降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌的筛选及工艺优化.pdf

辽宁农业科学 2023(4):1724Liaoning Agricultural Sciences文章编号:1002-1728(2023)04-0017-08 doi:10.3969/j.issn.1002-1728.2023.04.004降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌的筛选及工艺优化王 媛1,韩艳秋2,吕连营3,高 雅2,郭 峰3,吴娜娜1,王 琛1,2(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁 沈阳110161;2.辽宁省农业科学院食品与加工研究所,辽宁 沈阳110161;3.沈阳山山伟业食品有限公司,辽宁 沈阳 110419)摘要:初加工的山楂汁中柠檬酸含量丰富,严重影响了山楂汁的口感。试验选用 6 株乳酸菌,以柠檬酸降解率为指标,筛选降解柠檬酸能力强的乳酸菌,并以其混菌发酵剂发酵山楂汁,采用响应面法对其工艺进行优化。试验结果表明,短乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠 3 株菌株具有较好降酸能力,以 3 株菌株 1 1 1 比例制成混菌发酵剂发酵山楂汁,最佳发酵降酸工艺为发酵温度 34.3、接种量 3%、发酵天数 1.8 d。经发酵后,山楂汁的柠檬酸、苹果酸含量下降,营养成分提高,色泽状态良好。关键词:乳酸菌;降酸;柠檬酸;山楂汁;发酵工艺中图分类号:TS255.44文献标识码:B 山楂是蔷薇科山楂属类植物的果实,别称红果,是我国药食两用的果品1。山楂不仅品种繁多,而且营养成分和生物活性物质丰富,使得山楂及山楂制品具有较高食用价值、保健价值和药用价值2。山楂中有机酸,特别是柠檬酸含量丰富,使山楂鲜果口感酸涩,不适宜鲜食。所以在生产加工过程中为保持良好的糖酸比往往向产品中加入大量的蔗糖,这不符合现代人低糖低脂的饮食需求35。因此,降低山楂中的有机酸含量,研究出低酸感,口味柔和的山楂产品成为热点话题。目前,果汁的降酸方法主要包括生物降酸法、物理降酸法和化学降酸法等68。生物降酸法具有原料天然,无添加兼具能改善发酵制品风味的优点,被广泛研究9。有研究表明乳酸菌可以利用有机酸作为碳源10,Martina Cirlini 等研究了用乳酸菌发酵接骨木汁时的酸性和糖分变化,发现在酸浓度较高的环境下乳酸菌会优先消耗环境中的有机酸,而非传统代谢中的游离糖并且接骨木汁中的柠檬酸可以被干酪乳杆菌降解11。Yuan-shan Yu 等研究用发酵乳杆菌发酵青梅果实,结果表明在发酵乳杆菌能有效消耗柠檬酸并且发酵后青梅果实颜色和硬度等也保持良好状态12。因此,本文以山楂汁为研究对象,筛选能够将山楂汁中口感刺激的柠檬酸转化为口感柔和的乳酸,降低山楂汁酸感的乳酸菌13,并通过响应面试验优化得到降解柠檬酸的最佳试验方案,测定乳酸菌发酵前后山楂汁的理化指标,以期为乳酸菌发酵得到低酸感山楂汁产品提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料山楂选择购自山东临朐的金星山楂。挑选果型大小一致、无病虫害,无明显机械损伤、色泽鲜艳大小一致的新鲜山楂果实。菌种来源:由辽宁省农业科学院提供的 1 株植物乳杆菌 LNJ005 及购于北京北纳创联生物科技有限公司的 5 株乳酸菌及编号如下:柠檬明串珠 菌(BNCC 194779)、干 酪 乳 杆 菌(BNCC 134415)、短乳杆菌(BNCC 337373)、瑞士乳杆菌(BNCC 189793)、嗜酸乳杆菌(BNCC 186447)。1.2 试验试剂葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、乙酸钠(北京奥博星生物技术有限公司);柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸镁、吐温-80、琼脂、磷收稿日期:2023-03-13基金项目:辽宁省农业科学院学科建设计划(2019DD123418)作者简介:王媛(1998-),女,硕士研究生,研究方向为果蔬加工。E-mail:1505373129 通讯作者:王琛(1979-),女,博士,副研究员,研究方向为果蔬加工。E-mail:wangchen0913 辽 宁 农 业 科 学 2023 年酸、磷酸二氢钾、氯化锰、柠檬酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、四水酒石酸钾钠、亚硫酸钠、过氧化氢、苯酚(国药集团化学试剂有限公司);甲醛(天津科茂化学试剂有限公司)。1.3 菌株活化在无菌条件下,在-80 冰箱中取出甘油保藏好的乳酸菌菌株,接入 MRS 培养基(MRS 培养基的制备:葡萄糖 20.0 g,蛋白胨 10.0 g,酵母浸粉 4.0 g,牛肉膏 10.0 g,乙酸钠 5.0 g,柠檬酸三铵 2.0 g,磷酸氢二钾 2.0 g,硫酸锰 0.04 g,硫酸镁 0.2 g,吐温-80 1.0 g,琼脂 20.0 g(固体培养基添加)蒸馏水 1.0 L,121 下灭菌 20 min。中活化并传代 2 次后备用。1.4 山楂果汁预处理参考 Lin Zhu 等的方法,稍加修改,将山楂:水质量比为 1 3 的比例在破壁机中进行破碎打浆后过滤,经 120,15 min 灭菌后,得到山楂培养基备用14。1.5 菌种的驯化参考王丽等的方法,稍加修改,将培养好的菌种按照山楂汁:液体培养基比例为 0 10、2 8、4 6、6 4、8 2、10 0 的比例接种,在同比例培养基中传代两次后接入下一个培养基比例继续进行驯化培养,最终得到完全以山楂汁为培养基的驯化菌种,菌种每次接种量为 2%,在 37 下培养 24 h15。1.6 乳酸菌生长曲线的测定将 6 株试验菌株在 MRS 培养基中培养 24 h,调节 OD 600 值至 1.00,以 2%的接种量接入液体培养基中,每隔2 h 分别测定 OD 600,绘制各个菌株的生长曲线。1.7 降酸乳酸菌的筛选1.7.1 试验菌株在模拟体系中降酸能力的分析参考李静的方法吸取 2 ml 处于对数末期的均匀菌液于离心管中,以 8 000 rpm 转速离心,得到菌体用0.9%生理盐水洗涤2 次,转接入柠檬酸乳酸转化的反应体系中16。反应体系:0.05 M KH2PO4-H3PO4缓冲液(pH 3.5)2 ml100 M MnCl2 0.1 ml50 mM 柠檬酸 0.5 ml柠檬酸降解率=(反应前柠檬酸含量-反应后柠檬酸含量)反应前柠檬酸含量100%柠檬酸采用 HPLC 法测定:称取果汁试样约5 g 定容于 50 ml 容量瓶中,过 0.45 m 滤膜后装入样品瓶。使用色谱柱为 Inertsil ODS-3 柱;流动相为 0.1 mol/L 磷酸二氢铵溶液(pH=2.4),设置流速为 0.6 ml/min,检测波长为 210 nm,色谱柱温度为 40,进样体积为 10 l。1.7.2 试验菌株在山楂汁中降酸能力的分析参考尹蓉等的方法,稍加修改,将 6 株试验菌株培养至对数生长期,以 2%的(v/v)的接种量接入山楂汁培养基中在 37 下培养 2 d 并测定反应前后柠檬酸含量并计算山楂汁中柠檬酸降解率17。1.8 制备混菌发酵剂乳酸菌混菌发酵能借助微生物间的互生关系,使微生物活性增加,改善果汁口感,提高果汁贮藏品质18。不同菌株的生长发酵周期不同,混菌发酵能有效提高发酵效率。将筛选出具有良好降酸能力的 3 株乳酸菌,以 1 1 1 的比例制成混菌发酵剂发酵山楂汁。1.9 乳酸菌降酸单因素实验选取对数期的乳酸菌,以山楂培养基为原料进行降酸研究。以柠檬酸降解率为指标,考察接种温度为 34,发酵天数为 1 d,接种量为(1%,2%,3%,4%,5%)时的柠檬酸降解率;发酵天数为 1 d,接种量为2%,温度为(25,28,31,34,37)时的柠檬酸降解率;温度为 34,接种量为 2%,发酵天数为(1 d,2 d,3 d,4 d,5 d)时的柠檬酸降解率。1.10 响应面优化试验基于单因素试验结果,进一步采用 Box-Be-hnken Design(BBD)试验设计进行响应面优化试验,确定最佳发酵工艺。表 1 响应面试验设计Table 1 Design of response surface test水平因素A接种量(%)B发酵温度()C发酵天数(d)-12311033421437381第 4 期 王 媛等:降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌的筛选及工艺优化1.11 有机酸的测定采用 GB 5009.157-2016 测定样品中柠檬酸、乳酸、苹果酸和酒石酸含量。1.12 理化指标测定1.12.1还原糖参考钱籽霖的方法,稍加修改,将山楂稀释 20 倍,取 1 ml 稀释后的山楂汁加1 ml 蒸馏水加入 2 ml DNS 试剂,沸水浴 5 min 后流水冷却,定容至 25 ml。在 540 nm 处测定吸光值,回 归 方 程 为:y=0.7439x-0.0164,R2=0.99518。1.12.2 氨基态氮采用 GB/T 12143-2008 测定样品中氨基态氮含量。1.12.3 电导率参考 Zou,Y 的方法,采用雷磁公司生产的 DDS-037 型电导率仪测量样品的电导率20。1.12.4 色度 参考龚小洁的方法,采用美能达CR-221 色度计测定样品的色度值21。2 结果与分析2.1 试验菌株的生长曲线的测定试验菌株的生长曲线如图 1 所示,其中植物乳杆菌达到稳定时期 OD 值较大,即细胞数最多,植物乳杆菌扩大培养生长状况最好,而干酪乳杆菌,瑞士乳杆菌,柠檬明串珠菌达到稳定期时 OD值低于植物乳杆菌,3 株乳酸菌达到稳定期时的OD 值较为接近。短乳杆菌,嗜酸乳杆两株试验菌株在 MRS 液体培养基中的生长能力相对较弱,生长较为缓慢。柠檬明串珠菌达到最大 OD 值时,所用时间最短,生长速度最快,所以可以判断出柠檬明串珠菌前期发酵能力较强,所需发酵时间要短于其他菌株。2.2 试验菌株在模拟体系中柠檬酸转化能力测定在柠檬酸转化体系中,不同种类的乳酸菌对柠檬酸降解的效果各有不同。由图 2 可知干酪乳杆菌和短乳杆菌在柠檬酸反应体系中对柠檬酸降解率较高,其中短乳杆菌虽然生长能力弱于其他菌株,仍然表现出对柠檬酸较高的降解率。柠檬明串珠菌对柠檬酸降解率要显著高于瑞士乳杆菌和嗜酸乳杆菌(p0.05)。植物乳杆菌对柠檬酸的降解率最低。干酪乳杆菌在柠檬酸反应体系中表现了较好的柠檬酸降解率,但在山楂汁中柠檬酸降 解 率 显 著 低 于 短 乳 杆 菌 和 干 酪 乳 杆 菌(p0.05)。这可能是因为反应环境的变化导致了柠檬酸降解率的差异。综上,选出具有较好降酸能力的 3 株乳酸菌分别为:短乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串株菌,将 3 株菌种制备为混菌发酵剂进行响应面试验。图 1 试验菌株在 MRS 液体培养基中的生长曲线Figure 1 The growth curve of test strains in MRS liquid mediums91辽 宁 农 业 科 学 2023 年图 2 不同试验菌株在模拟体系中柠檬酸降解率Figure 2 Acid reducing rates of citric acid by different test strains图 3 不同试验菌株对山楂汁中柠檬酸降解率的影响Figure 3 Effect of test strains on the citric acid content of hawthorn juice2.4 单因素试验及结果分析由图 4 可知,当发酵温度为 34,发酵天数为 2 d 时,随着接种量的增加,乳酸菌发酵山楂汁中柠檬酸降解率呈现出先升高后降低的趋势。当接种量达到 3%时,发酵山楂汁的柠檬酸降解率最高。综合考量选择 2%4%作为适宜接种量。图 4 接种量对发酵山楂汁柠檬酸降解率的影响Figure 4 Effect of strain proportion on citric acid con-tent of hawthorn juice由图5 可知,当接种量为2%,发酵天数为2 d时,随着发酵温度的增加,乳酸菌发酵山楂汁的柠檬酸降解率呈现先升高后降低的趋势。当发酵温度达到 34 时,发酵山楂汁的柠檬酸降解率最高。温度的变化对菌种的降酸效果有较大的影响,合适的发酵温度能够使乳酸菌对柠檬酸代谢降解有效的进行。这可能和菌体本身在不同温度下代谢产生的酶量和酶活力有关。综合考量选择3137 作为适宜发酵温度。由图 6 可知,当发酵温度为 34,接种量为2%,发酵天数不同对发酵山楂汁中柠檬酸降解率的影响。随着发酵天数的增加,山楂汁中柠檬酸降解率呈现先升高后降低的趋势。当发酵天数为2 d 时,山楂汁的柠檬酸降解率最高,而后随着发酵天数的增加山楂汁柠檬酸降解率降低。综合考量选择发酵天数为:13 d。图 5 发酵温度对发酵山楂汁柠檬酸降解率的影响Figure 5Effect of fermentation temperature on citric acid content of hawthorn juice02第 4 期 王 媛等:降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌的筛选及工艺优化2.5 响应面试验结果分析2.5.1 响应面优化发酵工艺试验表 2 显示了发酵温度(A)、接种量(B)和发酵天 数(C)的 响 应 面 试 验 方 案 和 结 果。图 6 发酵天数对山楂汁柠檬酸降解率的影响Figure 6 Effect of fermentation time on citric acid con-tent of hawthorn juice表 2 响应面试验设计及结果Table 2 Orthogonal test results and analysis of fermen-ted hawthorn juice试验号A 发酵温度()B 接种量(%)C 发酵天数(d)柠檬酸降解率(%)100013.6254021015.02964300013.1764040-1-18.565545-1-106.541256-1016.08143710-19.674648-1108.81018900013.327501001-110.71340111108.26464120-119.31018130117.2807114-10-15.266961500012.63140161-108.006791700013.47630由表 3 的方差分析结果可知,试验数据经多元回归分析,得到发酵山楂果汁综合评分(Y)对发酵温度(A)、接种量(B)和发酵天数(C)的回归方程 为:综 合 评 分(Y)=13.25+0.5345A+0.3306B-0.8148C-0.5028AB-1.36AC-1.04BC-3.90A2-1.44B2-2.84C2。该试验模型极为显著(p0.05),调整拟合优度(R2adj=0.9640),该回归方程具有良好的拟合度和可信度。根据 F 值可以判断 3 个因素对综合评价指数的影响为:发酵天数(C)发酵温度(A)接种量(B)。2.5.2 最佳发酵工艺的确定两因素之间的响应面曲线如图 7图 9 所示。通过分析可知,发酵温度(A)、接种量(B)和发酵天数(C)任意两因素间的组合,其柠檬酸降解率均随着发酵条件的改变呈现先下降后升高的趋势,这与方差分析结果一致,说明本试验参数选择合理。求得最佳发酵工艺参数为:发酵温度为34.276、接 种 量 为 3.169%、发 酵 天 数 为1.802 d。优化预测得到发酵山楂汁柠檬酸降解率为 13.380%。对参数进行简化,设置发酵温度34.3、接种量 3%、发酵天数 1.8 d,经过 3 次实验,柠檬酸降解率为 13.23%,与模型预测理论值13.380%基本一致,说明本模型可信度高。2.6 乳酸菌发酵对山楂汁中有机酸的影响用响应面试验得到的最优试验方案发酵山楂汁并测定山楂汁发酵前后的有机酸。结果如表 4所示,山楂汁中柠檬酸含量在 HP 组和 FHP 组间均有显著变化,发酵后的山楂汁中的柠檬酸含量显著低于未发酵时的山楂汁(p0.05)。2.7 乳酸菌发酵对山楂汁主要理化指标的影响乳酸菌发酵会改变山楂汁的理化性质,由表5 可知,发酵后山楂汁中还原糖含量有所下降,这是由于乳酸发酵过程消耗了糖类物质产生乳酸。随着山楂汁的乳酸发酵,山楂汁中的氨基态氮含量和电导率在逐步增加,氨基酸态氮含量反应了游离氨基酸的含量,电导率能反应果浆矿物质、维生素、蛋白质和脂肪酸等营养素的存在23,有研究表明乳酸菌在发酵过程分解蛋白质以产生氨基酸和衍生物,为发酵产品提供特定的风味,丰富发酵物的营养成分24,这与 Ma Li 等的研究结果一致25。颜色是最重要的食品参数之一26,据表12辽 宁 农 业 科 学 2023 年中色泽数据可得知发酵山楂汁相对于未发酵的山楂汁 的 L,b值 显 著 降 低,a值 显 著 增 加(p0.05),发酵后果汁色泽状态良好。表 3 响应面回归模型方差分析Table 3 Variance analysis table of regression model差异来源平方和自由度均方F 值P 值显著性模型138.32915.3748.550.0001A2.2912.297.220.0312B0.874610.87462.760.1404C5.3115.3116.780.0046AB1.0111.013.190.1171AC7.4517.4523.540.0019BC4.3614.3613.780.0075A263.98163.98202.09 0.0001B28.7818.7827.720.0012C233.87133.87106.99 0.0001残差2.2270.3166失拟项1.6330.54333.710.1190纯误差0.586140.1465总和140.5416R2=0.9842R2adj=0.9640 注:为极显著,p0.01;为显著,p0.05图 7 发酵温度和接种量的响应面曲线Figure 7Response surface curves of fermentation tem-perature and inoculation quantity图 8 发酵温度和发酵天数的响应面曲线Figure 8Response surface curves of fermentation tem-perature and fermentation time图 9 接种量和发酵天数的响应面曲线Figure 9 Response surface curves of inoculation quanti-ty and fermentation time表 4 乳酸菌发酵对山楂汁中有机酸的影响Table 4Effect of lactic acid bacteria fermentation on organic acids in hawthorn juice处理组柠檬酸(g/kg)乳酸(g/kg)苹果酸(g/kg)酒石酸(g/kg)HP2.40.06a-2.00.5a0.480.03aFHP2.10.08b0.470.09a1.80.07b0.500.06a 注:HP 为山楂汁,FHP 为发酵山楂汁22第 4 期 王 媛等:降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌的筛选及工艺优化表 5 乳酸菌发酵对山楂汁的主要理化指标的影响Table 5 Effect of lactic acid bacteria fermentation on main physical and chemical indicators of hawthorn juice处理组还原糖(g/L)氨基态氮(mg/100L)电导率(s/cm)色泽LabHP22.590.18a38.53.5b162326.06b21.750.96a3.80.30b7.820.27aFHP20.780.21b777a176719.86a18.910.35b4.760.29a6.500.40b 注:HP 为山楂汁,FHP 为发酵山楂汁4 结论本研究利用乳酸菌发酵将口感酸涩刺激的柠檬酸转化为口感柔和乳酸,降低山楂汁酸感。试验筛选出降解柠檬酸能力较强的乳酸菌:短乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠菌,作为混菌发酵剂并经响应面试验对发酵山楂汁工艺进行优化。得到最佳降酸工艺:发酵温度 34.3、接种量 3%、发酵天数 1.8 d。此条件下柠檬酸降解率为13.23%。发酵后山楂汁中柠檬酸含量,苹果酸含量降低。氨基态氮含量和电导率值升高,且果汁色泽状态良好,经乳酸菌发酵山楂汁的理化性状要优于未发酵山楂汁。参考文献:1 Zhang Juan,Chai Xiaoyun,Zhao Fenglan,et al.Food Applica-tions and Potential Health Benefits of HawthornJ.Foods,2022,11(18):2861.2 Xinman Lou,Bo Yuan,Lei Wang,et al.Evaluation of physico-chemical characteristics,nutritional composition and antioxi-dant capacity of Chinese organic hawthorn berry(Crataegus pinnatifida)J.International Journal of Food Science&Tech-nology,2020,55(4):16791688.3 Yan Huang,Haoyu Wang,Chuanhe Zhu.Effect of Lactic Acid Bacteria Fermentation on Antioxidation and Bioactivity of 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juice is rich in citric acid,which seriously affects the taste of haw-thorn juice.Six strains of lactic acid bacteria were selected for the test,and the citric acid degradation rate was used as an index to screen the lactic acid bacteria with a high ability to degrade citric acid,and ferment hawthorn juice with its mixed bacterial fermenter and optimize its process using response surface test.The test results showed that three strains of Lactobacillus brevis,Lactobacillus casei,and Leuconostoc citreum had bet-ter acid-reducing ability.The three strains were used to ferment hawthorn juice in a ratio of 1 1 1 to make a mixed-bacteria fermenter,and the best acid-reducing fermentation process was a fermentation temperature of 34.3,an inoculum rate of 3%,and a fermentation day of 1.8.After fermentation,the content of citric acid and malic acid in hawthorn juice decreased,the nutrient content increased,and the color status was good.Key words:Lactic acid bacteria;Acid reduction;Citric acid;Hawthorn juice;Fermentation process42