辽吉侧金盏提取物的体外抗氧化及稳定性研究.pdf

人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期辽吉侧金盏(Adonis ramose Franch)属毛茛科植物袁全世界约有30 种袁主要分布于东半球的温带地区袁在我国大约有10 种1遥 辽吉侧金盏作为一种民间常用的药物袁由于其强大的强心作用袁在欧洲和中国已经使用了很长时间2-4遥 已从该属中分离出许多其它类型的化合物袁包括类黄酮5-6尧类胡萝卜素7-8尧香豆素9和脂肪酸10遥 该属的各种化学成分表现出多种药理活性如抗菌尧抗氧化尧消炎11尧抗血管生成12-13袁对中枢神经系统和利尿也有一定的作用14原15遥 辽吉侧金盏是一种早春花期较短的多年生草本植物袁 主要分布于中国东北部尧朝鲜半岛和日本等地16原17遥 近年来袁它的数量逐渐减少袁在日本被认为是濒危物种18遥 目前关于辽吉侧金盏成分分离和药理研究的报道很少遥 迄今为止袁仅有五种强心苷渊索马林尧铃兰毒甙尧加拿大麻甙尧K-毒毛旋花子甙和K-毒毛旋花子次甙-茁冤 和蔗糖从辽吉侧金盏中分离出来19-20遥目前袁对辽吉侧金盏的抗氧化及稳定性实验进行的研究很少遥 因此袁在本课题中我们将对此部分内容进行实验研究遥1 材料与方法1.1 材料与仪器2020 年4 月在辽宁省宽甸满族自治县采集辽吉侧金盏(凭证样本号:2020-04-12-001)袁经通化师范学院于俊林教授鉴定为辽吉侧金盏遥VDHG-9245A 型恒温箱袁 上海一恒科技有限公司曰TDL-5-A 型号低速大容量离心机袁上海安亭科学仪器曰HWS12 型电热恒温水浴锅袁上海一恒科技有限公司曰电热鼓风干燥箱袁上海一恒科学仪器有限公司曰HY-2 旋涡混匀仪袁 上海仪电科学仪器股份有限公司曰BSA224S-CW 型电子天平袁 赛多利斯科学仪器曰ReadMax1900Plus 型光吸收酶标仪袁上海闪普生物科技公司遥1.2 实验方法1.2.1 提取方法将辽吉侧金盏干燥处理后进行粉碎遥 称取缘 份20g 辽吉侧金盏粉末加入到圆底烧瓶中袁 分别加入200mL 丙酮溶剂尧200mL 乙酸乙酯溶剂尧200mL 乙醚溶剂尧200mL 二氯甲烷溶剂尧200mL 己烷溶剂袁在缘 种溶剂相对应的沸点下分别加热回流6h袁过滤袁将溶液蒸发到恒重袁对5 种溶剂提取物进行称重袁-20益储存遥1.2.2 DPPH 实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在515 nm 处记录辽吉侧金盏等样品的吸光度遥 实验使用BHT袁L-抗坏血酸和Trolox 为阳性对照遥 随后计算IC50值袁结果见表1遥1.2.3 ABTS 实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在734 nm 处记录辽吉侧金盏等样品的吸光度袁 结果见表1遥1.2.4 羟基自由基实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在492 nm 处记录辽吉侧金盏等样品的吸光度遥 随后计算IC50值袁结果见表1遥1.2.5 铁离子螯合实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在562nm 处记录对空白样品的吸光度袁 使用ED鄄TANa2 为阳性对照遥 随后计算IC50值袁结果见表2遥1.2.6 铜离子螯合实验参照文献22方法并在其基础上进一步加以改进遥在632 nm 处记录对空白样品的吸光度渊用水替换邻苯二酚紫冤袁 使用EDTANa2 为阳性对照遥 随后计算辽吉侧金盏提取物的体外抗氧化及稳定性研究郭 鑫1袁迟东泽3袁闫 颖4袁臧 皓1*袁夏广清2*(1.通化师范学院医药学院袁通化 134002曰2.通化师范学院长白山生物种质资源研究院袁通化 134002曰3.吉林省药品审核查验中心袁长春 130062曰4.通化医药健康职业学院袁通化 134002)摘要院 以辽吉侧金盏不同溶剂提取物为研究对象袁 对其进行体外抗氧化活性及稳定性研究袁 包括DPPH尧ABTS尧羟基自由基清除实验尧超氧自由基清除实验尧铁离子螯合实验尧铜离子螯合实验尧CUPRAC尧FRAP 实验尧H2O2实验尧HClO 实验尧茁-胡萝卜素漂白实验以及油脂稳定性实验等遥 结果表明袁辽吉侧金盏丙酮提取物的体外抗氧化能力及稳定性均较好袁以期为其进一步的开发和应用提供理论基础遥关键词院辽吉侧金盏曰提取物曰抗氧化曰稳定性研究基金项目院吉林省中医药管理局项目渊2023089冤曰通化师范学院科研基金项目(2022031ND)遥作者简介院郭鑫袁女袁硕士袁助教袁研究方向院中药物质基础研究遥*通信作者院臧皓袁男袁博士袁教授袁研究方向院中药有效成分结构修饰研究遥 E-mail院zanghao_.夏广清袁女袁博士袁教授袁研究方向院中药有效成分分离及活性测定研究遥 E-mail院.DOI院10.19403/ki.1671-1521.2023.园4.00515人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期IC50值袁结果见表2遥1.2.7 FRAP 实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在595 nm 处记录辽吉侧金盏等样品的吸光度袁 实验使用BHT 和Trolox 为阳性对照遥 FRAP 表示为Trolox等效抗氧化能力(TEACFRAP)袁结果见表2遥1.2.8 CUPRAC 实验参照文献21方法并在其基础上进一步加以改进遥在450nm 处记录辽吉侧金盏等样品的吸光度袁实验使用BHT 和Trolox 为阳性对照遥 CUPRAC 表示为Trolox等效抗氧化能力(TEACCUPRAC)袁结果见表2遥1.2.9过氧化氢实验参照文献23方法并在其基础上进一步加以改进遥在504nm 处记录空白样品的吸光度(用水代替苯酚溶液)袁阿魏酸为阳性对照袁计算IC50值袁并以平均值依标准偏差(单位院滋g 窑 mL-1)表示遥 结果见表3遥1.2.10次氯酸实验参照文献23方法并在其基础上进一步加以改进遥在350nm 处记录空白样品的吸光度(用水代替牛磺酸和次氯酸)袁实验使用Trolox 和硫辛酸为阳性对照袁计算IC50值袁 并以平均值依标准偏差(单位院滋g 窑 mL-1)表示遥 结果见表3遥1.2.11 茁-胡萝卜素漂白实验参照文献23方法并在其基础上进一步加以改进遥 按照方程式计算抗氧化活性系数(AAC)袁结果见表3遥AAC=AA(120)-AC(120)AC(0)-AC(120)伊员园园园1.2.12 丙酮提取物的稳定性实验pH 值稳定性院参照文献中的方法评估丙酮提取物的pH 值稳定性袁并稍作修改遥 使用溶解在去离子水中的提取物进行酸性/碱性稳定性研究遥 用1mol 窑 L-1HCl和1mol 窑 L-1NaOH 调节至不同的pH 值(1尧3尧5尧7尧9 和11)袁室温培养1h 后袁将混合物的pH 值调节至7袁并在样品中检查TPheC 和ABTS 清除能力遥热稳定性院为了测量热稳定性袁将丙酮提取物溶解在去离子水(50mg 窑 mL-1袁pH越7)中袁装有溶液的螺旋盖试管密闭后袁置于沸水浴(100益)中遥 0尧15尧30尧60尧120尧180 和240 min 后袁将样品在冰水中冷却袁并在样品中检测TPheC 和ABTS 清除能力遥胃肠道模型系统的稳定性院参照文献的方法进行丙酮提取物的消化过程模拟实验遥 混合物在37益(胃环境)下培养3 h遥 在0尧0.5尧1耀4 h 取样用于测定模拟胃肠消化过程中丙酮提取物的TPheC 和ABTS 清除能力遥1.2.13 细胞活性测定使用MTT 测定法测试TM3 细胞活力遥 将100滋L细胞悬浮液接种到微孔板上袁并在CO2培养箱中培养24h遥 培养后袁加入100滋L 丙酮提取物遥 每组设置五个重复孔遥 无细胞培养基为空白组遥 培养24h 后袁加入20滋L MTT 溶液并在37益下培养4h遥 除去培养基袁加入200滋L DMSO 溶解后袁在570nm 处测定吸光度遥1.3统计分析所有实验重复进行三次遥 数据最后使用SPSSv22.0 和Origin 8.0 进行统计分析遥2 结果与讨论2.1 结果2.1.1 DPPH尧ABTS 和羟基自由基实验表1 显示了丙酮尧乙酸乙酯尧乙醚尧二氯甲烷和己烷五种溶剂提取物清除自由基的活性遥其中丙酮提取物表现出最强的DPPH(IC50为258.9依0.0滋g 窑 mL-1)袁乙酸乙酯提取物具有最高的羟自由基清除活性(IC50为387.1依5.7滋g 窑 mL-1)袁 己烷提取物在ABTS 实验中显示出最好的活性(IC50为192.7依2.8滋g 窑 mL-1)遥郭 鑫等院辽吉侧金盏提取物的体外抗氧化及稳定性研究Extracting solventsDPPH(IC50,滋g/mL)ABTS(IC50,滋g/mL)Hydroxyl radical(IC50,滋g/mL)Acetone258.9 依 0.0d500e2500gEthyl acetate1478.5 依 7.3f449.3 依 2.7d387.1 依 5.7dEthylether1103.6 依 4.1e500e1281.8 依12.7eDichloromethane5000h500e2500gHexane1550.0 依148.9g192.7 依 2.8c2137.1 依 10.7fL-Ascorbic acid10.7 依 0.0a3.7 依 0.1a92.6 依 0.2aTrolox12.1 依 0.0b3.5 依 0.1a134.3 依 1.9bBHT111.8 依 0.1c4.5 依 0.0b244.0 依 1.7cCurcumin1N.T.N.T.N.T.表 1 DPPH袁ABTS袁Hydroxyl radical 和 Superoxide radical 实验2.1.2 金属离子螯合能力尧FRAP尧CUPRAC 实验对辽吉侧金盏提取物的铁和铜的螯合能力进行了实验遥 其中丙酮提取物表现出最高的铜螯合能力袁丙酮提取物的FRAP 最高(0.19依0.00 TEACFRAP)以及CUPRAC 最高(0.14依0.00 TEACCUPRAC)遥 结果表明袁丙酮提取物可能是一种有效的螯合剂遥16人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期表 2 Iron chelating尧Copper chelating尧FRAP 和 CUPRAC 实验Extracting solventsIron chelating(IC50滋g/mL)Copper chelating(2000 滋g/mL)TEACFRAPTEACCUPRACAcetone5000b28.7 依 1.1b0.19 依 0.00c0.14 依 0.00cEthyl acetate5000b9.8 依 0.7e0.12 依0.00d0.12 依0.00eEthylether5000b20.9 依 1.9c0.11 依0.00e0.13 依 0.01dDichloromethane5000b6.4 依 0.5f0.08 依0.00g0.04 依 0.01gHexane5000b16.4 依 0.7d0.10 依0.00f0.10 依 0.01fEDTANa212.3 依 0.1a98.6 依 0.9aN.T.N.T.Trolox1N.T.N.T.1.00 依 0.01a1.00 依 0.01bBHT1N.T.N.T.0.31 依 0.00b1.53 依 0.01a表 3 H2O2尧HClO尧茁-胡萝卜素漂白实验Extracting solventsH2O2(3500 滋g/mL)HClO(909 滋g/mL)茁-CaroteneAACAcetone59.3 依 1.1b5.6 依 0.1f513.8 依 4.9dEthyl acetate50.0 依 1.3c10.3 依 0.1e626.8 依 5.7bEthylether39.5 依 2.1d16.6 依 0.3c547.5 依 4.9cDichloromethane41.8 依 2.1d18.9 依 0.3b502.9 依 3.7eHexane30.3 依 1.5e11.1 依 0.2d486.2 依 3.9fBHT1N.T.N.T.877.7 依 4.9aTBHQ1N.T.N.T.881.6 依 7.2aTrolox1N.T.98.8 依 0.1aN.T.Lipoic acid1N.T.99.5 依 0.8aN.T.Ferulic acid199.1 依 0.6aN.T.N.T.2.1.3H2O2尧HClO 和茁-胡萝卜素漂白实验测试了辽吉侧金盏提取物清除活性氧(ROS)H2O2和HClO 的能力遥 表3 中显示了丙酮尧 乙酸乙酯尧乙醚尧 二氯甲烷和己烷5 种溶剂提取物相对应的IC50值遥其中丙酮提取物显示出最高的H2O2清除能力(IC50为59.3依1.1滋g 窑 mL-1)袁 二氯甲烷提取物显示出最高的HClO 清除能力(IC50为18.9依0.3滋g 窑 mL-1)遥茁-胡萝卜素乳剂的吸光度随时间降低袁乙酸乙酯提取物(抗氧化活性系数AAC 为626.8依5.7)对茁-胡萝卜素的保护效果最好遥2.1.4稳定性实验植物提取物的抗氧化活性一直是许多科学研究的重点遥 然而袁关于胃肠道消化尧pH 值和温度对植物提取物影响的研究很少遥 在胃肠道消化过程中袁各种生物活性成分将从食物中释放出来遥 决定膳食抗氧化剂有效性的一个关键因素是它们在胃肠道条件下的稳定性遥此外袁温度和pH 值的变化可能导致结构的变化袁从而影响抗氧化剂的活性遥丙酮提取物中各种活性成分的含量非常高袁并且该提取物具有较好的抗氧化活性遥 因此袁选择丙酮提取物进行进一步的稳定性研究(图1-6)遥 pH 稳定性结果表明袁 丙酮提取物的TPheC 和ABTS 清除能力对pH 值的变化稳定遥 热稳定性结果表明袁TPheC 和ABTS 清除能力在较高温度下保持稳定遥 然而袁经过一段时间后袁TPheC 逐渐降解遥 体外消化稳定性结果表明袁TPheC 在胃部条件下通常最高袁 因为强酸性环境有利于酚酸的溶解袁这与文献报道一致遥 然而袁过量的酸对包含ABTS 的实验系统有明显影响袁 不过ABTS清除能力可以在十二指肠条件下恢复遥 通过稳定性实验结果我们可以看出袁辽吉侧金盏的丙酮提取物具有较好的pH 稳定性尧热稳定性和胃肠道稳定性袁为其成为抗氧剂提供一定的理论基础遥图 1 通过 TPheC测定法监测丙酮提取物的 pH稳定性图 2 通过 ABTS 测定法监测丙酮提取物的 pH稳定性17人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期图 7 丙酮提取物处理 24h 和 48 h 的 TM3 细胞形态图3通过TPheC测定法监测丙酮提取物的热稳定性图4 通过ABTS测定法监测丙酮提取物的热稳定性图 5 通过 TPheC 测定法监测丙酮提取物的体外消化稳定性6 通过 ABTS 测定法监测丙酮提取物的体外消化稳定性2.1.5细胞活力测定实验用丙酮提取物处理24 h 和48 h 的细胞形态(图7)遥 培育24 h 和48 h 后袁丙酮提取物在低浓度下显示出非常弱的细胞毒性(表4)遥18人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 4 期Aetoneextract(滋g/mL)Cell survival rate(%)?24h?48h25100.3依1.586.2依2.55091.3依0.876.0依1.410076.4依3.357.7依2.320068.1依2.954.1依2.3表 4 使用 MTT 测定法测定丙酮提取物的毒性3 结论通过上述体外的抗氧化和稳定性实验袁 结果表明袁辽吉侧金盏的五种溶剂渊丙酮尧乙酸乙酯尧乙醚尧二氯甲烷尧己烷冤提取物均具有良好的体外抗氧化活性袁丙酮提取物具有较好的pH 稳定性尧热稳定性和胃肠道稳定性以及低细胞毒性遥 因此袁辽吉侧金盏具有深入研究的价值袁本实验中仅探讨了部分的体外抗氧化活性及稳定性实验袁可进一步进行体内的相关活性实验袁以期为其进一步的开发和利用奠定坚实的理论基础遥参考文献1中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第 28 卷)M.北京:科学出版社,1980,252-252.2杨文慧,张小伟,徐文进,等.侧金盏属植物药学研究新进展J.农业科学与技术,2015,16:626-629.3Shikov AN,Pozharitskaya ON,Makarov VG,et al.Journal of Ethnopharmacology.Medicinal plants of theRussian pharmacopoeia;their history and applicationsJ.2014,154:481-536.4Hosseini M,Taherkhani M,GhorbaniNohooji M.Introduction of Adonis aestivalis as a new source of 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