78ab13.262.85ab26.876M2/%6.121.329.241.85a7.521.598.751.623.768M1/M21.010.322.460.65a1.570.43b1.450.42b8.343Tab.4Comparison of the proportion of M1 and M2 insynovial membrane of rats between the four groups表4各组大鼠滑膜M1、M2型巨噬细胞比例比较（n=5，xs）P0.05，P0.01；a与Sham组比较，b与KOA组比较，P0.05。965Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9肾亏虚、气血不足为本，以风寒湿邪内蕴、瘀血阻络为标，中医采用活血化瘀、清热止痛等药物进行治疗10-11。本研究结果显示，使用舒筋活血胶囊治疗后，KOA模型大鼠滑膜与软骨病理损伤减轻，炎症减轻，表明舒筋活血胶囊具有改善KOA的作用。舒筋活血胶囊由红花、槲寄生、狗脊、泽兰叶、鸡血藤等多味中药组成，红花可活血通经，散瘀止痛，狗脊与槲寄生具有补肝肾、除风湿、强筋骨的作用，泽兰叶与鸡血藤具有活血通络、舒筋活血的功效，络石藤与伸筋草具有袪风通络的功效，香附具有疏肝理气、和中止痛的功效，诸药合用具有舒筋活络，活血散瘀之功效。巨噬细胞是具有高度异质性的免疫细胞，受组织微环境与病理条件的影响，可极化为M1型与M2型，M1/M2 失衡在 KOA 的发生发展中发挥重要作用。M1型巨噬细胞可分泌TNF-、IL-1、IL-6等促炎因子，影响软骨细胞合成、软骨细胞分解代谢，抑制软骨形成，促进关节炎（OA）的发生或进展。M2型巨噬细胞可产生IL-10、转化生长因子（TGF）-等抗炎因子，参与抗炎反应，有利于组织修复、伤口愈合等，可抑制或延缓OA的进展12。因此，促进巨噬细胞 M1 型向 M2 型转化是治疗 OA 的一个新方向。有研究报道，一些中药可通过调节巨噬细胞极化缓解OA13。在KOA的发生发展过程中，关节损伤可引发滑膜毛细血管通透性增加，引发关节炎症反应。在KOA大鼠中，外周血或关节液中炎性因子如TNF-、IL-6等水平增加14。关节损伤的炎症反应或老化应激激活滑膜巨噬细胞15。M1型巨噬细胞诱导活化后，可表达CD86、INOS等基因，分泌IL-1、TNF-等细胞因子，加重炎症反应，IL-1可诱导MMP-13合成，是OA软骨蜕变的关键因子，M2活化后表达胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和CD206，分泌IL-10等抗炎因子，加速炎症消退，促进血管生成16。研究显示，穿山龙总皂苷可通过调控M1/M2型巨噬细胞极化，抑制炎症反应，改善痛风性关节炎17。本研究使用舒筋活血胶囊治疗后，KOA模型大鼠血清IL-1、TNF-水平降低，IL-10水平升高，M1型巨噬细胞及M1/M2比值明显降低，提示舒筋活血胶囊通过降低M1型巨噬细胞比例，改善M1/M2失衡，抑制炎症反应，改善KOA滑膜炎症状。JAK2/STAT3信号通路在参与炎症反应、氧化应激、细胞生长与凋亡等多种生理过程中发挥重要调控作用18-19。OA中TNF-、IL-1等炎性因子可激活JAK2/STAT3信号通路，促进OA的发生发展，抑制JAK2/STAT3通路激活，可调节软骨细胞代谢与凋亡20。张艳玲等21研究表明，温针灸可通过抑制JAK2、STAT3 磷酸化及 MMP-9 蛋白表达，抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，降低促炎因子分泌，减轻KOA兔软骨损伤。本研究结果显示，舒筋活血胶囊治疗KOA大鼠后，滑膜组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平明显降低，提示舒筋活血胶囊可抑制JAK2/STAT3信号通路激活。此外，使用JAK2抑制剂AG490可明显改善KOA大鼠滑膜与软骨病理损伤，舒筋活血胶囊与AG490的作用结果类似。以上结果表明，舒筋活血胶囊可抑制 JAK2/STAT3信号通路激活，调节M1/M2型巨噬细胞极化，改善KOA大鼠滑膜炎症状。本研究还存在一定不足，未检测滑膜液炎性因子水平，仅检测滑膜组织相关蛋白表达，对于滑膜组织巨噬细胞检测仅使用免疫荧光检测，未进行流式细胞仪分析，故结果可能存在一定偏倚。舒筋活血胶囊对KOA的具体作用机制仍需做更深入的研究。参考文献1 CURRY Z 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