基于超滤管过滤联合二维液相色谱荧光法测定血浆中替考拉宁游离浓度.pdf

8Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.2基于超滤管过滤联合二维液相色谱荧光法测定血浆中替考拉宁游离浓度周建军1,2，何云山1,2，张 辉2，习 君3，王时云1,2，代青红1,2，彭国茳1,2*，王 峰4*（1.湘南学院附属医院，湖南 郴州 423000；2.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000；3.湖南德米特仪器有限公司，湖南 长沙 410205；4.中南大学湘雅二医院药学部，湖南 长沙 410011）摘 要：目的 建立超滤管过滤联合二维液相色谱荧光法测定血浆中替考拉宁游离浓度的方法，用于临床患者血液中游离低浓度替考拉宁的测定。方法 血浆样本经超滤离心管过滤后，取 150 L 下层滤液，加入 150 L 的 40%叔丁醇溶液后进样。采用“柱柱”二维模式分离，流动相为水（A，1.0 mmol/L 磷酸氢二铵水溶液，磷酸调 pH 至 7.40）、水（B，1.0 mmol/L 磷酸氢二铵水溶液，pH 为 3.00）、乙腈（C），发射波长 333 nm，灵敏度设置为“中”，增益为“4”，柱温为 40，进样量为 80 L。第一维色谱柱为苯基柱 SRC，流动相为 A B C=33 45 22(V/V/V)，流速：0.8 mL/min；第二维色谱柱为 C18柱 SCB，流动相为 A B C=23 40 37(V/V/V)，流速 1.2 mL/min。结果 替考拉宁在 0.550.0 g/mL 与峰面积线性关系良好（R2 0.999 8），定量限为 0.5 g/mL，相对回收率为 96.899.7。日内精密度 RSD 为 0.3%3.8%，日间精密度 RSD 为 0.3%3.5%。结论 建立的方法专属性强、操作简便、结果准确，可以用于临床多种合并用药情况下的替考拉宁血药浓度检测，为医生和药师临床剂量调整和个体化用药提供参考。关键词：超滤；二维液相色谱；替考拉宁；血药浓度中图分类号：R969.1 文献标志码：A 文章编号：1673-498X（2023）02-0008-06doi:10.16500/ki.1673-498x.2023.02.002Determination of teicoplanin free drug concentration in plasma by ultrafiltration tube combined with two-dimensional liquid chromatography fluorescence emission methodZhou Jianjun,He Yunshan,Zhang Hui,et al.(Affiliated Hospital of Xiangnan University,Chenzhou,Hunan 423000,China)Abstract:Objective To establish ultrafiltration tube combined with two-dimensional liquid chromatography fluorescence emission method for the determination of free teicoplanin plasma concentration.Methods Plasma samples were filtered through ultrafiltration centrifuge tube,150 L of the lower filtrate was taken and injected directly after 150 L of 40%tert-butanol solution.The mobile phases were water(A,1.0 mmol/L ammonium bisphosphate aqueous solution,pH adjusted to 7.40),water(B,1.0 mmol/L ammonium bisphosphate aqueous solution,pH=3.00)and acetonitrile(C).The emission wavelength was 333 nm，the sensitivity was set to“medium”,the gain was“4”,the column temperature was 40 ,and the injection volume was 80 L.The first dimensional column was phenyl column SRC,the mobile phase was A B C=33 45 22(V/V/V),and the flow rate was 0.8 mL/min.The second dimensional column was C18 column SCB with mobile phase as A:B:C=23 40 37(V/V/V)and flow rate as 1.2 mL/min.Results Teicoplanin showed good linearity with peak area at 0.550.0 g/mL(R2=0.999 8).The limit of quantitation was 0.5 g/mL and the relative recoveries were 96.8%99.7%.The intra-day precision RSD was 0.3%3.8%and the inter-day precision RSD was 0.3%收稿日期：2023-03-16基金项目：郴州市科学技术局科技创新能力培育计划（ZDYF2020169）；湘南学院校级科学研究项目（2021XJ82；2021XJ89）；湖南省自然科学基金科药联合基金项目（2021JJ80074）作者简介：周建军，男，副主任药师。*通信作者：彭国茳，男，主管药师，E-mail：；王 峰，男，主管药师，E-mail：wangfeng-LVCM。9湘南学院学报（医学版）2023 年 6 月第 25 卷第 2 期替考拉宁（teicoplanin，TEC）是一种新型糖肽类抗菌药物，由游动放线菌属发酵产生，通过作用于细菌细胞壁产生抗菌作用。替考拉宁在临床上主要用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，如耐万古霉素的肠球菌以及耐甲氧西林葡萄球菌，是继万古霉素后用于治疗多重耐药菌感染的重要抗生素之一 1-2。替考拉宁口服不吸收，蛋白结合率大于 90%，静脉注射给药后在体内较少代谢，主要以原型经肾排泄，消除半衰期较长且个体间变异大（t1/2为 30180 h）。肾功能不全能显著影响替考拉宁的血药浓度，会使替考拉宁的半衰期延长 4.514.5 d，同时还会使谷浓度升高 3。替考拉宁为时间依赖性抗生素，谷浓度与其疗效和安全性之间有一定的相关性，且谷浓度血药浓度监测应保证其维持在有效浓度以上 4。越来越多的研究证实，在高龄患者、重症患者等特殊人群中开展替考拉宁血药浓度监测是必要的 5。目前，文献报道有多种替考拉宁血药浓度的分析测定方法，如胶束电动毛细管色谱法、液相色谱-串联质谱法 3、微生物检定法 6 和高效液相色谱法等。在众多测定方法中，医院对替考拉宁血药浓度监测采用较多的是高效液相色谱法（HPLC）7。这些方法中，大多是采用乙腈沉淀蛋白测定血液中替考拉宁的总浓度。相比之下，超滤法适用于稳定型药物的游离浓度的常规分析，它可以利用扩散和浓度驱动过程，通过低吸附性亲水膜分离分子。替考拉宁游离药物浓度低，用普通液相紫外检测法很难检测到，而替考拉宁的荧光响应较紫外吸收高，目前湖南德米特的二维液相色谱系统是进行治疗药物监测的主流设备之一。近年来，不少文献报道使用此系统测定人血浆中的药物浓度，其具有在线处理能力，可使用大体积进样提高灵敏度。因此，本研究通过超滤管过滤联合二维液相色谱荧光法测定替考拉宁游离药物浓度，旨在为替考拉宁的临床剂量调整和个体化用药提供参考。1 材料1.1 仪器二维液相色谱（2-dimensional liquid chromatography，2D-LC）系统 FLC2701 系列（湖南德米特仪器有限公司）；GR-202 电子分析天平（日本 AND）；电热恒温水浴锅（上海标隆仪器有限公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海精密仪器仪表有限公司）；TDZ4-WS 低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；微型高速离心机 拓赫机电科技（上海）有限公司。1.2 试剂替考拉宁（含量：100%，中国食品药品检定研究所，批号：100504-201102）；甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯，Merck，Germany）；马血清（北京政博伟业生物科技有限公司）；纯净水 华润怡宝饮料（中国）有限公司；磷酸、磷酸氢二铵、氨水、高氯酸、醋酸铵、乙二醇、叔丁醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。超滤离心管（密理博，截留分子量 30 000 Da 的物质）。2 方法与结果2.1 色谱条件柱温：40；EX：230 nm，EM：333 nm；进样体积：80 L。一维（LC1）色谱柱：SRC（苯基柱，4.630 mm，5 m，ANAX，中国）；流动相：1.0 mmol/L 磷酸氢二铵溶液（pH7.4）-1.0 mmoL/L磷酸氢二铵水溶液（pH 3.0）-乙腈=33 45 22（V/V/V）；流速：0.8 mL/min。二维（LC2）色谱柱：SCB（C18，4.6250 mm，5 m，ANAX，中国）；流动相：1.0 mmoL/L磷酸氢二铵溶液（pH 7.4）-1.0 mmol/L 磷酸氢二铵水溶液（pH 3.0）-乙腈=23 40 37；流速：1.2 mL/min。使用一级单工模式，运行时间程序见表 1。2.2 样品处理超滤离心法：准确吸取血浆 600 L 至超滤管中，37 水浴中平衡 30 min，然后在 37，2 000g 下离心40 min，取 150 L 下层超滤液，加入 150 L 的 40%叔丁醇溶液，在离心管中震荡摇匀，移入进样瓶中待测。2.3 校准品及质控品浓度标准溶液：准确称量替考拉宁对照品 100.0 mg，用水溶解并定容至100 mL，配制成浓度为1 000.00 g/mL 的替考拉宁标准溶液。标准曲线样品：取空白马血浆超滤液，将替考拉宁标准品溶液稀释成系列浓度溶液（1.00，2.50，5.00，12.50，25.00，50.00，100.00 g/mL），然后用 40%叔丁醇 1 1 稀释成标准溶液（0.50，1.25，2.50，6.25，12.50，25.00，50.00 g/mL）。质控样品：取空白马血浆超滤液，将替考拉宁标准溶液稀释成高中低浓度的溶液（分别为 6.40，32.00，80.00 g/mL），然后用 40%叔丁醇 1 1 稀释成3.5%.Conclusion This method has strong specificity,simple operation and accurate results,and can be used for the determination of teicolanin blood drug concentration in multiple cases of clinical drug combination,providing reference for clinical dose adjustment and individualized medication use by doctors and pharmacists.Key words:ultrafiltration;two-dimensional liquid chromatography;teicoplanin;plasma concentration10Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.2标准溶液（3.20，16.00，40.00 g/mL）。2.4 色谱行为和方法专属性在上述“2.1”色谱条件下，测定替考拉宁标准溶液、空白血浆以及空白血浆加入替考拉宁的色谱图（图1）。从图 1 可以看出，替考拉宁的保留时间约为 8.23 min，空白血浆色谱图中此处未发现干扰峰。替考拉宁标准溶液谱图（图 1D）与空白血浆加入替考拉宁谱图（图 1E）比较，替考拉宁出峰位置和峰面积基本一致，说明血浆内源性物质不影响替考拉宁含量的测定。2.5 2D-LC 系统转移能力方法分析过程中，样品中的替考拉宁按照表 1 的工序运转，样品是否从一维色谱柱转移并洗脱到了二维色谱柱是本系统的关键点。转运的关键时间点通过二维液相色谱系统的追溯体系分段进行考察。LC1、LC2 为 HPLC 模式：LC1 模式为一维流动相、自动进样器、一维色谱柱和检测器连接，样品只经过一维色谱柱，用来确定目标物的转移时间；LC2 模式为二维流动相、自动进样器、二维色谱柱和检测器连接，样品表 1 工序图对应时间程序工序流程工序 1工序 2工序 3工序图工序时间01.2 min2.34.3 min4.314 min系统工作工序状态LC1 色谱柱工作，进行样品初级分离LC1 色谱柱与 LC2 色谱柱柱连通，样品中目标组分的捕获LC2 色谱柱工作，样品中目标组分的分离检测只经过二维色谱柱，用来确定目标物未发生转移时的峰面积；一级单工模式为 2D-LC 模式，运行时间程序见表 1，由两个流路组成，样品先经过一维柱进行聚焦除杂，再转移到二维柱上进行分离。一级单工一维（LC1）、二维（LC2）和一级单工图谱见图 1，图 1A 为替考拉宁标准溶液 LC1 图谱，图 1B 为替考拉宁标准溶液 LC2 图谱，图 1D 为替考拉宁标准溶液一级单工图谱。图 1A 图谱显示替考拉宁从 2.7 min 开始洗脱出来，对照表 1 中的工序，2.3 min 转移时替考拉宁还在一维柱上，转移洗脱是否完全可由 2D-LC 系统的转移回收率判定，转移回收率用一级单工峰面积与 LC2峰面积比值的百分数表示，替考拉宁的转移回收率为96.94%（表 2），在 95%105%的范围内，转移回收率良好。2.6 2D-LC 系统在线处理能力常规液相色谱的进样体积一般小于 50 L，这是因为受到色谱柱载样能力的影响，当液相色谱进样体积超过 50 L 时，样品浓度和峰面积的线性关系A.不同体积替考拉宁标准溶液 LC1 图谱(粉色：10 L，黑色：20 L)；B.LC2 替考拉宁标准溶液图谱；C.空白人血清色谱图；D.替考拉宁标准溶液；E.空白血浆加入替考拉宁。图 1 替考拉宁二维液相图谱DEABC11湘南学院学报（医学版）2023 年 6 月第 25 卷第 2 期按最小二乘方法拟合回归曲线，结果显示，在 30 80 L 的范围内替考拉宁进样量与峰面积的线性关系良好：Y=5 663 417X+5106，R2=0.999 9。在此范围内随 着替考拉宁进样量的增大并未出现线性失真，色谱峰也没有发生扭曲或位移，这说明在进样量为 3080 L 的范围内，二维液相色谱对样品中的替考拉宁具有良好的在线富集能力，因此将最佳进样量确定为80 L（图 2）。可能会变差，并且可能会出现色谱峰的峰形不对称、扭曲等现象 8。与常规液相色谱不同，二维液相色谱系统最大进样量可达 1 100 L，原因在于二维液相色谱系统具有在线样品处理能力。为确定最佳进样量，用“2.1”的色谱条件，“2.2”的前处理方法对浓度为 32 g/mL 的质控样品进行测试，进样量分别为 30、50、70、80、100、200、300 L。以替考拉宁峰面积（As）为因变量（Y），进样量（Am）为自变量（X），表 2 替考拉宁转移回收率（n=3）LC2 峰面积LC2 峰面积均值一级单工峰面积一级单工峰面积均值转移回收率123123489 441493 524500 506494 490.33487 341476 622474 091479 351.3396.94%图 2 替考拉宁进样量线性图2.7 标准曲线取“2.3”项下用于标准曲线绘制的 7 个浓度对照品溶液，按“2.2”项下方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件进样，得线性方程为 Y=267 847X-65 458，R2=0.999 8，其中 X 值代表替考拉宁的浓度，Y 值代表替考拉宁的峰面积，线性范围为 0.550.0 g/mL（图 3）。2.8 准确度和精密度取“2.3”项下的 3 个浓度水平质控样品考察精密度，日内精密度通过计算一个分析批中每个质控样品浓度的相对标准偏差得出，每个样本重复 5 次（表 3）；日间精密度通过计算3 d内每日完成的3个分析批中每个质控样品浓度的相对标准偏差得出（表 4）。日内精密度RSD 为 0.3%3.8%，日间精密度 RSD 为 0.3%3.5%。2.9 回收率考察取 3 个浓度质控样品，按“2.2”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样，每个浓度重复 5 次，质控品测定浓度平均值与实际浓度的比值为相对回收率。低、中、高 3 个浓度处理样品的相对回收率为 96.8、99.7、97.9，RSD 值为 1.50%，小于 2%，见表 3，表明回收率合格且稳定，满足准确定量的要求。2.10 稳定性考察取低、高质控溶液，分别考察室温放置 24 h、4 放置 24 h、反复冻融 2 次以及-20 冷冻保存 3 d 条件下替考拉宁降解程度。结果表明血浆中替考拉宁在室温，4，反复冻融 2 次及-20保存条件下都比较稳定，降解比例均小于 5%，结果见表 5。2.11 临床样本检测取 10 例本院患者监测的临床样本，采血时间为患者注射替考拉宁达到稳态后，于下一次注射替考拉宁前 30 min 静脉采血，按“2.2”项下方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件进样，测定的替考拉宁浓度见表 6。3 讨论在国家卫健委公布的 2018 年全国细菌耐药监测图 3 替考拉宁标准曲线12Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.2肠球菌属、李斯特菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌等革兰阳性菌有较强的活性。与万古霉素相比，替考拉宁对革兰阳性菌杀菌作用较强，不良反应少，生物利用率高且肾毒性小。因此，抗菌药物临床应用指导原则（2015年版）推荐替考拉宁作为治疗革兰阳性菌特别是耐药革兰阳性菌引起的重症感染的首选药物 12。本文采用“柱柱”二维分离技术，将常规 HPLC（LC2）与一维柱（LC1）相结合，一维柱（LC1）可对色谱柱和 HPLC 系统起到保护作用，因其利用截尾技术可以吸附干扰物质、去除杂质，能够防止杂质微粒在报告中，革兰阳性菌检出 952 023 株，占细菌总数的29.4%。其中，革兰阳性菌检出排在前 5 位的为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌 9。在临床常见的细菌感染中，革兰阳性菌占了相当大的比重，具体表现为高热、毒性，如面红、心率增快、兴奋等，若不及时控制感染，甚至还可出现严重并发症甚至死亡 10。在长期使用抗生素的过程中，由于自然的进化规律，容易产生多种耐药菌株。根据 抗菌药物临床应用指导原则（2015 年版），对于耐药革兰氏阳性菌的治疗推荐，首选糖肽类抗菌药物 11。糖肽类抗菌药物主要有万古霉素、去甲万古霉素和替考拉宁等，其对甲氧西林耐药葡萄球菌属、JK棒状杆菌、表 3 日内精密度（n=5）浓度/（g/mL）测定值/（g/mL）平均值标准差RSD/%平均回收率/%123453.23.282.993.003.083.143.10 0.12 3.896.81615.915.8815.9816.0915.9315.96 0.08 0.599.74039.0239.1139.3139.0739.2239.15 0.12 0.397.9表 4 日间精密度（n=5）浓度/（g/mL）时间/d测定值/（g/mL）平均值标准差RSD/%123453.213.282.993.003.083.143.180.113.523.223.273.223.143.2133.163.153.233.223.4316115.915.8815.9816.0915.9315.790.161.0215.4615.5715.6215.7415.77315.8115.7715.815.8115.6540139.0239.1139.3139.0739.2239.140.110.3239.0539.2339.0139.0538.96339.2239.2539.1639.2739.22表 6 临床样本检测样本编号送检时间浓度/（g/mL）12020-09-290.5722020-09-291.8532020-11-161.2142020-11-162.2452021-03-300.8462021-04-070.7172021-04-221.8982021-05-061.2992021-05-062.62102021-06-010.93表 5 不同储存条件下血浆中替考拉宁的稳定性试验储存条件药物浓度/（g/mL）测定平均值/（g/mL）降解比例/%室温放置 24 h6.46.272.053231.262.324放置 24 h6.46.311.463231.641.13反复冻融 2 次6.46.331.133231.591.29-20保存 3 d6.46.380.383231.810.5813湘南学院学报（医学版）2023 年 6 月第 25 卷第 2 期methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia J.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2014,58(1):317-324.2 Ferrer R,Martin-Loeches I,Phillips G,et al.Empiric antibiotic treatment reduces mortality in severe sepsis and septic shock from the first hour:results from a guideline-based performance improvement program J.Critical Care Medicine,2014,42(8):1749-1755.3 王曦培,何国东,郑志杰,等.高效液相色谱-质谱联用法检测患者血浆中替考拉宁的浓度 J.中国医院药学杂志,2020,40(15):1616-1621.4 Zhou L J,Gao Y Q,Cao W,et al.Retrospective analysis of relationships among the dose regimen,trough concentration,efficacy,and safety of teicoplanin in Chinese patients with moderatesevere Gram-positive infections J.Infect Drug Resist,2018,11(5):29-36.5 Wang S M,Lin F H,Ruan J S,et al.Pharmacokinetics of multiple doses of teicoplanin in Chinese elderly critical patients J.Expert Rev Clin 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90%，游离药物浓度低，对检测灵敏度要求高。一般而言，HPLC 样品进样量体积小，为 1020 L。与常规方法相比，本方法采用大体积进样，进样量达到 80 L，进样量比普通的检测分析方法高出 48 倍，且分析速度较普通的检测分析方法大幅提高，检测灵敏度完全满足临床需要，因此大大减小了进样偏差，即使采用外标法也可以获得良好准确性及精密度 14。本研究从特异性、线性范围、灵敏度、准确度、精密度、稳定性考察等几个方面进行了方法学验证。结果显示，在 EX：230 nm，EM：333 nm 的条件下，最低定量限为 0.5 g/mL。方法的线性范围为 0.550.0 g/mL，日内精密度为0.3%3.8%，日间精密度为0.3%3.5%。该方法相对回收率为 96.899.7，RSD 小于 2%，能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求。稳定性实验结果表明样品在室温放置 24 h、4 放置 24 h、反复冻融 2 次以及-20冷冻保存 3 d 条件下，血浆中替考拉宁的浓度无显著性变化。临床样本检测分析结果表明本方法能够成功用于临床患者样品分析，在临床合理用药方面发挥指导作用。综上，超滤管过滤联合二维液相色谱荧光技术建立的替考拉宁游离药物浓度测定方法，该方法专属性强、操作简便、结果准确，可以用于临床多种合并用药情况下的替考拉宁浓度检测，在医生和药师临床剂量调整和个体化用药方面具有指导性意义。参考文献：1 Yoon Y K,Park D W,Sohn J W,et al.Multicenter prospective observational study of the comparative efficacy and safety of vancomycin versus teicoplanin in patients with health care-associated