基于RNA-Seq探讨原发性肝癌不同中医证型循环免疫细胞丰度差异.pdf

第42 卷第9期2023年9 月基于RNA-Seq探讨原发性肝癌不同中医证型循环免疫细胞丰度差异山东中医杂志SHANDONG JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINEVol.42,No.9Sep.2023胡锐1-2,孙嘉玲,钟欣1.2,李静3,张（1.广州中医药大学，广东广州510 0 0 6；2.深圳市中医院，广东深圳518 0 33；3.澳门科技大学，澳门999078)摘要目的：利用转录组测序技术(RNA-Seq揭示原发性肝癌不同中医证型外周免疫环境的微观差异。方法：纳入原发性肝癌患者8 1例及健康人50 例，分别为原发性肝癌组和健康对照组，其中原发性肝癌组包括脾虚湿困证17 例、湿热蕴毒证2 0 例、气虚血瘀证2 6 例及肝肾阴虚证18 例,提取受试者外周血单个核细胞(PBMC)用于RNA-Seq测序，利用生物信息学分析技术对两组外周2 8 种免疫细胞浸润丰度进行分析。结果：健康对照组与原发性肝癌组的循环免疫细胞群存在广泛差异，其中原发性肝癌组效应CD8T细胞、效应记忆CD8+T细胞、滤泡辅助T细胞、自然杀伤样T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、Th1辅助细胞、肥大细胞、幼稚及活化B淋巴细胞丰度均低于健康对照组，而中性粒细胞、巨噬细胞、CD56+自然杀伤细胞、活化树突状细胞、幼稚树突状细胞、单核细胞及髓源性抑制细胞(MDSC)丰度均高于健康对照组(P0.05)。相关性分析显示,2 8 种循环免疫细胞之间存在广泛的交互作用。效应CD8T细胞、效应记忆CD8T细胞、效应CD4+T细胞、-S-T细胞、巨噬细胞及Th17辅助细胞在原发性肝癌不同中医证型中存在差异（P0.05)。其中气虚血瘀证及肝肾阴虚证效应CD8T细胞表达水平低于脾虚湿困证及湿热蕴毒证(P0.05)；效应记忆CD8T细胞在肝肾阴虚证患者中丰度最低，与脾虚湿困证、湿热蕴毒证比较，差异均有统计学意义(P0.05)。效应CD4+T细胞在气虚血瘀证中浸润丰度最低，与脾虚湿困证、湿热蕴毒证比较,差异有统计学意义(P0.05)。-8-T 细胞在脾虚湿困证水平最低,Th17辅助细胞和巨噬细胞均在气虚血瘀证丰度最低,与肝肾阴虚证比较，差异均有统计学意义（P0.05)。结论：不同中医证型原发性肝癌循环免疫细胞丰度存在差异，可能成为中医药宏观论治指导下的微观干预靶标。关键词原发性肝癌；脾虚湿困证；湿热蕴毒证；气虚血瘀证；肝肾阴虚证；循环免疫细胞；转录组测序技术中图分类号R273D0I:10.16295/ki.0257-358x.2023.09.010Exploration on the Difference of Circulating Immune Cell Abundance in DifferentTraditional Chinese Medicine Syndromes of Primary Liver Cancer Based on RNA-SeqHU Ruil-2,SUN Jialing,ZHONG Xin2,LI Jing,收稿日期】2 0 2 3-0 3-14ZHANG Wei?,SUN Xinfeng,FENG Wenxing,ZHOU【基金项目】国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：8 2 2 0 5Xiaozhou?209）；深圳市科技计划项目（编号：JCYJ20210324120405015）；广东省中医药局项目（编号：2 0 2 3130 2)；广州中医药大学研究生科研创新项目（编号：A1-2606-21-429-001Z38）【作者简介】胡锐（1995一），女，湖北恩施人，2 0 19年级硕士研究生，研究方向：中医药防治慢性肝病的研究。电话：1347 6 2 97 7 31；邮箱：。【通信作者】周小舟（196 4一）,女，湖南岳阳人，医学博士，主任医师，博士研究生导师，主要从事中医药防治慢性肝病的研究。邮箱：。长卫,孙新锋,冯文杏,周小舟2文献标志码A文章编号0 2 57-358 X(2023)09-0955-08(1.Guangzhou University of Traditional ChineseMedicine,Guangzhou 510006,China;2.Shenzhen Hos-pital of Traditional Chinese Medicine,Shenzhen518033,China;3.Macau University of Science andTechnology,Macau 999078,China)955.2023年9月Abstract Objective:To reveal the microscopic differences of peripheral immune environment in differenttraditional Chinese medicine(TCM)syndromes of primary liver cancer by using Transcriptome sequencingtechnology(RNA-Seq).Methods:A total of 81 patients with primary liver cancer(PLC)and 50 healthy ordinarypeople were included as the primary liver cancer group and the healthy control group.The primary liver cancergroup included 17 cases of spleen deficiency and dampness syndrome,20 cases of damp-heat accumulationand toxicity syndrome,26 cases of qi deficiency and blood stasis syndrome and 18 cases of liver and kidneyyin deficiency syndrome.Peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of examinee were extracted for RNA-Seqsequencing.The infiltration abundance of 28 kinds of peripheral immune cells in two groups was analyzed bybioinformatics.Results:There were extensive differences in the circulating immune cell populations betweenthe healthy control group and the primary liver cancer group.Among them,the primary liver cancer grouphas lower abundance of effector CD8+T cells,effector memory CD8+T cells,follicular helper T cells,naturalkiller like T cells,central memory CD4+T cells,effector CD4+T cells,Thl co helper cells,mast cells,immatureand activated B lymphocytes compared to the healthy control group,while neutrophils,macrophages,CD56+natural killer cells,activated dendritic cells,immature dendritic cells,monocytes,and myeloid suppressor cells(MDSC)were significantly higher than those of the healthy control group(P0.05).Correlation analysis showedthat there were extensive interactions between 28 circulating immune cells.There were differences in theabundance of effector CD8+T cells,effector memory CD8+T cells,effector CD4+T cells,-delta-T cells,macrophages and Th17 helper cells in different TCM syndrome types of PLC(P0.05).The expression levelof CD8+T cells in qi deficiency and blood stasis syndrome and liver-kidney yin deficiency syndrome waslower than that in spleen deficiency and dampness syndrome and dampness-heat accumulation and toxicitysyndrome(P0.05).The abundance of effector memory CD8+T cells was the lowest in patients with liver-kidneyyin deficiency syndrome,and there were significant differences compared with that of syndrome of spleendeficiency and dampness,syndrome of dampness-heat accumulation and toxicity(P0.05).The abundance ofeffector CD4+T cells was the lowest in patients with qi deficiency and blood stasis syndrome,and therewere significant differences compared with that of syndrome of spleen deficiency and dampness,syndrome ofdampness-heat accumulation and toxicity(P0.05），具有可比性。本研究通过深圳市中医院伦理委员会审核批准，伦理审批号：深中医伦审（研)2 0 18 58。1.2西医诊断标准参照原发性肝癌诊疗规范（2 0 19年版）7 确定PLC的西医诊断标准。有乙型或丙型病毒性肝炎，或任何原因引起肝硬化者：肝内直径2 cm结节，动态增强MRI、动态增强CT、超声造影或肝细胞特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强MRI4项检查中至少有2 项显示动脉期病灶明显强化、门静脉期和/或平衡期肝内病灶强化低于肝实质，即“快进快出”的肝癌典型特征,则可做出肝癌的临床诊断。对于发现肝内直径 2 cm结节,则上述4种影像学检查中只要有1项典型的肝癌特征，临床即可确诊。1.3中医辨证标准参照原发性肝癌诊疗规范（2 0 19年版）7 中医内科学 8 进行中医辨证分型，分为脾虚湿困证、气虚血瘀证、湿热蕴毒证、肝肾阴虚证4个证型。1.4纳入与排除标准纳人标准：18 岁年龄8 5岁；符合PLC胡锐等：基于RNA-Seg探讨原发性肝癌不同中医证型循环免疫细胞丰度差异第42 卷第9期诊断标准，且中医辨证符合上述分型者；患者自愿参加此次观察性研究。排除标准：转移性肝癌和(或)其他恶性肿瘤患者;免疫相关性疾病或造血系统功能障碍疾病患者；近期遭受严重创伤或合并感染性疾病者；长期使用激素者；患有精神疾病或神志不清不能配合者；难以排除其他临床试验影响者；妊娠或哺乳期妇女；病例资料不全者。2方法2.1高通量测序使用含乙二胺四乙酸真空抗凝管采集两组受试者新鲜外周血约6 mL,并在2 h内分离其外周血单个核细胞（PBMC），提取样品总RNA并使用超微量分光光度计（型号Nanodrop，赛默飞世尔科技公司，美国)对其完整性、纯度、浓度及是否存在DNA污染进行监测，利用多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸磁珠富集含polyA尾的mRNA，片段化模块酶试剂（型号#E6150S，纽英伦生物技术有限公司，美国）对纯化的mRNA随机打断，片段化的mRNA逆转录合成双链cDNA，经洗涤纯化、末端修复、连接测序接头等操作后选定2 0 0 bp大小的cDNA开始聚合酶链式反应(PCR)预扩增,构建cDNA文库,文库质检合格后使用10 Ilumina高通量测序仪（因美纳科学器材有限公司，美国）得到待检测片段的序列信息。全部样本的高通量测序由东南大学实验室完成。2.2生物信息学分析将原始测序序列进行过滤操作，对获得的有效数据Q20、Q 30 及GC含量（鸟嘌呤和胞嘧啶所占比率）进行计算，使用HISAT2(v2.0.5)构建参考基因组序列,对样本基因表达水平进行定量分析,使用FPKM对基因表达矩阵进行深度和基因长度校正。2.3免疫浸润分析利用单样本基因集富集分析对PBMC表达矩阵进行免疫浸润分析，分析2 8 种免疫细胞丰度差异。2.4统计学方法样本基因表达矩阵使用RStudio（4.0.2 版）进行注释分析，软件SPSS26.0和GraphPadPrism9用于统计分析。非正态分布的计量资料采用秩和检验，计数资料使用卡方检验；分类变量资料运用Pearson卡方检验、Spearman检验进行相关分析。取=0.05为检验水准。957.2023年9月3结果3.1PLC患者外周免疫背景分析3.1.1循环免疫细胞群丰度分析分析两组受试者2 8 种免疫细胞表达情况，包括不同状态下的T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状(DC)细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、肥大细胞及嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞等。2 8 种免疫细胞丰度直方图提示健康对照组与原发性肝癌组的循环免疫细胞群存在广泛差异，其中原发性肝癌组效应CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、滤泡辅助T组别：申健康对照组*1.2-山东中医杂志细胞（Tfh）、自然杀伤样T细胞（NKT）、中央记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、Th1辅助细胞、肥大细胞、幼稚及活化B淋巴细胞丰度低于健康对照组，而中性粒细胞、巨噬细胞、CD56+NK细胞、活化DC细胞、幼稚DC细胞、单核细胞及髓源性抑制细胞(MDSC)丰度高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。见图 1、表 1。3.1.2循环免疫细胞群相关性分析相关性分析结果显示，2 8 种循环免疫细胞之间存在广泛的交互作用。其中活化B淋巴细胞(cor=原发性肝癌组*站第42 卷第9期nsns ns ns nsnsnsnsnsnsns：0.90.6日中3*T细胞中性粒细胞滤泡辅助T维效应CD8+T细胞自然杀伤样T细胞效应记忆CD8+T中央记忆CD4TCD56*自然杀伤细胞T细胞巨噬细胞+T细胞Th1辅助细胞T细胞T细胞肥大细胞单核细胞幼稚B淋巴细胞活化B淋巴细胞活化树突状细胞效应CD4+T细胞幼稚树突状细胞髓源性抑制细胞4+T细胞Th2辅助细胞Th17辅助细胞调节性T细胞记忆B淋巴细胞自然杀伤细胞CD56自然杀伤细胞中央记忆CD8*嗜酸性粒细胞浆细胞样树突状细胞效应记忆CD4+T图1健康对照组和原发性肝癌组2 8 种循环免疫细胞丰度箱线图表1健康对照组和原发性肝癌组差异循环免疫细胞群浸润丰度分析 M(P25,Prs)细胞类型活化B淋巴细胞效应CD4+T细胞效应CD8T细胞活化树突状细胞CD56+自然杀伤细胞中央记忆CD4T细胞效应记忆CD8T细胞幼稚B淋巴细胞幼稚树突状细胞髓源性抑制细胞巨噬细胞肥大细胞单核细胞自然杀伤样T细胞中性粒细胞滤泡辅助T细胞Th1辅助细胞958健康对照组0.97(0.90,1.01)0.90(0.89,0.92)1.19(1.18,1.20)0.90(0.88,0.92)0.78(0.77,0.80)1.23(1.22,1.24)1.16(1.15,1.18)1.22(1.18,1.25)0.88(0.86,0.89)1.38(1.37,1.38)0.80(0.78,0.82)0.69(0.63,0.72)1.15(1.14,1.17)0.75(0.73,0.78)0.82(0.78,0.88)0.82(0.80,0.83)0.80(0.79,0.81)原发性肝癌组0.91(0.79,0.98)0.89(0.86,0.92)1.16(1.15,1.18)0.92(0.88,0.98)0.75(0.72,0.79)1.21(1.20,1.23)1.14(1.12,1.15)1.18(1.11,1.24)0.89(0.87,0.91)1.38(1.37,1.39)0.84(0.81,0.87)0.73(0.67,0.82)1.16(1.15,1.19)0.73(0.70,0.75)0.92(0.85,1.07)0.79(0.78,0.81)0.78(0.77,0.80)P值0.0050.0310.0010.0090.0010.0010.0010.0030.0320.0450.0010.0020.0250.0010.0010.0010.0012023年9 月0.92,P0.001）及活化DC细胞（cor=0.81,P0.001)分别与幼稚状态存在显著正相关。肥大细胞与幼稚DC细胞（cor=0.86,P0.001)、活化DC细胞（cor=0.80,P0.001)及中性粒细胞（cor=0.81,P0.001)呈强正相关。随着效应CD8+T细胞表达增加,效应记忆CD8+T细胞相应升高（cor=0.76,P0.001)；而中性粒细胞（cor=-0.38,P=0.003）、幼稚DC细胞(cor=-0.42,P0.001）、肥大细胞（cor=-0.36,P0.001）、N K 细胞（cor=-0.26,P=0.003）、巨噬细胞(cor=-0.33,P0.001)及嗜酸性粒细胞(cor=-0.24,P=0.006)丰度降低。效应CD4+T细胞与效应CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞呈显著正相关,巨噬细胞Th1辅助细胞0.21CD56*自然杀伤细胞0.22Th2辅助细胞0.2CD56自然杀伤细胞浆细胞样树突状细胞中性粒细胞-0.38-0.5嗜酸性粒细胞-0.24-0.42中央记忆CD8*T细胞0.180.53肥大细胞-0.36-0.44幼稚树突状细胞0.42-0.47活化树突状细胞-0.33-0.4Th17辅助细胞-0.29-0.38自然杀伤细胞-0.26-0.230.230.33调节性T细胞0.32巨噬细胞-0.33-0.27单核细胞-0.26Y-8-T细胞髓源性抑制细胞效应记忆CD4+T细胞中央记忆CD4*T细胞效应CD4*T细胞幼稚B淋巴细胞0.450.32活化B淋巴细胞0.460.29记忆B淋巴细胞滤泡辅助T细胞0.380.410.62自然杀伤样T细胞0.310.42效应记忆CD8*T细胞0.76T细胡锐等：基于RNA-Seq探讨原发性肝癌不同中医证型循环免疫细胞丰度差异0.44O.550.330.20.430.490.30.240.37 0.490.370.440.22-0.30.420.230.22O.330.340.26O.270.21-0.23-0.210.17 0.220.33-0.31-0.290.330.22-0.2-0.220.30.370.580.20.460.20.430.340.340.220.390.18O.580.310.480.22第42 卷第9 期与幼稚DC细胞（cor=0.86,P0.001)、调节性T细胞（cor=0.74,P0.001）、肥大细胞（cor=0.73,P0.001）、单核细胞（cor=0.73,P0.001）、中性粒细胞(cor=0.70,P0.001)及-8-T细胞(cor=0.68,P0.001)呈正相关。见图2。3.2不同中医证型PLC患者循环免疫细胞分析分析PLC脾虚湿困证、湿热蕴毒证、气虚血瘀证及肝肾阴虚证患者PBMC循环免疫细胞分布情况,发现效应CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD4+T细胞、-T细胞、Th17辅助细胞及巨噬细胞在PLC不同中医证型中存在差异(P0.05)。见表2、图3。0.350.40.360.20.40.350.22-0.20.220.190.54 0.220.51o.670.610.710.650.480.460.210.28-0.2-0.2-0.17-0.23-0.21-0.170.410.270.280.190.450.340.230.270.280.21.450.920.48#巴细用0.43-0.20.370.360.270.330.360.50.390.3-0.180.31.580.440.610.390.630.660.760.440.40.70.350.660.41.330.560.50.730.470.69（0.7 10.58.540.630.48O.390.550.630.730.460.680.730.190.170.21胞260.230.290.220.520.55 0.490.390.490.570.490.360.590.250.40.410.360.380.30.20.240.270.320.230.240.690.740.70.80.460.350.530.6.580.490.629.80.860.740.50.740.76（.570.69 0.75O.58.40.590.410.730.740.510.710.47炭细胞0.27工细胞防细胞260.62.590.50.680.710.820.790.570.70.810.43立细胞T细用.320.550.37O.580.660.18细相关性系数1.00.50.0-0.5-1.0记忆B淋巴纯舌化B淋日稚B淋巴维效应CD8+T细胞效应CD4*自然杀伤样细胎效应记忆CD周节性T维Th17辅助维舌化树突状终幼稚树突状效应记忆CD4中央记忆CD8浆细胞样树突状细胞CD56自然杀仿细CD56*自然杀伤细胞嗜酸性粒维中性粒维Th2辅助丝图2 原发性肝癌组循环免疫细胞表达水平的相关性热图表2 原发性肝癌组不同中医证型差异循环免疫细胞丰度分析 M(P2s,Prs)细胞类型效应CD8+T细胞效应记忆CD8T细胞效应CD4T细胞-T细胞Th17辅助细胞巨噬细胞脾虚湿困证1.17(1.16,1.18)1.14(1.13,1.16)0.90(0.87,0.92)0.80(0.77,0.83)0.52(0.48,0.54)0.86(0.78,0.87)湿热蕴毒证1.17(1.15,1.19)1.14(1.13,1.16)0.89(0.87,0.92)0.82(0.80,0.84)0.51(0.49,0.54)0.82(0.80,0.85)气虚血瘀证1.14(1.13,1.16)1.13(1.11,1.14)0.86(0.85,0.88)0.82(0.79,0.83)0.49(0.47,0.52)0.82(0.79,0.86)肝肾阴虚证1.14(1.12,1.16)1.12(1.09,1.13)0.89(0.85,0.93)0.85(0.82,0.87)0.54(0.52,0.56)0.87(0.85,0.90)P值0.0010.0010.0060.0080.0120.012959.2023年9 月*山东中医杂志组别：脾虚湿困证nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns第42 卷第9 期湿热蕴毒证气虚血瘀证nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns肝肾阴虚证1.210.9-0.61L.8002421至xT细胞T细胞Y-6-T细胞巨噬细胞Th17辅助细胞调节性T细胞活化树突状细胞4+T细胞肥大细胞单核细胞嗜酸性粒细胞幼稚B淋巴细胞CD56自然杀伤细胞3*T细胞Th2辅助细胞Th1辅助细胞活化B淋巴细胞CD56*自然杀伤细胞滤泡辅助T细胞自然杀伤样T细胞髓源性抑制细胞工宁图3原发性肝癌不同中医证型2 8 种循环免疫细胞丰度箱线图AB效应CD8T细胞1.28-*1.21-1.14-1.07-1.00C效应记忆CD8+T细胞1.281.21-1.14-1.07-1.00效应CD4+T细胞1.117*1.02-0.93-0.84-0.75-牌虚湿困证湿热蕴毒证气虚血瘀证肝肾阴虚证脾虚湿困证湿热蕴毒证气虚血瘀证肝肾阴虚证牌虚湿困证湿热蕴毒证气虚血瘀证肝肾阴虚证D1.080.96-0.84-0.720.60-E-o-T细胞0.80.7-工宁0.6-0.5-0.4-FTh17辅助细胞1.2*1.0-0.8-0.6-0.4-巨噬细胞*脾虚湿困证湿热蕴毒证气虚血病证肝肾阴虚证图4原发性肝癌不同中医证型差异循环免疫细胞丰度箱线图进一步分析显示，气虚血瘀证及肝肾阴虚证效应CD8+T细胞表达水平低于脾虚湿困证及湿热蕴毒证(P0.01或P0.05）,见图4A。效应记忆CD8+T细胞在肝肾阴虚证患者中表达水平最低，与脾虚湿困证、湿热蕴毒证比较,差异均有统计学意义(P0.01),见图4B。效应CD4+T细胞在气虚血瘀证中浸润丰度最低，960.脾虚湿团证湿热蕴毒证气虚血瘀证肝肾阴虚证注：*P0.05,*P0.01,*P0.001。与脾虚湿困证、湿热蕴毒证比较,差异均有统计学意义(P0.01或P0.001),见图4C。-8-T 细胞在脾虚湿困证水平最低，与肝肾阴虚证比较，差异有统计学意义(P0.05),见图4D。T h 17 辅助细胞和巨噬细胞均在气虚血瘀证中浸润量最低，与肝肾阴虚证比较，差异均有统计学意义(P0.01),见图4E和4F。4讨论古代医家对肝癌的认识经历了漫长的探索过脾虚湿团证湿热蕴毒证气虚血瘀证肝肾阴虚证2023年9 月程。素问刺法论提出百病之机为“正气存内，邪不可干”，正气充足则病邪无处可藏，如医宗必读积聚言：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”。因此肝癌发病必有正气亏虚，外邪虚而入，潜伏肝内,邪凝毒结而为肝积。从内因而言,情志久郁不舒，或饮食失衡、好食肥腻且嗜酒，或房劳不节，或他病久耗、脏腑亏虚、功能失调，气、血、湿、痰、瘀、热、毒结聚于内,聚之不散,而见胁下痞块 6,9-12 。如证治汇补腹胁门言：“积之始生，因起居不时，忧患过度，饮食失节，脾胃亏损或因内伤外感气郁误补而致”。由虚至实，由实至虚，正气亏虚，肝癌始生。宏观来看癌病进程中的正邪交争、气血失衡与现代医学癌细胞和免疫环境的动态串扰颇为相似 6 。疾病早期,先天性及适应性免疫细胞构成肿瘤人侵的重重屏障，能迅速识别肿瘤表面抗原发挥免疫清除之效,即“正盛邪退”；疾病中期,正虚邪伏,病理产物堆积,肿块形成，并躲避免疫监视，表现为肿块隐匿性生长；疾病晚期，正气消残，肿瘤局部及外周环境免疫细胞数量降低及功能渐进性丧失，最终耗竭，肝癌细胞不受机体免疫控制进而侵袭、转移 13-16 。肝癌发展与机体免疫强弱密切相关，因此本研究试图将宏观中医辨证论治与微观免疫外环境相结合，为中医药的临床用药提供新的治疗靶点。癌症-免疫循环是免疫细胞不断从外周向肿瘤局部浸润发挥特异性抗肿瘤作用的过程 17 。肝癌细胞释放的肿瘤抗原被DC细胞捕获并加工处理,转移至淋巴结，启动和激活T细胞向肿瘤组织迁移和浸润,发挥特异性肿瘤杀伤作用。研究发现,PLC患者系统免疫存在失衡,幼稚及活化的DC细胞数量增加,而效应CD8+、CD 4+T 细胞、效应记忆CD8+T细胞、中央记忆CD4T细胞等抗肿瘤细胞数量不增反降，包括Tfh、T h 1等辅助性T淋巴细胞均呈降低趋势,适应性免疫应答严重受创伤；此外，先天性免疫细胞,包括B淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞均呈降低趋势，而肿瘤相关巨噬细胞（主要来源细胞单核细胞)及MDSC较正常人群均显著升高 17-19 。从宏观来看，有杀伤、活化作用的正向免疫细胞群具有中医理论中阳的特性，与之相反,抑制性、幼稚、静息态的负向免疫细胞符合阴之属性。受肿瘤负荷的影响，外周抑制性免疫细胞不断扩张，效应免疫细胞数量降低或功能耗竭，外周免疫大环境中阴性成分不断扩大，而阳性分量逐渐减轻，阴阳失衡，久之具有侵袭、胡锐等：基于RNA-Seg探讨原发性肝癌不同中医证型循环免疫细胞丰度差异第42 卷第9 期增殖、转移特征的恶性肿瘤细胞侵入血液、播散全身，同时免疫细胞之间存在广泛相关性也是阴阳平衡协调的具体体现。因此中医辨证的同时了解机体免疫状态，扶正祛邪，调整阴阳治疗大纲，调阴阳之逆乱，逆转机体免疫抑制可能成为抗肿瘤治疗的有效作用途径。进一步分析不同中医证型PLC患者外周免疫背景，发现脾虚湿困证、湿热蕴毒证、气虚血瘀证和肝肾阴虚证循环免疫细胞存在差异。T淋巴细胞是介导适应性免疫应答的主要效应细胞，其表面嵌合的抗原受体与抗原呈递细胞表面的抗原肽-MHC分子复合物特异性结合，迅速活化并增殖分化为效应T细胞和效应记忆T细胞 2 0 。根据其表型和功能的不同分为CD4+T细胞和CD8T细胞两个亚群。CD8+T细胞通过分泌颗粒酶和穿孔素等物质,发挥细胞毒作用 2 1-2 。初始 CD4+T细胞接受刺激后可分化为 Th1、T h 2、T h 9、T h 17、T fh 等辅助性 T 细胞，Th17可分泌多种细胞因子,其中白细胞介素-2 2 在肿瘤发展过程中具有双重作用，Th17浸润与降低癌症无病生存期相关 2 3-2 5。-T细胞是一种独特的淋巴细胞亚群,具有广泛的肿瘤传感功能，对刺激能迅速做出反应并分泌抗肿瘤介质 2 6-2 7 。巨噬细胞除具有吞噬作用外,还能呈递抗原,激活T细胞,肿瘤负荷可影响巨噬细胞向M2型极化，是营造炎症环境驱动肿瘤突变的关键因素 2 8 。本研究对不同中医证型PLC患者PBMC进行高通量测序，发现肝肾阴虚证中效应CD8+T细胞含量最低,而-8-T细胞、Th17细胞及巨噬细胞浸润丰度最高，抑制性免疫细胞群占主导地位,邪胜正衰,预后凶险。气虚血瘀证中效应CD4T细胞和Th17细胞表达水平最低，其次为效应CD8+T细胞和效应记忆CD8+T细胞，特异性抗肿瘤免疫细胞群受损，正邪交争的关键时期，当扶正祛邪兼行，提高抗肿瘤免疫细胞寿命，阻止抑制性免疫细胞群进一步扩增。湿热蕴毒证以效应记忆CD8T细胞含量最高,而巨噬细胞含量最低；而脾虚湿困证效应CD8+和CD4+T细胞丰度最高,而-T细胞表达量最低。由此可见，脾虚湿困证及湿热蕴毒证患者体内正向免疫细胞群尚未被完全压制，正气尚存仍有奋起驱邪外出之势，故治疗当重以攻邪而兼扶正，权宜施之。5结语本研究将现代医学与中医学相结合，运用RNA-9612023年9 月Seq探索不同中医证型PLC外周免疫背景，深人了解证型间的微观差异，并从中医正邪理论及阴阳角度探讨肝癌发生发展的根本原因,为PLC的中医辨证论治提供理论和客观依据。参考文献1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global cancerstatistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence andmortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2 MCGLYNN K A,PETRICK J L,EL-SERAG H B.Epidemi-ology of hepatocellular carcinoma J.Hepatology,2021,73(Suppl 1):4-13.3EUROPEANASSOCIATIONFORTHESTUDYOFTHELIVER.EASL clinical practice guidelines:managementof hepatocellular carcinomaJ.J Hepatol,2018,69(1):182-236.4 OURA K,MORISHITA A,TANI J,et al.Tumor immunemicroenvironment and 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