漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究.pdf

研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0038漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究王慧,孟尧,张巧玲,窦婷婷,余海萍,SHADRICK,陈思瑶,孙芳利*(浙江农林大学化学与材料工程学院，杭州311300)摘 要：以天然抗菌剂百里酚为竹材防霉剂，利用漆酶催化氧化功能将百里酚固定于竹材中，分别研究处理竹材对黑曲霉 Aspergillus niger、绿木霉 Trichoderma virens和桔青霉 Penicilliumcitrinum 3 种霉菌的防治性能，并从百里酚的挥发率、流失处理后竹材的防霉性、处理前后竹材的接触角变化来评价漆酶催化固定效果，通过扫描电子显微镜(SEM)研究处理前后竹材的微观形貌变化，进一步采用红外光谱(FT-IR)和 X 射线光电子能谱仪(XPS)研究改性处理后竹材表面化学键的变化。结果表明：相比于百里酚单独处理竹材，漆酶催化百里酚处理竹材在流失前后对黑曲霉、桔青霉和绿木霉均具有良好的防治效果，防霉效力在 80%以上；流失处理后处理竹材的防霉性能仍优于百里酚单独处理组，证明经过漆酶改性处理，百里酚被固定在竹材中。经过漆酶催化处理以后，百里酚的挥发率从 17.03%降低到 6.75%。表面接触角测定结果显示，处理后竹材的表面疏水性得到明显改善，水滴的接触角从 35提高到 97，有助于提升竹材的防霉性。漆酶催化处理过程并没有明显改变竹材的微观形貌，只在竹材细胞壁表面出现了大量片状物质，推测其为接枝到竹材细胞壁表面的百里酚。FT-IR 和 XPS 等分析结果表明，百里酚是通过漆酶的催化作用与竹材木质素发生化学反应生成新的化学键而固定在竹材中的。本研究通过漆酶的催化作用，实现了天然抗菌剂的绿色固着，降低其挥发和流失，增强了处理竹材的防霉性能。该研究结果为竹材的绿色防霉技术提供了新思路，可实现对竹材的安全、长效保护。关键词:漆酶；催化固定；竹材；百里酚；防霉性能中图分类号：S781.9文献标志码：AStudy on anti-leaching and mildew resistance of bamboo treated withimmobilized thymol catalyzed by laccaseWANGHui,MENGYao,ZHANGQiaoling,DOUTingting,YUHaiping,SHADRICK,CHENSiyao,SUNFangli*(School of Chemical and Material Engineering,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,China)收稿日期：2022-11-23；录用日期：2023-04-17；网络首发日期：2023-05-10.Received:November23,2022;Accepted:April17,2023;Published online:May10,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0038http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail:Abstract:Inthispaper,thenaturalantibacterialagentthymolwasusedasamildewinhibitorforbamboo,whichwasimmobilizedinbamboobylaccase.ThemildewresistanceofthetreatedbambooagainstAspergillus niger,Trichoderma virensandPenicillium citrinumwastested,respectively.Thelaccase-catalyzedfixationeffectwasevaluatedbyvolatilityofthymol,themildewresistanceafterleachingtreatmentandthechangesofwatercontactangle.Scanningelectronmicroscopy(SEM)wasusedtostudythemicro-morphologyofthetreatedbamboo,andfurtherFouriertransforminfraredspectroscopy(FT-IR)andX-rayphotoelectronspectroscopy(XPS)wereemployedtoexplorethechemicalbondchangesduringthelaccase-catalyzedprocess.Theresultsshowthat,comparedwiththebambootreatedbythymolalone,thebambootreatedbylaccasecatalysisexhibitedagoodinhibitoryeffectonA.niger,T.virensandP.citrinumbeforeandaftertheleachingtreatment,themildew-proofefficiencywasabove80%,andthemildew-proofperformanceofthebambootreatedbothwiththymolandlaccaseaftertheleachingtreatmentwasbetterthanthattreatedwiththymolalone.Thevolatilityofthymolwassignificantlyreducedfrom17.03%to6.75%.Thewatercontactangleincreasesignificantlyfrom35to97,whichwascontributingtothemildewresistanceoftreatedbamboo.Theenzymaticimmobilizationdidnotsignificantlychangethemicro-morphologyofbamboo,butalargenumberofflakysubstancesappearedonthesurfaceofbamboocellwall,whichwasconsideredasaggregatesofthymolmoleculesgraftedontothesurfaceofbamboo.TheFT-IRandXPSresultsshownnewformedchemicalbondsbetweenthymolandbambooligninwerethekeyfactorforimmobilizationofthymol.Thisstudyrealizedthegreenfixationofnaturalantibacterialagentthroughthecatalysisoflaccase,reducingitsvolatilizationandleaching,andthemildewresistanceoftreatedbamboowasprolonged.Theresultsofthisstudyprovideanewideaforgreenmildewpreventionofbamboo,whichcanachievesafeandlong-lastingprotectionofbamboo.Keywords:laccase;catalyzedfixation;bamboo;thymol;mildewresistance 0 引言我国是世界上竹类资源最为丰富、开发利用竹资源最早的国家，竹材广泛地应用于人们生活当中。2018 年，我国竹产品出口贸易额超过 21 亿美元，其中竹制餐具、竹制日用品等和与食品和人体密切接触的竹产品占比超过 50%1。随着世界范围内“禁塑令”的颁布，“以竹代塑”是解决“塑料污染”问题的自然解决方案2。然而竹材中含有丰富的淀粉、糖类和蛋白质等物质，极易受到霉菌侵染，在使用和运输过程中易发生霉变，从而限制了竹材的应用3-4。常规竹材的防霉药剂主要以工业防霉剂为主，如 IPBC(3-碘代-2-炔丙基丁基氨基甲酸酯)、DCOIT(4,5-二氯-2-N-辛基-4-异噻唑啉-3-酮)和百菌清等5-6。这些杀菌剂虽然防霉效果好，但由于毒性较大或易致敏等原因，不适用于食品接触和与人体密切接触的竹产品中7。随着人们对环境保护和自身安全意识的提高，天然抗菌剂被广泛地关注和研究，主要应用在食品、药品、农药及木竹材保护等领域8。源于植物精油的酚类物质能够抑制多种真菌的生长，如百里酚9-10。同时，百里酚相继被各国食品药品监督管理局认定为安全的食品、药品添加剂11-12，是食品接触和与人体密切接触类竹材防霉剂较好的选择。虽然百里酚作为竹材防霉剂绿色且安全，但存在因易流失和挥发而导致的时效性较差等问题。近年来，研究人员采用抗菌剂复配、包覆和化学改性等方法，降低天然抗菌剂的流失13。如果能在天然抗菌剂与竹材中的主要成分间建立牢固的化学连接，则能有效解决其易挥发和流失的问题，提高天然抗菌剂对竹材的保护时效性。真菌漆酶是一类多酚氧化酶，其底物广泛，能够直接将酚类、苯胺类和天然大分子木质素等底物催化氧化，副产物只有水14。漆酶对木质纤维的催化作用已被广泛用于制浆造纸、无醛胶黏剂和人造板的无胶胶合等领域15-17。近年来，有关漆酶催化固定木竹材抗菌剂的研究也有所报道。No.4王慧等:漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究897Bi 等18和 Fernandez-Costas 等19利用漆酶的催化作用，将香草醛和松木提取物固定于木材中，发现其抗流失性明显提高。Prosper 等20和饶瑾等21采用漆酶将碘化钾固着于竹材中，以提高竹材的防霉性和防腐性。Wang 等22-23利用漆酶的催化作用将百里酚固定在竹材中，发现其可以明显降低百里酚在竹材中的挥发和流失，深入研究发现，在漆酶催化体系中，百里酚的高用量和漆酶的高活性是提高竹材防霉性能、满足实际需求的关键因素。因此，本研究拟采用两步法处理竹材：第 1步用抗菌剂浸渍处理，第 2 步用漆酶催化固定处理，这样既可增加百里酚的用量，又可保证漆酶的高催化活性。本研究借助漆酶的绿色催化作用，将百里酚高效固着于竹材中，以降低百里酚在竹材中的挥发和流失，提升竹材的防霉效果。相关处理的示意图如图 1 所示。并进一步研究竹材在漆酶催化固定百里酚处理前后表面化学改变，以探明百里酚在竹材中的固着机制。1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1试材与药剂红竹 Phyllostachys iridescensC.Y.YaoetS.Y.Chen：采自安徽宣城，5 年生，去除竹青、竹黄后制成精刨竹条，规格为 50mm20mm5mm(长宽厚)。白腐菌漆酶(BR，活性0.5U/mg，上海阿拉丁试剂有限公司)，在 45、pH=4.5 时测得活性为 0.66U/mg；2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)(纯度98%，上海阿拉丁试剂有限公司)；乙醇和百里酚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(分析纯，杭州华东医药集团有限公司)。1.1.2测试菌种黑曲霉 Aspergillus niger，编号为 GDMCC3.411；绿木霉 Trichoderma virens，编号为 GDMCC3.140；桔青霉 Penicillium citrinum，编号为 GDMCC3.458。3 种霉菌均购买于广东省微生物菌种保藏中心。1.1.3主要仪器UV-2550 型紫外分光光度计(日本 Shimadzu 公司)；IRPrestige-21 型傅里叶变换红外光谱仪(日本 Shimadzu 公司)；X 射线光电子能谱仪(美国 ThermoScientific 公司)；SU8000 型冷场发射扫描电镜(日本 Hitachi 公司)；OCA50AF型接触角测试仪(德国 Dataphysics 公司)。1.2 漆酶催化固定百里酚将供试竹材浸入质量分数为 3%的百里酚乙醇溶液中，先在0.1MPa下真空处理 15min，再在 0.8MPa 下加压处理 30min。取出竹块用滤纸吸干表面液体，称重，按公式(1)计算竹块中百里酚的载药量(R)。R/(g/m2)=(m2m1)c2(HW+W L+HL)106(1)其中：m1和 m2分别是试块浸渍处理前、后1.抗流失 Resistance to loss2.抗挥发 Anti-volatilization3.竹材长效防霉 Bamboo long-termmildew resistance漆酶Laccase百里酚ThymolHO浸渍处理Dipping treatment纤维素Cellulose半纤维素Hemicellulose1.百里酚易流失和挥发 Thymol easily loses and volatilizes2.竹材防霉效果不持久 Bamboo mildew-proof effect is not lasting酶催化处理Enzymatic catalytictreatment改性纤维Modified fiber纤维Fiber木质素Lignin图 1 漆酶催化固定百里酚处理竹材的示意图Fig.1 Schematic showing preparation of laccase-catalyzed fixation of thymol to bamboo898农药学学报Vol.25的质量，单位为 g；c 是处理液中百里酚的质量浓度，单位为 g/0.1kg；L、W 和 H 分别代表竹块的长、宽和厚，单位均为 mm。浸渍后的竹块先气干 6h，然后置于真空干燥箱内，在 40 下干燥 24h。将一定量的漆酶和ABTS 溶于 pH=4.5、浓度为 0.1mol/L 的磷酸缓冲溶液中，配制成漆酶质量浓度为 0.5mg/mL 和ABTS 浓度 0.5mmol/L 的催化反应液。将浸渍过百里酚的竹块放入该溶液中进行真空加压浸渍(浸渍条件同上)。浸渍结束后，置于 40 水浴下继续搅拌反应 24h，于 40 真空箱内干燥 3d。只经溶剂(先乙醇后缓冲溶液)加压浸渍的竹材，标记为 Control；仅由 3%的百里酚乙醇溶液处理的试样标记为 Thymol；由 3%百里酚乙醇溶液和漆酶共同处理的竹材标记为 Thymol+Laccase；未经任何处理的空白竹材定义为 Blank。每个处理组的重复竹块试样为 6 个。1.3 分析测试方法1.3.1防霉性能检测将绿木霉、黑曲霉和桔青霉分别接种于竹材试块上9，按照 GB/T182612013防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法的相关规定测定处理后的竹材对 3 种霉菌的防霉性能。定期观察和记录竹块上霉菌感染面积和生长情况，确定被害值等级。被害值越低，防霉效果越好。试块霉变的分级标准见表 1。根据公式(2)计算处理竹材对霉菌的防治效力。E/%=(1DtD0)100(2)其中：E 为防治效力，%，Dt为药剂处理试块的平均被害值；D0为未处理对照试块的平均被害值。1.3.2流失处理为进一步了解漆酶催化百里酚在竹材中的固定效果，将竹材进行流失处理，并以试块流失处理前后对 3 种竹材霉菌的防霉效果来表征漆酶催化固定的效果。流失处理过程参照美国木材防腐协会标准 AWPAE112007StandardMethodofDeterminingtheLeachabilityofWoodPreservatives进行，每组 6 个重复试样。取处理好的竹材试块置于 500mL 烧杯中，加入 180mL蒸馏水浸没试块。每隔 6、24、48h 更换一次蒸馏水，共计 14d。流失处理后的竹材试块按照 1.3.1节中的方法进行防霉性能的测定。1.3.3竹材中百里酚挥发率测定百里酚直接用于竹材防霉处理时存在易挥发的问题。本研究采用冷阱-紫外分光光度计联用的方法测试百里酚经漆酶催化处理前后的挥发情况。取相同质量的处理竹材，劈成细条状，放入二口烧瓶内，将水浴锅温度设置为 40，通过加热和抽真空的方式加速竹材中百里酚的挥发，挥发出的百里酚经冷阱的低温环境(21)冷凝收集，测试时间持续4h。测试结束后，向冷阱中少量多次加入无水乙醇进行冲洗，最终定容至 50mL，并用紫外分光光度计标准曲线法对收集到的百里酚进行定量，根据公式(3)计算不同处理竹材中百里酚的挥发率(VR，%)。VR/%=m3/m4100(3)其中：m3为冷阱中收集到的百里酚的量，g；m4为测试竹材中百里酚的量，g，根据载药量计算得出。以体积分数为 3%的百里酚乙醇溶液单独处理的竹材作为对照。用紫外分光光度计法测定的百里酚浓度-吸光度标准曲线为 y=0.012x 0.018；R2=0.999。1.3.4处理竹材的红外光谱和表面 X 射线光电子能谱仪(XPS)分析为研究漆酶催化后百里酚与竹材的相互作用机制，采用傅里叶变换红外光谱仪测试各处理竹材的全反射红外光谱，扫描范围4000500cm1，扫描次数 16 次，分辨率 0.09cm1。采用 XPS 分析竹材表面化学成分变化，以单色化A1K 射线(1486.6eV)为靶材，在真空度小于5107Pa 的分析室中对试样进行扫描，扫描步长 0.1eV，扫描范围 01100eV。表 1 试块霉变的分级标准Table 1 Classes of the infection value of the testedbamboo blocks被害值等级Classofinfectionvalue试菌感染面积Infectionareaofthetestedbambooblock0试样表面无菌丝Nomycelialandmoldonthesurfaceofsample1试样表面菌丝感染面积1/4Theinfectedareaonthesurfaceofsample3/4Theinfectedareaonthesurfaceofsample3/4No.4王慧等:漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究8991.3.5处理竹材形貌分析将待测竹材试样绝干，用离子溅射仪镀金后，采用冷场发射扫描电镜观察竹材表面，电压5kV。1.3.6疏水性能测试采用接触角测试仪测试竹材试样的静态接触角。去离子水滴的体积固定为5L，测试时间为 5s，同一样品取 6 个不同的测试点测试，同一种处理方式 6 个平行试样，最终结果取其平均值。以未经任何处理的竹材(Blank)和只经溶剂(先乙醇后缓冲溶液)加压浸渍的竹材试块(Control)作为对照。2 结果与分析 2.1 漆酶催化百里酚处理竹材的防霉效果供试竹块对 3 种霉菌的防霉效力测定结果见表 2，防霉效果见图 2。由图 2 可知，对照处理竹材(Control)试样均在培养的第 3 天开始发生霉变，并迅速发展为整个试样表面完全霉变，对 3种霉菌的防霉效力均为 0。然而，经百里酚单独处理竹材(Thymol)表面出现霉变的时间延后，仅有黑曲霉处理组在培养的第 8 天有霉菌孢子附着在试样表面，但没有明显的繁殖和蔓延，在 30d的测试时间内，只有小于 1/4 的竹块面积被黑曲霉侵染，被害值等级为 1，说明用百里酚处理竹材，明显提升了竹材的防霉效果。对比 Thymol 和Thymol+Laccase的两组处理试块，最终防霉效力没有出现明显的差别(表 2)，只是 Thymol+Laccase处理组竹块表面出现桔青霉和黑曲霉侵染的时间比百里酚单独处理组要早，这可能是由于在漆酶催化处理操作过程中，因少量的百里酚流失或者挥发造成的。43210051015时间 Time/dDay 3Day 13Day 30202530432101051015时间 Time/d202530432101051015时间 Time/d202530黑曲霉平均霉变等级Average mildew grade ofAspergillus niger绿木霉平均霉变等级Average mildew grade ofTrichoderma virens桔青霉平均霉变等级Average mildew grade ofPenicillium citrinumControlabcdefghiDay 3Day 13Day 30abcdefghiDay 3Day 13Day 30abcdefghiThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+Laccase黑曲霉 Aspergillus niger绿木霉 Trichoderma virens桔青霉 Penicillium citrinumControlThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+Laccase(a)(c)(e)(b)(d)(f)图 2 不同处理竹材对黑曲霉(a 和 b)、绿木霉(c 和 d)和桔青霉(e 和 f)的防霉效果及霉菌生长记录Fig.2 Anti-mildew effect and mold growth records of bamboo with different treatment against Aspergillus niger(a and b),Trichoderma virens(c and d)and Penicillium citrinum(e and f)表 2 不同处理竹材对 3 种霉菌的防霉效果Table 2 Anti-mildew effect of bamboo with different treatment on three kinds of molds试样Samples黑曲霉Aspergillus niger绿木霉Trichoderma virens桔青霉Penicillium citrinum平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%Thymol+Laccase175.001000.587.5Thymol175.001000100Control404040900农药学学报Vol.25 2.2 漆酶催化固定百里酚的效果表 3 和图 3 展示了竹材经过挥发和流失处理后对 3 种霉菌的防霉效果。从图 3 可知，对照组竹材(Control)是最先发生霉变的，在测试的第12 天已经完全霉变。然而 Thymol+Laccase 在 30d的测试期内表现出了优异的防霉效果，在第 20 天时表面开始被霉菌感染，平均霉变等级为 0.17，对 3 种霉菌的防霉效力均大于 95%，说明经漆酶催化处理以后，百里酚很好地固定在了竹材中，不受外界淋洗的影响，可持续发挥防霉作用。而百里酚单独处理组(Thymol)的防霉效力低于漆酶催化百里酚处理组(Thymol+Laccase)，尤其是对黑曲霉和桔青霉，分别在第 8 天和 15 天出现了霉变现象，最终防霉效力分别为 87.5%和 79.2%，防霉效果相对降低，主要原因是百里酚单独处理竹材经过流失处理，其中起防霉作用的百里酚部分流失，造成抗菌成分含量降低，对桔青霉生长抑制作用也减弱。同时对比表 3 和表 2 发现，百里酚单独处理竹材在经过 14d 的流失试验后，对黑曲霉和桔青霉的防霉效力也相对降低，主要是由于百里酚的流失造成的。在以往的研究中，以百里酚等天然抗菌剂作为木、竹材的保护剂时普遍存在保护时效低的问题。从本研究结果可以看出：流失是百里酚作为竹材抗菌剂保护时效低的一个原因，因为百里酚单独处理竹材在经过流失处理后，防霉效果相对降低；另一个重要的原因可能是百里酚在竹材中容易挥发。进一步采用冷阱-紫外分光光度计法对各处理竹材中百里酚的挥发性进行了研究。由表 4 可知，Thymol 处理组中，百里酚极易挥发，经过 4h的加速挥发处理，百里酚的挥发率高达 17.03%。143201051015时间 Time/d黑曲霉平均霉变等级Average mildew grade ofAspergillus niger绿木霉平均霉变等级Average mildew grade ofTrichoderma viride202530432101051015时间 Time/d桔青霉平均霉变等级Average mildew grade ofPenicillium citrinum202530432101051015时间 Time/d202530Day 3Day 13Day 30ControlabcdefghiThymolThymol+LaccaseDay 3Day 13Day 30ControlabcdefghiThymolThymol+LaccaseDay 3Day 13Day 30ControlabcdefghiThymolThymol+Laccase黑曲霉 Aspergillus niger绿木霉 Trichoderma virens桔青霉 Penicillium citrinumControlThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+LaccaseControlThymolThymol+Laccase(a)(c)(e)(b)(d)(f)图 3 经流失处理后不同处理竹材对黑曲霉(a 和 b)、绿木霉(c 和 d)和桔青霉(e 和 f)的防霉效果及霉菌生长记录Fig.3 Anti-mildew effect and mold growth records of bamboo with different treatment against Aspergillus niger(a and b),Trichoderma virens(c and d)and Penicillium citrinum(e and f)after loss treatment表 3 不同处理竹材流失处理后对 3 种霉菌的防霉效果Table 3 Anti-mildew effect of bamboo with different treatment on three kinds of molds after loss treatment试样Samples黑曲霉Aspergillus niger绿木霉Trichoderma virens桔青霉Penicillium citrinum平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%平均霉变等级Averagemildewgrade防霉效力Resistingefficacy/%Thymol+Laccase010001000.295.8Thymol0.587.50.01000.879.2Control4.004.004.00No.4王慧等:漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究901而经过漆酶固定处理后，Thymol+Laccase 处理竹材中百里酚的挥发率明显降低，仅为 6.75%。该挥发率测定结果与流失处理后各处理竹材的防霉效果一致，由于漆酶的催化固定作用，使处理竹材在经过流失处理后仍表现出优异的防霉效果和较低的百里酚挥发率。由此证明，漆酶催化固定百里酚处理竹材是一种有潜力的长效防霉方式，可以很好地将百里酚固定于竹材中。2.3 处理竹材红外分析与单独用百里酚处理的竹材相比，漆酶催化百里酚改性竹材降低了百里酚挥发率，提高了竹材的防霉效率，这可能是漆酶作用下百里酚与竹材发生了化学反应。关于竹材改性处理前后的化学键类型或官能团变化的信息通过 FT-IR 进行了表征。如图 4 所示，在 29622866cm1处为甲基和亚甲基的 CH 拉伸振动相对应的吸收带，Thymol+Laccase 的强度略有增加，可能是由于新引入的百里酚中含有较多的甲基造成的。代表竹材木质素苯环骨架结构的特征峰(15911418cm1)各处峰强都有细微变化，说明在漆酶作用下竹材木质素苯环周围环境发生了变化。1237cm1和 1025cm1处通常被认为是醚键(CO)的特征峰，Thymol+Laccase 处理竹材的这两处峰发生了较为明显的变化，尤其是 1025cm1处。有文献报道称，漆酶可以催化酚类物质形成苯氧自由基及其他电子转移共振结构，自由基之间很容易发生偶合成键24。结合以上分析及文献报道，推测在漆酶的催化作用下，百里酚与竹材木质素发生了化学反应，百里酚接枝于竹材木质素上，且很可能以醚键的方式成键。进一步通过处理竹材表面 XPS 分析漆酶作用下竹材与百里酚间发生的化学反应。2.4 处理竹材表面元素分析应用XPS 测试分析竹材表面 C、H 和 O 元素变化也可以提供百里酚和竹子之间发生接枝反应的证据。从表 5 中可以得出，未经过处理的竹材(Blank)表面 C 元素含量在 66.83%，而经过漆酶催化百里酚处理(Thymol+Laccase)之后，C 元素含量增加为 68.27%，这主要是因为处理后百里酚留在了竹材表面。百里酚(C10H14O)具有 80%碳含量，高于竹材表面碳含量。所以用百里酚处理竹材会造成竹材表面碳元素和 C/O 比的增加，C/O 比从 2.01 增加至 2.15。而对比 Thymol 和Thymol+Laccase 处理组，Thymol+Laccase 处理组碳元素增加的更多，可能是由于漆酶的催化作用使百里酚更多地保留在了竹材中，而 Thymol 处理组由于百里酚与竹材之间缺乏牢固的连接，百里酚在竹材中只是以物理吸附状态存在，在后续的烘干和保存处理过程中很容易流失。进一步采用 C1s、O1s 高分辨谱分峰拟合对竹材表面 C、O 元素来源进行追溯，结果见图 5。其中 C1s 总峰被分成 3 个小峰(C1、C2、C3)，其中C1 代表与碳原子以单键或与氢原子连接的碳原子(-C*C/C*H)，C2代表与一个氧原子以单键连接的碳原子(+C*OH/+C*OC)，C3 代表与两个氧原子分别以单键连接或与一个氧原子以双键连接的碳原子(-C*O/OC*O)25；O1s 被分成两个小峰(O1、O2)，其中 O1 代表与40003000波数 Wavenumber/cm120001000透过率 Transmittance/%29621697159112371025ControlThymolThymol+Laccase图 4 竹材改性前后的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of bamboo before and aftermodification表 4 不同处理竹材中百里酚的挥发性Table 4 Volatility of thymol in different treatmentmaterials试样Samples载药量Drugloading/(g/m2)挥发率Volatilizationrate/%Thymol+Laccase430.26.75Thymol406.117.03表 5 竹材改性处理前后的表面元素含量变化Table 5 Changes of surface element content of bamboobefore and after modification试样Samples表面元素含量Surfaceelementcontent/%C/OCOBlank66.8333.172.01Thymol67.7832.222.10Thymol+Laccase68.2731.732.15902农药学学报Vol.25以双键连接的氧原子(-RO)，O2 代表以单键连接的氧原子(-RO-)。对 C 和 O 元素分峰拟合后的结果见表 6。从中可以发现，Thymol+Laccase 处理组竹材中C1 相对含量显著增加，这表明竹材表面的 CC 键和 CH 键数量增多。说明经过漆酶催化 Thymol改性后，Thymol 与竹材发生了某种键合连接，使得 Thymol 保留在竹材表面，从而导致 C1 相对含量的增加。研究表明，漆酶作用于木质素类酚结构的主要方式包括-C*OH/C*OC 结构间的连接以及向-C*=O 结构的转变26。因此，在Thymol+Laccase 处理组的竹材中，代表-C*O单键结构的 C2 和 O2 相对含量降低，代表-C*O 结构的 O1 相对含量增加。理论上，接枝反应会导致 C2 含量增加，然而实际上 C2 含量降低，这可能是因为漆酶对竹材木质素的氧化作用大于漆酶催化 Thymol 与竹材的接枝反应。此外，在 Thymol+Laccase 处理组的竹材中百里酚的引入也会导致竹材元素相对含量发生变化。百里酚单独处理组(Thymol)的竹材元素含量也发生了一定变化，这主要是因为残留在竹材内部的Thymol 的影响。综合以上结果，再结合图 4 中FT-IR 结果醚键特征峰的变化，可以推断，漆酶催化下 Thymol 与竹材的连接主要以醚键方式存在。2.5 处理竹材形貌变化及接触角变化2.5.1处理竹材表面形貌分析各处理竹材的横切面与纵切面微观形貌如图 6 所示。可以看出，竹材经百里酚单独处理后(Thymol)，微观形貌并没有发生明显的变化，竹材的表面与对照(Control)一样，平整且光滑，这主要是因为百里酚为小分子物质，配制成乙醇溶液浸渍于竹材中，其渗透性较好。而经过漆酶催化处理的竹材(Thymol+Laccase)，表面出现大量小的薄片及颗粒，这些物质可能是漆酶催化竹材和百里酚的反应产物。2.5.2处理竹材水滴接触角分析从流失处理后竹材的防霉性能和竹材中百里酚的挥发率可知，经漆酶的催化作用，百里酚被有效地固定在竹材中，提升了竹材的防霉性能及百里酚的抗挥发性。考虑到百里酚是一种亲酯性物质，因此采用静态水接触角分析来进一步探索漆酶催化百里酚在竹材上的固着性，结果如图 7 所示。由图 7可知，竹材经过反应溶剂(乙醇和缓冲溶液)处理12 00010 0008000600040002000峰强 Intensity/arb.units0295290288.27(C3)288.21(C3)288.10(C3)286.57(C2)(a)(c)(e)(b)(d)(f)286.53(C2)286.51(C2)284.82(C1)284.84(C1)284.86(C1)结合能 Binding energy/eV28528020 00015 0001 00005000峰强 Intensity/arb.units0295290结合能 Binding energy/eV28528030 00025 00020 00015 00010 0005000峰强 Intensity/arb.units0295290结合能 Binding energy/eV28528020 00015 00010 0005000峰强 Intensity/arb.units0540535结合能 Binding energy/eV53040 00030 00020 00010 000峰强 Intensity/arb.units0540535结合能 Binding energy/eV53040 00050 00030 00020 00010 000峰强 Intensity/arb.units0540 538 536 534 532结合能 Binding energy/eV530 528532.98(O2)532.91(O2)530.88(O1)530.93(O1)533.03(O2)531.23(O1)(a,b)Blank；(c,d)Thymol；(e,f)Thymol+Laccase图 5 竹材改性前后的高分辨率 C1s 和 O1s 光谱Fig.5 High-resolution