免疫胶体金诊断技术在兽医的应用研究现状.pdf

免疫胶体金诊断技术在兽医的应用研究现状许楷惠1，2，卢立康1，2，黄元2，蔡汝健2，王晓虎2，陈晶2，向华2*（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东 广州 510640）摘 要：免疫胶体金诊断技术是以胶体金为示踪标记物应用于抗原抗体的一种体外诊断技术，具有反应迅速、操作简单、成本低、便携等优点。目前，免疫胶体金诊断技术广泛应用于医院、实验室、野外及公共场所的现场诊断。该文介绍了免疫胶体金诊断技术的基本原理、优缺点，并整理讨论了免疫胶体金诊断技术两种主要方法免疫层析法和斑点金免疫渗滤法在国内外动物医学诊断中的应用研究现状。关键词：免疫胶体金；免疫检测；诊断中图分类号：S854.4文献标识码：B文章编码：10058567（2023）04006006Application of Immune Colloidal Gold DiagnosticTechnology in VeterinaryXU Kaihui1，LU Likang1，HUANG Yuan2，CAI Rujian2，WANG Xiaohu2，CHEN Jing2，XIANG Hua2*（1.College of Animal Science and Technology Zhongkai College of Agricultural Engineering，GuangzhouGuangdong 510225；2.Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou Guangdong 510640）Abstract：Immune colloidal gold diagnostic technology is an in vitro diagnostic technique using colloidal gold asa tracer marker applied to antigens and antibodies.It has the advantages of rapid response，simple operation，low costand portability.At present，immune colloidal gold diagnostic technology is widely used in hospitals，laboratories，fieldand public places on site diagnosis.This paper introduces the basic principle，advantages and disadvantages ofimmune colloidal gold diagnostic technology，and discusses the application research status of two main methods ofimmune colloidal gold diagnostic technologyimmunochromatography and dot immunogold filtration in animal medicaldiagnosis at home and abroad.Keywords：Immune colloidal gold；Immunoassay；Diagnosis收稿日期：20221212基金项目：广东省重点领域研发计划（2020B0202080004，2019B020211003，2019B020217002）；广东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目作者简介：许楷惠（1998年生），女，研究方向为动物生物安全与疫病防控。Email：*通讯作者：向华（1971年生），男，博士，研究员，研究方向为动物传染病防控。Email：X胶体金是一种带负电荷的疏水胶溶液，由于静电作用，很容易与各种大分子物质结合形成稳定的胶体状态并且不改变大分子物质的生物学特性1。1962年Feldherr等首次提出使用胶体金作为一种电镜示踪标记物2。到了上世纪 70 年代初期，Faulk等将胶体金作为标记物用于免疫组织化学领域3。此后，随着对胶体金的研究逐渐深入，除了应用于免疫组织化学染色外，胶体金还应用于免疫诊断技术中。利用胶体金建立的免疫胶体金诊断技术具有检测快速便捷、结果判断直观等优专题综述广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.11 60点，因此越来越受到人们的重视，广泛应用于医院、实验室、野外及公共场所的现场诊断4。目前免疫胶体金诊断技术最常见的两种形式是免疫层析法和斑点金免疫渗滤法，本文主要介绍免疫胶体金诊断技术的基本原理、优缺点以及对免疫层析法和斑点金免疫渗滤法在国内外动物医学诊断中的应用进行综述，并对其发展趋势进行展望。1免疫胶体金诊断技术1.1免疫胶体金诊断技术基本原理免 疫 胶 体 金 技 术（Immune colloidal goldtechnique，ICGT）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术，实际上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程5。胶体金颗粒在弱碱环境下带负电荷，而蛋白质分子是带正电荷，由于静电的作用，蛋白质分子会与胶体金颗粒形成牢固的结合，这种结合是物理结合，因此不影响蛋白质的生物特性67。越来越多的学者利用这个特性将胶体金与不同生物大分子结合，根据结合物的免疫和生物学特性，将胶体金应用于免疫诊断技术中。目前常见的两种形式一种是侧向横流形式，称免疫层析法或胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay，GICA）；另一种形式为穿流形式，称免疫渗滤试验或斑点金免疫渗滤法（Dot immunogold filtrationassay，DIGFA）4。GICA是将胶体金标记技术与免疫检测技术、层析分析技术相结合的一种体外免疫诊断方法8。其原理与酶联免疫吸附试验（Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）相似，但 ELISA 是使用酶标记抗原或抗体与固相载体进行结合，再加入酶反应的底物后，底物被酶催化形成颜色，通过酶标仪读取颜色进行测定。GICA是利用胶体金对抗原或抗体进行标记，将待测样品、胶体金标记物依次滴加在硝酸纤维素膜上，经毛细力的作用向包被在硝酸纤维素膜上抗原或抗体横向移动并发生特异性结合，使膜上形成肉眼可见的沉淀线，以此来判读结果。DIGFA 是由SpielBerg等于1989年首次建立的方法。基本原理是在硝酸纤维素膜上包被相应的抗体或抗原后，将其装入充满吸水材料的渗滤装置中，用胶体金作为标记物质，当待测样品滴加在硝酸纤维素膜上时，经过渗滤，待测样品中的抗原或抗体会与膜上包被的抗体或抗原发生特异性结合，再加入胶体金标记物与已结合的抗原抗体复合物结合，使膜上形成肉眼可见的红色斑点，以此判读结果9。1.2免疫胶体金诊断技术的优缺点1.2.1优点免疫胶体金诊断技术的优点主要有：胶体金易于制备，通常采用柠檬酸三钠还原法，使用柠檬酸三钠将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子并形成金颗粒悬液，制备程序简单并且价格低廉；胶体金能与不同生物大分子通过静电力结合，根据结合物的免疫和生物学特性，广泛应用于各个领域；通过免疫胶体金诊断技术进行检测时，由于胶体金具有鲜明的颜色，检测结果肉眼即可判断，无需借助其他仪器设备，适合基层组织现场快速诊断；GICA 和 DIGFA 的操作步骤需要 35步，整个检测时间仅需 1015 min，检测步骤快速、简便并且检测结果的可靠性高7，10。1.2.2缺点虽然免疫胶体金诊断技术有着以上诸多优点，但该法仍存在着缺点需要进行改进，如一份免疫层析试纸条或者斑点金免疫渗滤试纸条只能检测一份样品，不能同时检测多份样品；不论是GICA还是DIGFA，其检测结果颜色的深浅受到很多因素的干扰，因此免疫胶体金诊断技术目前较多应用在抗体或抗原的定性检测上，难以用于定量检测11。2免疫层析法在动物医学诊断中的应用2.1在猪病诊断中的应用我国是养猪大国，近年来，随着非洲猪瘟的发生给我国养殖业的发展以及经济造成巨大影响，国家、社会对基层动物防疫的重视度逐渐提升12。越来越多人将胶体金免疫层析技术运用如非洲猪瘟、猪瘟、猪伪狂犬病、猪流行性腹泻、猪圆环病毒、塞内卡病毒等养殖场内常见猪病中。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是唯一已知的DNA虫媒介病毒，能够引起家猪和野猪将免疫胶体金诊断技术在兽医的应用研究现状许楷惠，等专题综述 61近100%的死亡率13。Wan 等将ASFV p30和p72蛋白及其单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上，建立了检测 ASFV p30 和 p72 蛋白抗体的免疫层析条，经试验验证，该试纸条能在510 min完成检测，灵敏度为1 256，检测结果与两种市售ELISA试剂盒相比，符合率均高于98%14。猪瘟是养殖场内最常见的猪病毒性流行病之一，对经济造成严重影响15。万颖等将猪瘟E2蛋白用胶体金颗粒进行标记后，建立猪瘟E2蛋白抗体胶体金免疫层析试纸条，经试验证明该试纸条检测猪瘟阳性血清灵敏度可达1 64，不与健康猪血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒、塞内卡病毒、牛病毒性腹泻病毒、非洲猪瘟病毒等的阳性血清发生交叉反应16。郭力伟等通过原核表达系统成功表达猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）gE蛋白并纯化后免疫Balb/c小鼠获得单克隆抗体，利用得到的单克隆抗体制备胶体金免疫层析试纸条，建立了一种快速检测PRV野毒株的方法，该法检测PRV疫苗株、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒等结果均为阴性，对PRV野 毒 株 的 检 测 结 果 与 PCR 方 法 的 符 合 率 达92.59%，为我国基层养殖单位进行PRV的净化提供了技术支持17。严昊等通过免疫胶体金技术，建立了猪流行性 腹 泻 病 毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）免疫层析试纸条，用于养殖场现场快速检测猪粪中的病毒，该法可以在15分钟内快速检测出猪粪中的PEVD病原，不与常见病原发生交叉反应并且检测结果与RTPCR检测结果一致18。Liu等使用免疫胶体金技术，将抗SIgA分泌成分单克隆抗体用胶体金标记后建立用于检测PEDV特异性SIgA的免疫层析试纸条，该试纸条可用于检测初乳样品中的 PEDV 特异性 SIgA，结果与ELISA 检测结果比较，通过 kappa 分析统计值为0.612，可用于有效监测SIgA水平19。贾宇旻等利用免疫胶体金技术建立快速检测PEDV的胶体金免疫层析方法，该法对PEDV的最低检测限为7.8103TCID50/mL且使用该法对临床115份样品进行检测，检测结果与RTPCR检测结果阳性符合率为93%20。Ding 等建立用于猪圆环病毒 2 型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的免疫层析试纸条，用于快速检测猪血清中 PCV2 病毒，便于评估接种PCV2 疫苗猪的感染状态，该试纸条对 PEDV、PRV、PRRSV及猪瘟病毒等均不产生阳性反应，与商品化ELISA试剂盒相比，该试纸条的相对灵敏性和特异性分别为72.7%和96.0%21。除病毒性相关疾病外，免疫层析法在寄生虫病也有应用。寇金华等将胶体金标记抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体制备猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条，试验证明该试纸条的灵敏度达 1 160，与猪囊虫阳性血清无交叉反应22。2.2在禽病诊断中的应用我国禽业养殖历史悠久，禽蛋和禽肉是我们日常生活中必不可少的食物。目前，我国家禽养殖业存在的最大问题就是传染病的传播23。禽流感是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的人畜共患病之一，AIV传播速度快，传播途径多，并且病毒株在不同环境条件下容易发生变异，严重危害着我国家禽养殖业24。我国农业农村部公布的 2021年国家动物疫病强制免疫计划 中就包含高致病性禽流感，因此对家禽免疫后的抗体水平检测对免疫状态的评估尤为重要。崔艺浩分别建立了针对H5和H7亚型禽流感病毒的鸡血清和鸭血清抗体检测胶体金试纸条并进行初步应用，经试验证明建立的针对 H5 亚型AIV抗体胶体金检测方法对152份鸡、鸭血清抗体检测结果与HI方法检测结果的符合率为92.11%，针对H7亚型AIV抗体胶体金检测方法与HI的符合率为 94.61%25。Yang 等利用两种针对 H7N9AIV的特异性单克隆抗体建立胶体金免疫层析试纸条，最低检测限为2个HAU或者102.55TCID50的H7N9 AIV，使用该试纸条对从2013年至2018年在浙江活禽市场采集的148个泄殖腔拭子进行检测，检测结果与PCR检测结果作对比，其灵敏度和特异性分别为 71.4%和 98.6%26。李鸽通过纯化H7N9 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Huizhou/HZ3/2017（HP）免疫小鼠获得单克隆抗体，建立H7亚型AIV胶体金检测方法，该法对H9N9亚型AIV尿囊液的检测限为2.4log10EID50/0.1 mL，与其他亚型的AIV及常见禽源病毒无交叉反应，还可以检测到流专题综述免疫胶体金诊断技术在兽医的应用研究现状许楷惠，等 62感病毒三价灭活苗的H7Re2抗原株27。Xiao等建立检测H9N2亚型AIV的胶体金免疫层析试纸条，检测限为每100 L样品中H9N2亚型AIV的HA滴度为 4，对 200 个临床样品进行检测，灵敏度为90.0%，特异性为97.4%28。除禽流感外，国内学者对于免疫胶体金在多种禽类疾病的快速诊断中有着诸多研究。王悦欣等 研 制 的 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒（Infectiousbronchitis virus，IBV）抗体胶体金免疫层析试纸条以重组IBV核衣壳蛋白为包被抗原，经试验证明该试纸条不与鸡新城疫病毒抗体阳性血清、鸡传染性法氏囊病毒抗体阳性血清、鸡毒霉形体抗体阳性血清和SPF标准鸡血清发生交叉反应，用该试纸条检测50份不同养殖场采集的鸡血清，检测结果与进口ELISA试剂盒检测结果作对比，二者符合率为97.44%29。Yu 等 将 针 对 鸡 传 染 性 喉 气 管 炎（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）gJ 蛋白的单克隆抗体与免疫金胶体金技术结合，建立用于检测ILTV的胶体金免疫层析法，该法对ILTV最低检出量为60ELD50/mL，用该法对260个临床样品进行检测，检测结果与RTPCR检测结果的符合率为99.6%30。2.3在牛、羊病诊断中的应用我国牛、羊业养殖的特点主要是散户养殖比较多，尤其是在一些经济发展较为落后的地区31。养殖户知识储备不够，乡村兽医数量有限，当发生传染病时，不能及时发现并控制从而导致传染病的蔓延，因此建立适合基层快速诊断检测方法十分重要。蓝舌病毒（Bluetongue virus，BTV）可感染家养或野生反刍动物，该病是世界动物卫生组织列为法定报告的疾病之一32。Chand等建立检测多种反刍动物中蓝舌病毒VP7蛋白的免疫层析试纸条，并使用该试纸条对481份不同反刍动物血清样品进行检测，灵敏性和特异性分别为95.2%和99.6%，检测结果与商品化ELISA试剂盒具有一致性33。曹 雷 等 纯 化 A 群 牛 轮 状 病 毒（Bovinerotavirus，BRV）作为抗原免疫小鼠后制备单克隆抗体，用胶体金颗粒进行标记得到金标单抗建立BRV 胶体金免疫层析快速诊断法，该方法仅需10 min 左右即可检出 BRV，最低检出量约为5.34 g/mL34。周华倩等制备用于检测牛支原体抗体的胶体金免疫层析试纸条，将该试纸条对实验室制备的123份血清以及临床样品库中142份血清进行检测，检测结果与商品化试剂盒检测结果比较，其中实验室制备的血清阳性符合率为100%，阴性符合率为89.61%；临床血清中阳性符合率为 90.12%，阴性血清符合率为 98.36%35。Stuart等使用检测BbigRAP1/CT17和BbovSBP4的ELISA试剂盒与免疫层析试纸条检测了从乌干达东部和中部地区获得的401个牛血样本种存在的双贝虫和牛巴贝虫抗体，经kappa分析显示两种检测方法结果具有一定相关性36。2.4在水产病害诊断中的应用华支睾吸虫又称肝吸虫，可导致胆管炎、胆囊炎、肝硬化、肝癌等严重的肝胆管疾病，是我国重点防治的人畜共患寄生虫之一37。孙恒昌等建立淡水鱼华支睾吸虫感染的胶体金免疫检测技术，该法用于检测草鱼血清样品中的特异抗体，能够快速检测和检测淡水鱼华支睾吸虫囊蚴感染，为人体肝吸虫的综合防治提供技术支撑38。病毒性神经坏死病（Viral nervous necrosis，VNN）是养殖海洋鱼类中最严重的病毒性疾病之一39。Shyam等建立快速检测VNN胶体金免疫层析试纸条，主要检测赤点石斑鱼神经坏死病毒，经试验证明该试纸条对病毒最低检测限为105.05TCID50/100 L，并于其他鱼类病毒不产生交叉反应，使用该法对脑组织样品进行检测，检测结果与荧光PCR检测结果作对比，其特异性为100%，灵敏性为94.92%，检测有效性高达96.81%40。3斑点金免疫渗滤法在动物医学诊断中的应用DIGFA在人体寄生虫病上的研究较多，如广州血管圆线虫病、棘球蚴病、颚口线虫病等，但也有学者将该法应用于动物寄生虫病中4143。程汉等将羊细粒棘球蚴包囊的新鲜囊液作为检测抗原包被于硝酸纤维素膜上建立羊细粒棘球蚴全血斑点金免疫渗滤法，该法对患病羊阳性血清的检出率为94.41%，对细粒棘球蚴感染小鼠的血清及全血检出率为100%，并于ELISA检测结果具有良好的一致性44。曹庭盛等将猪囊虫纯化抗原作为检测用抗原建立斑点金免疫渗滤法并对该法进行特免疫胶体金诊断技术在兽医的应用研究现状许楷惠，等专题综述 63异性、稳定性及重复性试验，结果显示该法对猪囊虫病的阳性检测率为100%，对于其他病的血清不产生阳性反应45。除了在寄生虫病的诊断中有应用，DIGFA在病毒性疾病及细菌性疾病也有应用研究。口蹄疫病毒（FootandMouth Disease Virus，FMDV）主要感染偶蹄动物，传染性强，血清型多，并且各血清型之间无交叉免疫保护性46。世界动物卫生组织将口蹄疫列为法定上报的动物传染病之一，我国将其列为一类动物传染病。孔繁德等建立口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体德斑点金免疫渗滤检测方法，使用该法与ELISA法同时对150份猪血清进行检测，两者检测结果符合率达99.3%47。布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是一种具有高度传染性的人兽共患病，动物感染此病会引起母畜传染性流产，对经济造成巨大损失。解玉文以布鲁氏菌外膜蛋白（BP26）和脂多糖（LPS）联合作为检测抗原建立斑点金免疫渗滤法，对畜牧交易市场采集的血清样本进行检测，同时与商品化胶体金免疫层析试剂盒作为对照检测，检测结果与商品化试剂盒的结果一致6。4小结与展望随着非洲猪瘟的发生，人们逐步意识到生物安全防控的重要性，并注重“防大于治”的理念。对于传染病的预防最主要的措施之一就是注射疫苗使动物体内产生抗体，定期监测动物血清中抗体水平确保疫苗免疫保护效果。常见的检测方法有ELISA、琼脂扩散实验、凝集试验、中和试验等，这些检测方法都需要在实验室内由专业人员进行检测，而适用于基层快速定量检测动物血清抗体水平的检测方法研究较少。目前关于免疫胶体金技术的研究主要是利用免疫胶体金技术对抗原或者抗体进行定性检测，凭借其反应迅速、操作简单、成本低、便携等优点，极大程度的解决了养殖场对动物疾病快速诊断的需求，但该技术还存在一些缺陷，如无法同时检测多份样品、检测结果仍会有假阴性或者假阳性等。并且利用该技术进行定量检测仍有一定难度，免疫层析法中待测液体以横向流动的方式与检测线结合，若用该法进行定量检测，在移动过程中待测液体会有所损耗，会造成定量检测结果的偏差。斑点金免疫渗滤法中待测液体利用微孔膜的可滤过性，以渗滤的方式透过微孔膜，在微孔膜上进行抗原抗体结合反应，此过程待测液体的损耗较少，更适合用于定量检测方法的建立，但这对检测的灵敏性、特异性、稳定性有较高要求。综上所述，免疫胶体金技术应用前景广阔，能够解决基层快速检测需求，但仍需对该法进一步研究，提高其检测的灵敏性以及特异性。已有研究将免疫胶体金技术结合新传感器技术，将利用胶体金技术检测产生的颜色转换为光密度来快速定量检测，随着对免疫胶体金技术的深入研究以及科研技术的发展，该技术能为基层快速定量检测抗原或抗体提供新方向4849。参考文献：1 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