非发酵菌群的分类鉴定.ppt

非发酵菌群的分类鉴非发酵菌群的分类鉴定定第一节非发酵菌概述非非发发酵酵菌菌（Nonfermenters）是指一大类不能以发酵方式（或不能以明显发酵方式）分解葡萄糖的革兰氏阴性无芽孢的需氧或兼性厌氧杆菌。它们在分类学上分别隶属于不同的科、属，但生理生化特性又很相似，故在临床微生物学检验中，常把它们当作同一类菌群来对待。非发酵菌大多是条件致病菌，可引起各种感染，尤其是医源性感染，近年来各国发病率逐年上升，已成为当前医院管理中的一个重要问题。非发酵菌的种类很多，包括十几个菌属、几十个种，有些还有生物型、亚型等。但与医学关系密切的、具有临床意义的有：假单胞菌属、寡氧单胞菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、鲍特氏菌属、金氏杆菌属、不动杆菌属、无色杆菌属、莫拉氏菌属、艾肯氏菌属、土壤杆菌属、军团菌属。但在临床上用一般方法不能够分离出来的细菌有：鲍特氏菌属（百日咳鲍特氏菌）：初次分离对营养要求较高，在血琼脂平板和巧克力琼脂平板上均不能生长，必须在含有血液、甘油、马铃薯以及活性炭的包-金（Bordet-Gengou,B-G）二氏培养基上才能生长。故用一般的培养基不可能将其分离出来。军团菌属营养要求苛刻，普通培养基、血平板和巧克力平板均不生长；生长过程中需要多种微量元素如：铁、钙、镁、锰、锌、钼等作为酶的协同因子；同时需要甲硫氨酸、半胱氨酸等特殊氨基酸才能生长。目前公认的最适宜培养基是缓冲活性炭酵母浸出液，加上铁、L-半胱氨酸和-酮戊二酸组成的BCYEa（bufferedcharcoalyeastextractagar）培养基。因此在临床上真正能分离出来且有临床意义的非发酵菌群有：假单胞菌属、寡氧单胞菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、鲍特氏菌属（百日咳鲍特氏菌除外）、金氏杆菌属、不动杆菌属、无色杆菌属、莫拉氏菌属、艾肯氏菌属、土壤杆菌属。第二节第二节 非发酵菌群的初步识别非发酵菌群的初步识别第三节、第三节、非发酵菌群的属间鉴别非发酵菌群的属间鉴别（一）、氧化酶阴性菌群的（一）、氧化酶阴性菌群的属间鉴别属间鉴别（二）、氧化酶阳性菌群的（二）、氧化酶阳性菌群的属间鉴别属间鉴别第四节、非发酵菌群的属内鉴别第四节、非发酵菌群的属内鉴别一、假单胞菌属和一、假单胞菌属和寡氧单胞菌属寡氧单胞菌属假单胞菌属属假单胞菌科，该属为严格的专性需氧的革兰氏阴性杆菌，具有一端鞭毛，无荚膜、无芽孢。该菌属在自然界中分布广泛，营养要求不高，氧化酶试验均为阳性，是假单胞菌科的代表菌属。假单胞菌科由假单胞菌属及其亲缘关系密切的菌属（以前大部分属于假单胞菌属）组成。用于假单胞菌科分类的方案有两个：其一：根据细菌的表型特征分为七个主要的组，即：产荧光组、斯氏族、产碱组、食酸组、类鼻疽组、敏捷德氏组、缺陷组。其二：根据rRNADNA同源性将假单胞菌科分为5个rRNA同源群，即：rRNA同源群包括铜绿假单胞菌等12个种；rRNA同源群包括伯克霍尔德菌属等7个种；rRNA同源群包括食酸丛毛单胞菌等7个种；rRNA同源群微小假单胞菌等8个种；rRNA同源群寡氧单胞菌等64个种。此外，还有4个种属于rRNA同源群未知的假单胞菌。上述分类中，不管采用哪种分类，临床上常见的只有两个种，即假单胞菌属的铜绿假单胞菌和寡氧单胞菌属的嗜麦芽寡氧单胞菌。1、假单胞菌属该菌属的代表种为铜绿假单胞菌。该菌早在1872年由施罗顿（Schroeten）首先命名，因其在代谢过程中能产生水溶性兰绿色色素，在感染部位能形成兰绿色脓液，故称绿脓杆菌。该菌除分布在水源、土壤、空气中外，亦存在于正常人的皮肤、呼吸道、肠道中，是非发酵菌群中最常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌鉴别要点：（1）、铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上能产生水溶性绿色素，使整个培养基变为绿色。（2）、在血平板上经3537，1824h培养可表现为：菌落灰绿色、半透明、大而扁平、表面湿润、边缘不齐；有金属光泽；有生姜样芳香气味；菌落周围有宽大的兰绿色透明溶血环。（3）、该菌为专性需氧菌，氧化酶和触酶均阳性；O/F试验“O型”；无芽孢、无荚膜，菌体一端有单鞭毛，运动活泼。2、寡氧单胞菌属该菌属原属于假单胞菌属，在1961年根据其鞭毛特征被命名为嗜麦芽假单胞菌；1983年根据核酸同源性和细胞脂肪酸组成等归入黄单胞菌属，命名为嗜麦芽黄单胞菌；但由于其无黄单胞菌素、无植物病原性，能在37生长等与其它黄单胞菌不同，故在1993年又被命名为嗜麦芽寡氧单胞菌。该菌的生长特性、营养要求、及其它生物学性状与铜绿假单胞菌极为相似，所不同的是氧化酶阴性，这是与假单胞菌属相区别的重要特性；此外，该菌一端具有3根以上丛鞭毛，运动活泼，可与氧化酶阴性的不动杆菌属和副百日咳鲍特氏菌相鉴别。3、鼻疽（类鼻疽）伯克霍尔德菌鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiamallei）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei）是鼻疽与类鼻疽的病原菌，属假单胞菌属rRNA同源群的第二群；2000年被NCCLS/CLSI（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards/ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）列为可能成为生物恐怖的细菌。这两种细菌均对马、驴、骡、猫、狗等动物感染。人类感染是经伤口或粘膜、呼吸道而进入体内。急性患者可有高热、衰竭等全身症状；皮肤、皮下、鼻粘膜出现结节和溃疡；肺鼻疽病有胸痛、咳嗽、咳血等症状。细菌进入血流，可形成菌血症及内脏脓肿，最后常因脓毒血症而死亡。慢性患者全身症状不定，可有皮肤、皮下溃疡，其潜伏期可达数年。从患者的血液、尿液、痰液、脓液、创口分泌物中均可分离出上述两菌。二、产碱杆菌属二、产碱杆菌属主要特性：1、产碱杆菌属为一群革兰氏阴性专性需氧菌，具有周身鞭毛，多数无荚膜。2、营养要求不高，在普通培养基上生长良好；在液体培养基上可形成菌膜；在含蛋白胨的肉汤中产碱，使培养基pH上升到8.6以上，故名产碱杆菌。3、除木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种可氧化分解木糖外，不分解任何糖类；氧化酶、触酶均阳性；在O/F培养基中产生碱性反应；IMViC试验为：、+。分类及鉴定；产碱杆菌属目前分为3个种、两个亚种和一个型，即：粪产碱杆菌、皮乔特产碱杆菌、木糖氧化产碱杆菌。木糖氧化产碱杆菌去硝化（脱硝）亚种；木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种。粪产碱杆菌型、三、黄杆菌属三、黄杆菌属黄杆菌属细菌为无芽孢、无鞭毛的革兰氏阴性杆菌。其主要特性有两个：1、在其生长过程中产生黄色素；2、以微弱发酵的方式利用葡萄糖，但因其产酸量少而慢，需培养一周以上才能观察到，故常被作为非发酵菌来对待。黄杆菌属目前共分为8个种和4个未命名的生物群。它们分别是：脑膜炎败血黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄杆菌、水田黄杆菌、嗜醇黄杆菌、嗜糖黄杆菌、嗜温黄杆菌、薮内黄杆菌及黄杆菌b、e、h、i群。其中脑膜炎败血黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄杆菌和黄杆菌b群可引起人类疾病。（四）、鲍特氏菌属（四）、鲍特氏菌属鲍特氏菌属包括7个种：百日咳鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、支气管腐败鲍特氏菌、鸟鲍特氏菌、欣氏鲍特氏菌、霍氏鲍特氏菌和创口鲍特氏菌。其中前三种可引起人类疾病，具有较大的临床价值。主要特性：1、该属细菌为GN无芽孢球杆菌。百日咳鲍特氏菌的光滑型菌株有荚膜；副百日咳鲍特氏菌和支气管腐败鲍特氏菌无荚膜。百日咳鲍特氏菌和副百日咳鲍特氏菌无鞭毛、不运动；支气管腐败鲍特氏菌具有周身鞭毛，在1824有动力而在37不能运动。2、该菌属为专性需氧菌，百日咳鲍特氏菌初次分离时营养要求较高，需要有谷氨酸、L脯氨酸、半胱氨酸及菸酸等营养物质，但不需要X和V因子。在生长过程中形成过多的脂肪酸、重金属盐和H2O2等物质能抑制其生长，因此在培养基中需加入血液、活性炭和离子交换树脂等物质来吸附多余的有害物质，故该菌只能在鲍金二氏培养基上生长，在普通琼脂、麦康凯琼脂、巧克力色血琼脂及兔血琼脂上均不能生长。副百日咳鲍特氏菌和支气管腐败鲍特氏菌营养要求不高，在上述培养基上均能生长。3、该菌属细菌不分解糖类。其它生化反应见下表。（五）、金氏杆菌属（五）、金氏杆菌属金 氏 杆 菌 属 是 在 1976年 由 Henriksen和Bover二氏提议设立的一个新属。该属的第一个种是金氏金氏杆菌。同年由Snell和Lapage提议增加了两个种，即脱氮（去硝化）金氏杆菌和产吲哚金氏杆菌。所有这三个种在含有5%马血清的O/F培养基中，均以发酵形式利用葡萄糖，但因发酵能力微弱，故常被看作非发酵菌。主要特性：1、本属细菌为GN球杆菌，多成双排列，有时呈短链状；无芽孢、无鞭毛、不运动。2、营养要求较高，在不含血液的培养基中（如O/F培养基）须加入马血清才能生长；不需要X或V因子。3、在含血清的液体培养基中弱发酵葡萄糖。4、氧化酶阳性，触酶阴性，靛基质阳性，不利用枸橼酸盐。（六）、不动杆菌属（六）、不动杆菌属不动杆菌属的主要特性为：1、该属细菌是一群革兰氏阴性球杆菌，常成双排列、酷似双球菌，故常被误认为奈瑟氏菌属；又由于该菌具有保留结晶紫的特性（革兰氏可变性），又易被误认为革兰氏阳性球菌。该菌无芽孢、无鞭毛，部分菌株有荚膜。2、该菌为专性需氧菌；营养要求不高，在普通培养基上生长良好。3、本菌氧化酶阴性；硝酸盐还原试验阴性；多数菌株分解尿素；所有生物型均水解土温80。不动杆菌属隶属于奈瑟氏菌科。该属是分类和命名变化最大的一类细菌。最初被称为“米马菌”；后又相继称为“醋酸钙细球菌”、“奈瑟氏球菌”、“Herella菌”、“莫拉氏菌”等。曾列入“米马菌族、无色杆菌属”。1970年，莫拉氏菌及其类似菌的国际分类委员会提议将该菌属列入奈瑟氏菌科不动杆菌属，并确定该菌只有一个种，即醋酸钙不动杆菌。1978年，Gilard等将醋酸钙不动杆菌分成四个生物型，即：硝阴生物型、溶血生物型、产碱生物型和洛菲氏生物型。这一分类被伯杰氏细菌鉴定手册第八版所采纳。这四种生物型的生化反应及区别如下；1985年，临 床 微 生 物 学 手 册（ManualofClinicalMicrobiology）第四版中，将该菌属分为一个种，两个亚种，即醋酸钙不动杆菌，硝阴亚种和洛菲氏亚种。1986年，法国巴斯德研究所的Bouvet和Grimont等应用DNA杂交技术对不动杆菌属进行研究，将该属分为17个杂交群（基因种）。但只有6个种有菌名。6个种中，临床标本分离到的绝大多数为鲍曼不动杆菌，其它菌种引起的感染较少见。这6个种及其生化反应区别如下：（七）、无色杆菌属（七）、无色杆菌属无色杆菌属在伯杰氏细菌鉴定手册第九版中未被收入，但却已被人们普遍接受。该菌属细菌分两个种，即木糖氧化无色杆菌和无色杆菌Vd群，后者又分为生物1型和生物2型。该菌的主要特性为：1、该菌为革兰氏阴性杆菌，具有周身鞭毛，能运动。2、该菌为专性需氧菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好。3、该菌氧化酶（+），触酶（+），能氧化分解木糖，但对葡萄糖的氧化能力很弱，需57天才能分解。（八）、莫拉氏菌属（八）、莫拉氏菌属该菌属因在1895年由Morax氏发现，故命名。莫拉氏菌属隶属于奈瑟氏菌科，由于DNA/rRNA杂交结果表明它和布兰汉氏菌属有很近的亲缘关系，故1994年伯杰氏细菌鉴定手册把布兰汉氏菌属也纳入莫拉氏菌属，并把二者分称为莫拉氏菌属的莫拉氏菌亚属和布兰汉氏菌亚属。两者的区别是：莫拉氏菌属为球杆菌；而布兰汉氏菌属为双球菌。莫拉氏菌属的主要特性为：1、本属细菌为革兰氏阴性球杆菌，具多型性：幼龄菌为细杆状；老龄菌多呈球状；染色时不易脱色，有保留结晶紫的特性（革兰氏可变性），此为该菌的重要特性。2、该菌属为专性需氧菌，营养要求较高。初分离时培养基中需加入血液、血清、胸水、腹水等营养物质并在较高的湿度下（8090%）才适于生长。3、氧化酶+，触酶+，一般不分解糖类；不产生H2S，IMViC为、/+。莫拉氏菌属与临床有关的共7个种，即：腔隙（缺陷）莫拉氏菌，非液化莫拉氏菌，犬莫拉氏菌，林肯莫拉氏菌，奥斯陆莫拉氏菌，亚特兰大莫拉氏菌，苯丙酮酸莫拉氏菌。后者现又改为苯丙酮酸嗜冷杆菌。（九）、艾肯氏菌属（九）、艾肯氏菌属艾肯氏菌属只有一个种，即侵蚀艾肯氏菌。其主要生物学性状为：1、本菌为革兰氏阴性球杆菌，无芽孢、无荚膜、无鞭毛，不运动。2、为需氧菌，在需氧环境中初次分离时严格需要血红质，故常用血琼脂或巧克力琼脂进行培养。次代培养对血红质要求不一。3、本菌的生化反应不活泼，既无氧化亦无发酵各种糖的能力。触酶、尿素酶、吲哚及硫化氢均阴性；仅氧化酶和硝酸盐还原试验阳性。（十）、土壤杆菌属（十）、土壤杆菌属土壤杆菌属分四个种，即根癌土壤杆菌、放射形土壤杆菌、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌。其中只有放射形土壤杆菌自人类的血液、尿液、伤口分泌物中分离出，其致病性尚有争论。但因其和其它非发酵菌容易混淆，故应了解其特性。放射形土壤杆菌的特性为：1、该菌为革兰氏阴性杆菌，有周身鞭毛，运动活泼。2、对营养无特殊要求，能在普通培养基及麦康凯琼脂上生长。3、生化反应活泼，能氧化分解多种糖类；氧化酶、触酶均阳性；还原硝酸盐后能产生气体。魏曦氏鞭毛染色法：魏曦氏鞭毛染色法：【染色液】甲液：饱和甲明矾2ml；50g/L石炭酸5ml；200g/L的鞣酸液2ml；混合后备用。乙液：碱性复红酒精饱和液。使用前，将甲液9份、乙液1份混合过滤，过滤后以第三天使用最佳。【操作方法】1、取洁净载玻片1张，于玻片一端滴加蒸馏水一滴。用接种环取被检菌菌落少许，轻点于蒸馏水中，使细菌自由扩散。（注意：切勿研磨，以免鞭毛脱落。）缓慢倾斜玻片，使细菌顺水流自由扩散。将玻片置37孵箱内自然干燥。（注意：切勿火焰固定。）2、于涂片上滴加鞭毛染液，染色0.51min，轻轻水洗，干后镜检。【结果】菌体与鞭毛均呈红色，且菌体着色比鞭毛深。染色时间越长，鞭毛越粗。谢谢！