两细胞多核胚胎对活产结局的影响.pdf

生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期:1133.DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.08.001临床研究两细胞多核胚胎对活产结局的影响付涛1-2，朱家红1-2，刘军霞1-2，高洋1-2，郝向伟1-2，韩伟1-2，武丽红1.2（1.重庆市妇幼保健院生殖医学中心，重庆40 0 0 13;2.重庆医科大学附属妇女儿童医院，重庆40 1147）【摘要】目的观察解冻复苏单囊胚移植周期中移植两细胞多核胚胎来源囊胚对胚胎发育及活产结局的影响，探究两细胞多核胚胎来源囊胚的临床应用价值。方法回顾性分析2 0 2 0 年7 月至2 0 2 1年11月于重庆市妇幼保健院生殖医学中心进行解冻复苏单囊胚移植患者（共6 6 3 个周期)的临床妊娠和活产结局数据，并利用时差培养数据分析相应胚胎的胚胎发育数据。依据两细胞阶段是否存在多核现象分为两细胞无多核组（A组，n=547)和两细胞多核组（B组，n=116）；又根据多核现象的分布情况将两细胞多核组分为两细胞1细胞多核组（B1组，n=75）和两细胞2 细胞多核组（B2组，n=41），根据胚胎发育过程中多核现象的存在情况将两细胞多核组分为四细胞无多核组（B3组，n=96)和四细胞多核组（B4组，n=20）。比较A、B两组间的一般资料、胚胎发育情况、妊娠结局及新生儿情况。结果A、B两组患者的一般资料中除不同内膜准备方案（包括人工周期和自然周期）占比有显著性差异（P0.05）；两组间卵巢刺激天数、Gn剂量、扳机日雌二醇（E2)水平、子宫内膜厚度及获卵数等比较均无显著性差异（P0.05），仅不同受精方式（包括IVF、I CSI 和补救ICSI)占比有显著性差异（P 0.0 5）；两组间HCG阳性率、临床妊娠率、流产率、早产率、活产率及新生儿体重、身长及性别比均无显著性差异（P0.05）。多元回归分析结果表明B、B1、B2、B3 及B4组与A组间的临床妊娠率、流产率及活产率亦无显著性差异（P0.05）。结论两细胞多核对胚胎发育及其形成的囊胚移植后的活产结局均无明显不良影响，两细胞多核胚胎发育形成的囊胚仍具有一定的临床应用价值。【关键词】囊胚移植；两细胞多核胚胎；时差培养；胚胎发育；活产结局【中图分类号】R711.6Effects of two-cell multinucleated embryos on live birthFU Taol,ZHU Jia-hong,LIU Juraia-,GAO Yang,HAO Xiang-wei-,HAN Wei-,WU Li-hong*-1.Reproductive Medicine Center,Chongqing Health Center for Women&Children,Chongqingg4000132.Women and Childrens Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 401147【A b s t r a c t Objective:To observe the impact of blastocyst transfer which derived from two-cell multinucleatedembryo during the frozen-thawed single blastocyst transfer cycle on embryonic development and newbornstatus,and explore the clinical application values of blastocysts derived from two-cell multinucleatedembryo.Methods:The clinical outcomes and live birth outcome of 663 frozen-thawed single blastocyst transfercycles in the Reproductive Medicine Center of Chongqing Health Center for Women&Children from July2020 to November 2021 were retrospectively analyzed.The embryonic development data of thecorresponding embryos were analyzed by time-lapse data.According to whether multinucleation occurredat the two-cell stage,the transplanted blastocysts were divided into two-cell non-multinucleation group(group A,n=547)and two-cell multinucleation group（g r o u p B,n =116).T h e n,t h e t w o-c e l l【文献标识码】A【收稿日期】2022-12-17；【修回日期】2 0 2 3-0 3-13【基金项目】重庆市妇幼保健院院级项目（2 0 2 0 YJMS02,2020YJQN09）；重庆市渝中区基础研究与前沿探索项目（2 0 19 0 143）【作者简介】个付涛，男，湖北孝感人，硕士，助理研究员，生殖与发育生物学专业，（*通讯作者）.1134：multinucleation group was subdivided into two-cell with one cell multinucleation group(group Bl,n=75)and two-cell with two cells multinucleation group(group B2,n=41)according to the distribution ofmultinucleation.The two-cell multinucleation group was subdivided into four-cell non-multinucleationgroup(group B3,n=96)and four-cell multinucleation group(group B4,n=20)according to the presence ofmultinucleation during embryonic development.The basic data,embryonic development,clinical outcomeand newborn status were compared between group A and B.Results:There were no significant differences in the basic characteristics between A and B groups(PO.o5),except the proportion of different endometrial preparation protocols including artificial cycle andnatural cycle was significantly different(P0.05),but there was significant difference in the proportion of different fertilizationmethods(including IVF,ICSI,and rescue ICSI)(P O.05).There were also no significant differences in HCG positive rate,clinicalpregnancy rate,miscarriage rate,prematurity rate,live birth rate,neonatal weight,neonatal body length,and neonatal sex ratio between the two groups(P0.05).Besides,the multiple regression analysis resultsindicated that there were also no significant differences in clinical pregnancy rate,miscarriage rate,and livebirth rate between the group B,B1,B2,B3,B4 and group A(P0.05).Conclusions:Two-cell multinucleation had no adverse effects on embryonic development and the livebirth outcome of transplanted blastocysts derived from two-cell multinucleated embryos.The blastocystsderived from two-cell multinucleated embryos still have certain clinical application values.Key words:Blastocyst transfer;Two-cell multinucleation embryo;Time-lapse culture;Embryodevelopment;Live birth outcome(J Reprod Med 2023,32(08):1133-1139)如何挑选优质胚胎移植以改善辅助生殖的临床多核可能存在自我修复机制，并不影响临床结局7。结局一直是胚胎学家们关注的重点。胚胎形态学评目前，国内外胚胎多核对胚胎发育及临床结局影响分是业界公认的评分标准，主要通过胚胎细胞数目、的报道主要集中在囊胚形成率及临床妊娠率，对于大小、均一性、碎片及空泡等对胚胎进行评级，综合活产结局的报道较少。本研究通过时差培养系统实胚胎评级挑选出优质胚胎进行冷冻保存或移植1。时记录数据，观察两细胞胚胎和四细胞胚胎的多核早期胚胎发育过程中多核的出现是一种较为常见的情况，探讨移植两细胞多核胚胎来源囊胚对临床妊异常现象,在IVF周期中,早期胚胎多核的发生率娠及活产结局的影响，为两细胞多核胚胎形成囊胚更是高达7 9.4%，而且第2 天胚胎多核更常见2 。后的临床应用提供理论参考。随着时差培养（Time-lapse culture)技术的广泛资料和方法应用，胚胎生长发育的更多细节被实时记录下来3 。相较于传统光学显微镜观察胚胎，时差培养系统能够更加详细地捕捉到胚胎每个阶段的异常。胚胎多核现象并不是贯穿整个发育过程，基于时差培养系统,胚胎是否存在多核现象能够更准确地被判断。目前早期胚胎多核对胚胎的发育及临床结局影响的研究较多，但结果尚无定论。有的学者报道早期胚胎多核会导致胚胎染色体出现异常，进而影响胚胎着床率及临床妊娠率5-6 。也有学者认为早期胚胎生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期一、研究对象回顾性分析2 0 2 0 年7 月至2 0 2 1年11月于重庆市妇幼保健院生殖医学中心进行解冻复苏单囊胚移植患者（共6 6 3 个周期）的临床资料和活产结局，并利用时差培养数据分析相应胚胎的发育数据。依据两细胞阶段是否存在多核现象将其分为两细胞无多核组（A组，n=547)和两细胞多核组（B组，n=116)；同时，根据两细胞时多核现象的分布情况，将生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期两细胞多核组分为两细胞1细胞多核组（B1 组，n=75)和两细胞2 细胞多核组（B2组，n=41)2个亚组；另外，根据胚胎发育过程（两细胞发育至四细胞阶段)中多核现象的存在情况，将两细胞多核组又分为两细胞多核且四细胞无多核组（B3组，n=96)和两细胞多核且四细胞有多核组（B4组，n=20)2个亚组。本研究获重庆市妇幼保健院伦理委员会的批准。二、研究方法1.控制性促排卵与精液处理：根据女方卵巢储备情况及个体激素水平差异采用个性化控制性促排卵方案，包括长方案、拮抗剂方案以及其他常用方案。通过阴道超声和血清激素水平监测卵泡生长情况，当超声监测至少有3 个主导卵泡18 mm时，给予HCG（珠海丽珠）注射，并在注射后3 53 7 h取卵。男方提前禁欲3 7 d,取卵日手淫取精收集精液样本，经密度梯度离心法收集精子沉淀。2.体外受精与胚胎培养：采用IVF或者ICSI授精。IVF授精：患者在HCG注射3 9 40 h后行IVF授精，控制授精浓度约为1万条精子/50 l微滴,将卵母细胞转人微滴自然受精，46 h后观察到卵母细胞第二极体判断为受精。ICSI授精：取卵后2 h用透明质酸酶将卵母细胞周围的颗粒细胞脱除，并在3 6 h内完成ICSI授精。将IVF和ICSI授精形成的受精卵转人卵裂培养基（Gl，V it r o lif e，瑞典），经时差培养箱（Time-lapse，Em b r y o s c o p e 十，Vitrolife，瑞典)培养。在受精后第3 天，将胚胎转人囊胚培养基（G2，V i t r o li f e，瑞典）中继续培养至囊胚。3.胚胎卵裂球多核观察及胚胎质量评价：通过EmbryoViewer软件回溯移植囊胚的两细胞阶段和四细胞阶段，进行多核观察，同时观察第2 天各组胚胎的卵裂模式，包括正常卵裂和异常卵裂。培养至第3 天依据卵裂球均一性、碎片、胞质形态对胚胎进行形态学评分。培养至第5天和第6 天参照Gardner评分标准8 对囊胚进行评级，包括内细胞团和滋养层细胞评级。4.囊胚冷冻及解冻：采用玻璃化冷冻/解冻商品化试剂盒（Kitazato，日本）冷冻及解冻囊胚 9)。囊胚冷冻：提前通过激光打孔将囊胚皱缩，然后，将囊胚经ES液平衡9 min及VS液洗涤1min后，迅速转至冷冻载杆（Cryotop，日本）上，并置于液氮冷:1135.冻保存。囊胚解冻：从液氮中取出冷冻囊胚的载杆，并迅速置于TS液中1min（囊胚脱落至TS液），然后将囊胚依次转人DS液（3 min）、W S1 液（5 min）和WS2液（5 min），最后将囊胚转人 G2培养基中行激光辅助孵化，并培养2 4h后移植。5解冻囊胚移植及妊娠结局判断：冻融移植周期包括人工周期和自然周期。人工周期中，经B超监测子宫内膜厚度7 mm时，给予黄体酮（雪诺同，默克，德国支持3 d后解冻囊胚。自然周期中，经阴道超声监测子宫内膜厚度7 mm,排卵后Day5解冻囊胚。解冻单囊胚经B超引导行胚胎移植，胚胎移植后14d查血-HCG水平，移植后4周超声检测妊娠囊确定临床妊娠。妊娠12 周内的流产判定为早期流产，12 周之后的流产判定为晚期流产。最终出生的活胎即活产。三、统计学处理采用SPSS26.0进行统计学处理和分析。计量资料以均数士标准差（土s）进行统计学描述，组间比较采用t检验；计数资料采用相对数（率、比）进行统计描述，组间比较采用x检验。应用多元回归分析两细胞多核与临床妊娠及活产结局之间的关系。将不孕类型、不孕原因、促性腺激素（Gn)剂量、获卵数、受精方式、内膜准备方案、Day3可用胚胎数、Day3胚胎级别、囊胚时期及囊胚级别纳入回归模型中进行校正。当P0.05）。对两组间的不孕原因（包括盆腔输卵管因素、子宫内膜异位症、排卵机能障碍、不明原因、女性多因素、男性因素及男女混合因素)和不孕类型（包括原发不孕和继发不孕）占比进行统计，结果显示均无显著性差异（P0.05）。两组间不同促排卵方案（包括拮抗剂方案、长方案以及其他方案）占比也无显著性差异（P0.05），仅不同内膜准备方案（包括人工周期和自然周期）占比有显著性差异(P0.05)(表 1)。1136：组别周期数A组547B组116组别周期数盆腔输卵管因素A组547B组116组别周期数原发不孕A组547B组116注：与A组比较，*P0.05）。两组间的不同受精方式（包括IVF、ICSI和补救ICSI）占比具有显著性差异（P0.05)。在胚胎发育方面，两组间Day2胚胎卵裂模式（正常卵裂和异常卵裂)占比、组别周期数A组547B组116组别周期数A组547B组116组别周期数A组547B组116组别周期数A组547B组116生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期表1内两组患者一般情况比较(士s),n(%)平均年龄BMI/(kg/m)30.574.0922.003.1630.673.9621.943.24子宫内膜排卵机能异位症障碍360(65.81)20(3.66)74(63.79)3(2.59)不孕类型继发不孕260(47.53)287(52.47)66(56.90)50(43.10)表2 两组患者周期特征及胚胎发育情况比较（士s)，n(%)Gn刺激天数Gn 剂量/U9.271.591785.37663.729.241.631875.00721.24受精方式IVFICSI463(84.64)67(12.25)84(72.41)*26(22.41)*7细胞7细胞16(2.93)25(4.57)9(7.76)6(5.17)Day 3胚胎评级优质中等347(63.44)136(24.86)75(64.66)29(25.00)不孕年限4.713.194.843.48不孕原因女性不明原因多因素27(4.94)9(1.65)2(1.72)4(3.45)内膜准备方案人工周期自然周期拮抗剂方案540(98.72)7(1.28)110(94.83)*6(5.17)*Day3胚胎细胞数（包括0.05）(表2)。扳机日Ez/(pmol/L)861.10359.62873.36334.70补救 ICSI17(3.11)6(5.17)*Day3胚胎细胞数目8细胞375(68.56)72(62.07)Day3可用一般胚胎数64(11.70)6.083.0812(10.34)5.912.93AMH/(ng/ml)5.023.884.844.02男女混合男性因素因素52(9.51)42(7.68)9(7.76)14(12.07)促排卵方案长方案其他方案239(43.69)299(54.66)59(50.86)56(48.28)内膜厚度/mm8.811.528.91 1.67卵裂模式正常卵裂异常卵裂439(80.26)108(19.74)96(82.76)20(17.24)9细胞10细胞44(8.04)87(15.90)6(5.17)23(19.83)囊胚时期早期囊胚扩张期囊胚孵化期囊胚22(4.02)505(92.32)6(5.17)105(90.52)37(6.76)10(8.62)9(1.65)1(0.86)获卵数17.047.2217.416.6120(3.66)5(4.31)生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期组别周期数A组547B组116组别周期数A组547B组116注：与A组比较，*P0.05)；两组间新生儿体重、身长及性别比均无显著性差异（P0.05)（表3）。宫外孕率1.10(6/547)0新生儿体重/g3245.21541.873300.75436.52产率未表现出显著影响（P0.05)；分析4个亚组与A组发现，两细胞多核及四细胞多核不同情况对临床妊娠率、流产率及活产率亦未表现出显著影响(P0.05)(表 4)。临床妊娠率P值原始 OR(95%CI)0.6450.96(0.63,1.44)0.6060.89(0.55,1.46)0.9301.09(0.56,2.10)0.7560.96(0.61,1.49)0.0800.94(0.38,2.34)优质358(65.45)73(62.93)早期流产率13.39(45/336)11.43(8/70)新生儿身长/cm49.582.6149.901.27P值调整 OR(95%CI)1.00.8280.92(0.59,1.42)0.6460.93(0.55,1.57)0.8010.89(0.44,1.80)0.8520.84(0.52,1.36)0.8981.36(0.50,3.67)中等174(31.81)37(31.90)一般31(5.67)11(9.48)流产率晚期流产率4.46(15/336)2.86(2/70)新生儿性别比（男/女）145/12528/32P值0.7010.7960.7410.4830.542一般15(2.74)6(5.17)续表.1138:组别周期数原始 OR(95%CI)A组547B组116B1组750.71(0.29,1.70)B2 组410.88(0.30,2.55)B3组960.94(0.47,1.92)B4组20早期多核胚胎的发育潜能是现阶段关注的重点，探索早期多核胚胎的应用潜能是胚胎学家们研究的热点。早期胚胎多核发生的病因机理尚不明确，目前报道的可能与有丝分裂过程中细胞核分裂胞浆未分裂、细胞核的错误分裂、细胞核分裂过程中核碎片产生等有关10-11。有研究报道，早期多核胚胎通过胚胎植人前遗传学诊断（PGD)检测显示染色体异常率达3 9.9%，但是移植基因正常的早期多核胚胎能获得正常的健康婴儿12 。部分早期多核胚胎在后续的发育过程中可能通过自我修复，染色体恢复正常,避免了多核对胚胎带来的不利影响13 141。有研究报道,早期两细胞阶段多核胚胎与无多核胚胎的囊胚形成率无统计学差异（58.3%vs.65.2%)；同时，染色体正常的囊胚形成率（10 0%vs.75%)也没有统计学差异15。本研究结果显示，两细胞无多核组和两细胞多核组胚胎形态学参数如胚胎细胞数、评级及卵裂模式等无统计学差异（P0.05）；此外，两组间Day3优质胚胎率（6 3.44%vs.64.66%，P0.05)和优质囊胚率(45.7 0%vs.39.66%,P0.05)无统计学差异，说明两细胞多核胚胎具有良好的发育潜能形成囊胚。早期两细胞阶段胚胎中约有42.53%的胚胎出现多核现象，在这些两细胞多核胚胎中，大约有14%的胚胎发育到四细胞时仍然出现多核现象，73.4%的两细胞多核胚胎能够恢复正常状态，两细胞多核对胚胎着床率没有影响，而四细胞多核（至少有两个多核)胚胎的着床率略低16 。类似的，本研究中6 6 3 枚胚胎中两细胞多核胚胎有116 枚，两细胞胚胎多核率达17.50%；发育到四细胞阶段，四细胞多核胚胎有2 0 枚，四细胞胚胎多核率为3.0 1%，生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期流产率活产率P值调调整 OR(95%CI)1.00.77(0.38,1.54)0.4560.92(0.59,1.42)0.4360.75(0.31,1.83)0.8100.88(0.29,2.68)0.8731.02(0.49,2.11)一一讨论P值原始 OR(95%CI)0.7011.10(0.74,1.64)0.5231.05(0.65,1.71)0.8231.19(0.63,2.24)0.9661.03(0.66,1.58)一1.54(0.62,3.82)显著低于两细胞胚胎多核率，说明大部分两细胞多核胚胎在后续发育过程中有丝分裂染色体重构恢复正常；此外，本研究中两细胞多核胚胎发育至囊胚后移植的结果显示，两细胞胚胎多核对临床妊娠率、宫外孕率、流产率、早产率及活产率没有显著影响，2 0枚四细胞多核胚胎发育至囊胚移植后对临床结局亦没有显著影响，进一步证实胚胎多核存在自我修复机制，避免了多核对胚胎发育及着床带来的不利影响。早期胚胎多核对于胚胎发育及临床结局的影响屡有报道17-2 0 1，但是两细胞多核对于活产率及新生儿出生结局影响的报道较少。一项病例对照研究的结论为13 6 枚双核或多核胚胎解冻移植后的临床妊娠率虽然低于正常组，但是仍然获得了可接受的妊娠结局和健康的新生儿，妊娠孕周、新生儿出生体重、胎盘重量及新生儿先天性缺陷发生状况等没有显著差异2 1。本研究的临床数据同样显示，两细胞多核胚胎对活产率、新生儿体重、新生儿身长及新生儿性别比没有显著影响，提示两细胞多核胚胎发育至囊胚后移植对于活产及新生儿结局没有明显不良影响。从理论上讲，两细胞多核胚胎会增加胚胎染色体异常率及整倍性，从而对胚胎的发育及临床结局产生不利影响，然而，胚胎自身存在自我修复机制，能够一定程度上修复多核的延续，本研究结果证实了两细胞多核胚胎发育到四细胞时多核的比例明显降低；研究结果亦表明,两细胞多核胚胎对Day3优质胚胎率、优质囊胚率及其形成囊胚移植后的临床妊娠率、流产率、活产率及新生儿结局均无明显不良影响。但由于本研究为回顾性研究，仍然存在一些不足之处，比如未观察两细胞多核卵裂期胚胎与临床妊娠及活产结局的关系。因此，在卵裂期胚胎移P值调调整 OR(95%CI)1.00.6441.06(0.69,1.62)0.8321.10(0.66,1.84)0.5960.97(0.49,1.93)0.9080.89(0.56,1.42)0.3532.46(0.91,6.66)P值0.8010.7080.9400.6280.077生殖医学杂志2 0 2 3 年8 月第3 2 卷第8 期植过程中，建议优先选择没有多核的胚胎进行移植，两细胞多核胚胎可行囊胚培养,形成囊胚的两细胞多核胚胎仍具备临床应用价值。此外，随着产前遗传学诊断技术的广泛应用，有望进一步深人探讨两细胞及四细胞多核胚胎的临床应用价值。【参考文献】1 Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRESpecial Interest Group of Embryology.The Istanbulconsensus workshop on embryo assessment:proceedings of anexpert meetingJJ.Hum Reprod,2011,26:1270-1283.2Van Royen E,Mangelschots K,Vercruyssen M,et al.Multinucleation in cleavage stage embryosJJ.Hum Reprod,2003,18:1062-1069.3 Motato Y,de los Santos MJ,Escriba MJ,et 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