红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性.pdf

第 39 卷 第 4 期2023 年 7 月森 林 工 程FOREST ENGINEERINGVol.39 No.4Jul.,2023doi:10.3969/j.issn.1006-8023.2023.04.002红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性王俊凯,刘峥,申东晨,董爱荣(东北林业大学 林学院,哈尔滨 150040)摘 要:采用 Illumina Miseq 高通量测序技术来探究人工林与天然林东北红豆杉(Taxus cuspidata)健康针叶与感叶枯病的病叶之间内生真菌和细菌群落结构的差异。结果表明,红豆杉针叶感病前后真菌的 OTU(Operational Taxonomic Units)变化较小,细菌的 OTU 变化较大,天然林比人工林具有更多的真菌 OTU 数,细菌 OTU 数差距较小。4 组样品中共有相同的真菌 OTU 9 个,占真菌 OTU 总数的 9.37%,4 组样品中共有相同的细菌 OTU 34 个,占细菌 OTU 总数的 4.19%。在门水平下,感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同,差异较大的是相对多度,相比于天然林,子囊菌门(Ascomycota)在人工林中的相对多度更高,子囊菌门在 4 组样品占据绝对优势。感病前后样品中的细菌群落结构组成及相对多度都发生了较大变化,相比于天然林,人工林中细菌种类更多。在属水平下,Genolevuria 属是人工林健康叶中最主要的优势真菌,穴壳属(Dothiora)是人工林病叶中最主要的优势真菌,Buckleyzyma 属是天然林健康叶已知属中最主要的优势真菌,Genolevuria 属是天然林病叶已知属中最主要的优势真菌。劳尔氏菌属(Ralstonia)是人工林健康叶中最主要的优势细菌,1174-901-12 属是人工林病叶中最主要的优势细菌,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是天然林健康叶已知属中最主要的优势细菌,马赛菌属(Massilia)是天然林病叶已知属中最主要的优势细菌。推测出链格孢属(Alternaria)和盘双端毛孢属(Seimatosporium)可能会导致红豆杉的叶枯病。关键词:高通量测序;红豆杉;叶枯病;真菌多样性;细菌多样性中图分类号:S763.1 文献标识码:A 文章编号:1006-8023(2023)04-0010-09Diversity of Endophytic Microorganisms in Healthy and Susceptible Leaf Blight Needles of Taxus cuspidataWANG Junkai,LIU Zheng,SHEN Dongchen,DONG Airong(School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)Abstract:Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to investigate the differences in endophytic fungal and bacterial community structure between healthy and diseased needles of Taxus cuspidata in artificial and natural forests.The results showed that the changes of fungal OTU(Operational Taxonomic Units)were small and the changes of bacterial OTU were large.The natural forest had more fungal OTU number than the artificial forest,and the difference of bacterial OTU number was smaller.There were 9 fungal OTUs in the four groups,accounting for 9.37%of the total fungal OTU.There were 34 identical bacterial OTUs in the four groups of samples,accounting for 4.19%of the total bacterial OTU.At the phylum level,the fungal community composition in the samples before and after infection was basically the same,but degree of relative abundance was significantly different.Compared with the natural forest,the relative abundance of Ascomycota was higher in the artificial forest.Ascomycota was dominant in the four groups of samples.The bacterial community structure and relative abundance changed greatly before and after infection.There were more bac-terial species in artificial forests than in natural forests.At the genus level,Genolevuria was the most dominant fungus in healthy leaves of plantations.Dothiora was the most dominant fungus in diseased leaves of plantations,Buckleyzyma was the most dominant fungus in known genera of healthy leaves of natural forests.Genolevuria was the most dominant fungus in the known genera of diseased leaves in natural forests.Ralstonia was the most dominant bacteria in healthy leaves of plantations,1174-901-12 was the most dominant bacte-ria in diseased leaves of plantations,Sphingomonas was the most dominant bacteria in known genera of healthy leaves of natural forests.Massilia was the most dominant bacterium in the known genus of natural forest leaf disease.It was speculated that Alternaria and Sei-matosporium may cause leaf blight of Taxus cuspidata.Keywords:High-throughput sequencing;Taxus cuspidate;leaf blight;fungal diversity;bacterial diversity收稿日期:2022-10-08基金项目:国家自然科学基金项目(31670494)第一作者简介:王俊凯,硕士研究生。研究方向为森林病理学。E-mail:wangjk19970912 通信作者:董爱荣,博士,副教授。研究方向为森林病理学。E-mail:darlmy 引文格式:王俊凯,刘峥,申东晨,等.红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性J.森林工程,2023,39(4):10-18.WANG J K,LIU Z,SHEN D C,et al.Diversity of endophytic microorganisms in healthy and susceptible leaf blight needles of Taxus cuspidataJ.Forest Engineering,2023,39(4):10-18.第 4 期王俊凯,等:红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性东北红豆杉(Taxus cuspidata)为红豆杉属(Tax-us)植物,是珍贵的第三纪孑遗树种1,为国家一级重点保护树种2,3,具有极高的经济价值、观赏价值和生态效益4。东北红豆杉终年常绿,是优秀的园林绿化树种,可以吸附有害气体,释放植物精气,驱蚊防虫,抗病虫害能力强5-6。在 20 世纪 70 年代,Wani 等7的研究团队在对名为短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的植物成分进行研究后,成功提取出具有较为明显抗癌效果的紫杉醇,红豆杉属植物便成为众多学者研究热点。东北红豆杉由于其地理环境以及气候因素的特殊条件,紫杉醇的平均含量明显高于其他种的含量8-9。东北红豆杉天然种群本身生长较缓慢,天然结实率低,且对生长环境要求较严,种群竞争力较弱1,10,再加上外界环境影响,东北红豆杉天然林已濒临灭绝,其保护形势十分严峻11-13。红豆杉叶枯病会给东北红豆杉带来严重的经济损失14。2021 年在黑龙江省穆棱市穆棱镇人工林内发现了红豆杉叶枯病的发生,经调查发现,该病害在染病针叶上发病,并最终导致针叶枯死。近些年来,随着生物防治的逐渐完善,运用植物内生菌拮抗病原菌来防治叶枯病自然是一种较为可行的方法13,15。高通量测序能够更为准确快捷了解微生物的性质及其在自然界中的生态功能,通过高通量测序技术能够一次性检测出样品中可能感染的多种病原物基因组序列,对病原检测鉴定具有很好的应用16-17。本研究基于高通量测序技术,分析人工林与天然林感红豆杉叶枯病与健康针叶内生微生物的多样性以及群落结构的变化,探知优势微生物的分布,从而可用于指导筛选红豆杉针叶内生优势的叶枯病拮抗菌,并探究人工林与天然林内生微生物的差异18-20。1 材料与方法1.1 研究区概况采样地点位于黑龙江省穆棱市穆棱镇东北红豆杉人工林及天然林。东北红豆杉天然林 25 hm2样地,位于穆棱东北红豆杉国家级自然保护区内(43494406 N,1300013028 E)。样地地形走势西南高,海拔最高 781 m,最低 658 m,高差123 m;年平均温度在-2 ,年平均降水量 530 mm,土壤为暗棕壤。样地内森林群落优势种明显,垂直层次复杂,是典型的中龄复层异龄林,其主要建群树种为紫椴(Tilia amurensis)、红松(Pinus koraien-sis)、臭冷杉(Abies nephrolepis)和枫桦(Betula costa-ta)等,样地内共有胸径(DBH)大于等于 1 cm 木本植物57 种,隶属于 22 科 38 属。独立个体数为 63 877株,平均胸径为 7.83 cm,胸高断面积 26.4 m2。样地内现有东北红豆杉(Taxus cuspidate)成树 169 株,天然更新幼苗 350450 株。东北红豆杉人工林(4345 N,13100 E)约4 hm2,1995 年营建,土壤为暗棕壤,东北红豆杉 20 a以上开始结实,40 a 以上果实质量高,株行距为2.5 m3 m,主要建群树种为落叶松(Larix gmelinii),样地内现有东北红豆杉共计一百多万株。1.2 试验材料本实验分别于人工林及天然林采集健康红豆杉及感叶枯病红豆杉针叶。2021 年 6 月 18 日至 20日,采用“S”形十点采样法,分别剪取 10 棵 15 年生健康及感叶枯病红豆杉针叶。从 10 棵树上采集的样品中分别选取 1.0 g,用无菌剪刀剪碎,将其混匀后,使用 75%乙醇表面消毒 1 min,无菌水冲洗1 次,再使用 5%(有效氯)次氯酸钠溶液表面消毒5 min,无菌水冲洗 3 次,从而得到人工林及天然林各 10.0 g 健康样品及 10.0 g 感病样品。穆棱镇人工林健康样品、感叶枯病样品分别用 S1、L1 表示;穆棱镇天然林健康样品、感叶枯病样品分别用 S2、L2 表示。将样品分别置于 2 mL 的无菌离心管中并于-80 的超低温冰箱中保存至 DNA 提取。1.3 红豆杉内生微生物基因组 DNA 的提取及质量检测 红豆杉样品的基因组 DNA 参照 MP 试剂盒 Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200 的使用说明书进行提取,将所提取到的 DNA 溶于50 L 无菌水中,混合均匀,置于-80 保存备用。之后使用NanoDrop2000 进行基因组 DNA 浓度及纯度检测,使用琼脂糖凝胶电泳进行基因组 DNA 完整性检测。1.4 PCR 扩增和高通量测序利用提取的 DNA 进行 PCR 扩增,真菌选择ITS1 和 ITS2R 作为引物,分别为 5-CTTGGTCATT-TAGAGGAAGTAA-3和 5-GCTGCGTTCTTCATC-GATGC-3;细菌选择 799F 和 1193R 作为引物,引物序列分别为 5-AACMGGATTAGATACCCKG-3和 5-ACGTCATCCCCACCTTCC-3。将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序,利用 11森 林 工 程第 39 卷Illumina MiSeq 平台进行测序和数据分析。1.5 数据分析下机数据经过 QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接和去除嵌合体,去除各样本中 reads 尾部质量值在 20 以下的碱基、切除 reads 中含 N 部分序列,并去除数据中的短序列(长度阈值 200 bp),随后再对低复杂度的序列进行过滤。采用 Usearch(v7.1)软件进行数据处理,物种比对注释使用 RDP classifi-er 软件,保留置信区间大于 0.8 的注释结果。用 R语言工具绘制稀释性曲线、韦恩(Venn)图、群落结构图及主坐标分析图(Principal Co-ordinates Analy-sis,PcoA)。利用 Mothur 软件(version v.1.30.2 ht-tp:/www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_di-versity)进行 Chao1(估计物种总数)指数、香农指数(Shannon)、气旋能量指数(Accumulated cyclone en-ergy,Ace)、辛普森(Simpson)指数、Coverage(覆盖度)指数计算分析,并在各分类水平上进行群落结构的统计分析,得到微生物群落结构组成。生境内的多样性指数(within-habitat diversity,Alpha)可用来反映生物群落的丰富度和多样性。其中,Ace、Chao1 指数可反映生物物种的丰富度,其数值越大表示该样品物种丰富度越大,其中 Ace 指数用来估计样本中物种组成的均匀度的指数,Chao1 指数用来估 计 样 本 中 所 含 OTU(Operational Taxonomic Units)数目的指数;Shannon、Simpson 指数可以反映生物群落的多样性,其中 Shannon 指数用来衡量群落的异质性,其数值越大表示群落多样性越高,Simpson 指数代表随机取样的 2 个体属于不同种的概率,其数值越大表示群落物种分布越均匀;Cover-age 指数则可以反映生物群落的覆盖度,其数值越高,则样本中序列被测出的概率越高,该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。生境间多样性(between-habitat diversity,Beta)分析通过对不同微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析,探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。2 结果与分析2.1 测序质量分析通过对人工林及天然林健康红豆杉及感叶枯病红豆杉针叶 4 种样品进行高通量测序数据统计,S1、L1、S2、L2 分别得到 102 022、87 750、100 624、65 973 条有效真菌序列及 16 090、15 336、18 905 和15 983 条有效细菌序列,采用对测序获得的序列进行随机抽样的方法,以抽到的序列数与其所代表的OTU 数构建稀释曲线(图 1)。由图 1 可以看出,4 种针叶内生微生物的稀释曲线均趋于平坦,表明测序数据能很好地反映各样品中真菌及细菌的群落结构和多样性,更多的测序数据对发现新的 OTU贡献率较小。（a）真菌（a）Fungal（b）细菌（b）BacterialL1L2S1S2序列数量Numbers?of?sequences序列数量Numbers?of?sequences1?10?000?20?000?30?000?40?000?50?000?60?0001?10?000?20?000?30?000?40?000?50?000?60?000?70?000L1L2S1S2OTU 数量Numbers?of?OTUsOTU 数量Numbers?of?OTUs80060040020003002001000图 1 红豆杉针叶真菌及细菌群落稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve of Taxus cuspidata needles fungal and bacterial communities 将测序所得的有效序列按 97%的相似度进行OTU 的划分后整理绘制的 Venn 图(图 2)。由图 2(a)可知,在 4 组处理中检测到的真菌总 OTU 数为950 个,其中 S1 组有 222 个、L1 组有 204 个、S2 组有 306 个、L2 组有 218 个。4 组样品中共有相同的OTU89 个,占 OTU 总数的 9.37%,4 组样品中特有的 OTU 数目分别为 58、17、74、31 个;由图 2(b)可知,在 4 组处理中检测到的细菌总 OTU 数为 81121第 4 期王俊凯,等:红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性个,其中 S1 组有 274 个、L1 组有 121 个、S2 组有279 个、L2 组有 137 个。4 组样品中共有相同的OTU34 个,占 OTU 总数的 4.19%,4 组样品中特有的 OTU 数目分别为 144、17、100、17 个,以上结果表明天然林比人工林具有更多的真菌与细菌 OTU 数,细菌 OTU 数量差距较小;感病后,针叶的真菌与细菌 OTU 数量减少。（a）真菌（a）Fungal（b）细菌（b）BacterialS1S3S4S6L1L2S1S258111774143015114489334031614411171001510483420626261771图 2 健康与感病红豆杉针叶真菌及细菌 Venn 图Fig.2 Venn diagram of healthy and susceptible Taxus cuspidata needles fungi and bacteria2.2 感病前后红豆杉针叶的微生物群落门类组成在 97%的相似度水平对样品序列进行 OTU 聚类,由表 1 可知,4 组红豆杉针叶微生物多样性丰富,将不同样品中相同的真菌进行合并,共鉴定得出真菌 6 个门、24 个纲、71 个目、164 个科、300 个属、427 个种,将不同样品中相同的细菌进行合并,共鉴定得出细菌 23 个门、47 个纲、104 个目、161 个科、248 个属、350 个种。其中,人工林健康针叶与天然林健康针叶的真菌及细菌种类数量明显高于人工林感病针叶与天然林感病针叶(人工林健康针叶的真菌种类数量稍高于人工林感病针叶)。表 1 健康与感病红豆杉针叶真菌及细菌物种统计Tab.1 Species statistics of healthy and susceptible Taxus cuspidata needles fungi and bacteria 微生物Microorganism样本Sample门Phylum纲Class目Order科Family属Genus种Species真菌FungiS131650108169222L13193387153204S262463131218306L23184398162218总计62471164300427细菌BacteriaS1203883128190234L191430456988S215255787140200L2111630416886总计2347104161248350 在相似水平为 97%的条件下,与 16S 嵌合体数据库(Gold database)及 ITS 嵌合体数据库:(U-NITE)对比,对所得序列进行聚类分析,图 3 为感病前后人工林与天然林内生真菌和细菌在门水平上的群落结构特征(物种多度占比大于 0.1%的门)。由图 3(a)可知,从真菌分类门水平看,人工林和天然林 4 种样品检测出 3 个相对多度较高的真菌类群,即:子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidio-mycota)及未鉴定出的真菌(unclassified_k_Fun-gi)。其中 S1、L1、S2 和 L2 中子囊菌门的相对多度依次降低,担子菌门的相对多度依次升高。S1 和L1 中Ascomycota 的相对多度分别为83.02%与78.81%,明显高于 S2 和 L2;S2 和 L2 中 unclassified_k_Fungi 的相对多度分别为 29.95%与 33.37%,明显高于 S1 和 L1。31森 林 工 程第 39 卷结果表明,在门水平下,感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同,差异较大的是相对多度;相比于天然林,Ascomycota 在人工林中的相对多度更高。由图 3(b)可知,从细菌分类门水平看,人工林和天然林 4 种样品主要检测出 6 个相对多度较高的细菌类群,即:变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、粘球菌门(Myxococcota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)。其中 Proteobacteria 与 Acti-nobacteriota 为 4 组针叶共有的优势细菌,S1、L1、S2和 L2 中 Proteobacteria 的相对多度分别为 67.44%、35.26%、52.24%和 86.29%;Actinobacteriota 的相对多度分别为 8.14%、58.38%、41.39%和 11.38%。Myxococcota 为 L1 及 S2 共有的优势细菌,分别占比4.74%和 4.66%。Firmicutes 与 Bacteroidota 只在 S1中为优势细菌,Acidobacteriota 只在 L1 中为优势细菌。结果表明,在门水平下,感病前后样品中的细菌群落结构组成及相对多度都发生了较大变化;相比于天然林,人工林中细菌种类更多。（a）真菌（a）Fungal（b）细菌（b）BacterialAscomycotaBasidiomycotaUnclassified_k_FungiOthersS1?L1?S2?L2相对多度（%）Relative?abundance10.80.60.40.2010.80.60.40.20相对多度（%）Relative?abundanceProteobacteriaActinobacteriotaFirmicutesBacteroidotaMyxococcotaAcidobacteriotaOthersS1?L1?S2?L2子囊菌门(Ascomycota);担子菌门(Basidiomycota);未鉴定出的真菌(unclassified_k_Fungi);变形菌门(Proteobacteria);放线菌门(Acti-nobacteriota);厚壁菌门(Firmicutes);拟杆菌门(Bacteroidota);粘球菌门(Myxococcota);酸杆菌门(Acidobacteriota);其他(others)。图 3 内生真菌和细菌在门水平上的群落柱形图Fig.3 Histogram of endophytic fungal and bacterial communities at phylum level 根据物种分类结果,由于样品中所检测出的真菌及细菌种类繁多,许多物种含量很少,因此筛选出优势物种,并对优势真菌及优势细菌进行分类统计并将在 2 组样品中含量均小于 1%的物种合并至其他类别。由图 4(a)可知,从真菌分类属水平看,Genolevuria 属为 S1、L1、S2 和 L2 中共有的优势真菌,占比为 4.97%16.62%。S1 中特有的优势真菌为尾孢属(Cercospora)、副孢霉属(Paramycosphaerel-la)、柱隔孢属(Ramularia)、Mycodiella 属、膜盘菌属(Pezoloma)、小荚孢腔菌属(Sporormiella)和 Arthro-catena 属;L1 中特有的优势真菌为链核盘菌属(Mo-nilinia)、穴壳属(Dothiora)和白孔座壳菌属(Leucos-toma);S2 中特有的优势真菌为 Buckleyzyma 属和Retiarius 属;L2 中 特 有 的 优 势 真 菌 为 银 耳 属(Tremella)、酵母菌属(Mrakia)、弯担菌属(Curviba-sidium)、附球菌属(Epicoccum)、褐银耳属(Phae-otremella)、镰孢属(Fusarium)和赤霉菌属(Gibberel-la)。健康样品 S1 和 S2 中特有的真菌为维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)、柱隔孢属(Ramularia)、Dioszegia 属和 Arthrocatena 属;感病样品 L1 和 L2 中特有的真菌为链格孢属(Alternaria)和盘双端毛孢属(Seimatosporium);人工林样品 S1 和 L1 中特有的真菌为外囊菌属(Taphrina)、短梗霉属(Aureobasidi-um)、亚隔孢壳属(Didymella)和 Claussenomyces 属;天然林样品 S2 和 L2 中特有的真菌为 Buckleyzyma属、多臂菌属(Trichomerium)和 Retiarius 属。由图 4(b)可知,4 组样品中的细菌群落结构组成不尽相同,且相对多度的差异也较大。从细菌分类属水平看,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为 S1、L1、S2 和 L2 中 共 有 的 优 势 细 菌,占 比 分 别 为1.94%、2.71%、14.23%和 6.42%。S1 中特有的优势细菌为 劳 尔 氏 菌 属(Ralstonia)、克 雷 伯 菌 属(Klebsiella)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、代尔夫特菌属(Delftia)、噬氢菌属(Ottowia)、大肠埃希菌-志贺菌属(Escherichia-Shi-gella)、湖沉积杆菌属(Limnobacter)、norank _f _PHOS-HE36 属、黄杆菌属(Flavobacterium)、Clos-tridium_sensu_stricto_8 属和亚硝化单胞菌(Nitro-41第 4 期王俊凯,等:红豆杉健康与感叶枯病针叶内生微生物多样性somonas);L1 中特有的优势细菌为内杆菌属(En-dobacter);S2 中特有的优势细菌为动球菌属(Kineo-coccus)、中村氏菌属(Nakamurella)、湖沼菌属(Lim-nohabitans)、norank_f_norank_o_Gaiellales 属、Klenkia 属和诺卡氏菌属(Nocardioides);L2 中特有的优势细菌为嗜酸菌属(Acidiphilium)。健康样品S1 和 S2 中特有的细菌为劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属(Variovorax)、拟杆菌属(Bacteroides)、中村氏菌属(Nakamurella)、湖沼菌属(Limnohabitans)、norank_f_norank_o_Gaiellales 属和 Klenkia 属;感病样品 L1 和 L2 中特有的细菌为嗜酸菌属(Aci-diphilium);天然林样品 S2 和 L2 中特有的细菌为弗莱德门菌属(Friedmanniella)和克雷伯菌属(Kleb-siella)。（a）真菌（a）Fungal（b）细菌（b）BacterialOthersSporormiellaL2S2S1L1Unclassified_k_FungiOthersGenolevuriaCladosporiumDothioraUnclassified_f_TaphrinaceaeCercosporaUnclassified_p_AscomycotaParamycosphaerellaTaphrinaAureobasidiumUnclassified_f_ValsaceaeVishniacozymaTrichomeriumTremellaBuckleyzymaMrakiaDidymellaUnclassified_p_BasidiomycotaCurvibasidiumUnclassified_f_TrichomeriaceaeRamutariaDioszegiaMycodiellaUnclassified_o_ChaetothyrialesEpicoccumMoniliniaLeucostomaAlternariaPezolomaSeimatosporiumClaussenomycesUnclassified_f_DidymellaceaeRetiariusUnclassified_o_PeosporalesUnclassified_o_erythrobasidialesUnclassified_c_LeotiomycefesPhaeotremellaAtthrocatenaFusariumUnclassified_f_HyaloscyphaceaeMonochaetieUnclassified_o_FilodasidialesGidderella90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%OKOKOKOKOKOKOKOKOK90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%L2S2L1S11174-901-12PseudomonasSphingomonasFriedmanniellaRalstoniaMethylobacterium-methylorubrumVariovoraxP3OB-42PantoeaKineococcusUnclassified_f_acetobacteraceaeKlebsiellaNakamurellaGeobacillusBacteroidesLimnobacterAcidiphiliumUnclassified_f_comamonadaceaeLimnohabitansUnclassified_f_oxalobacteraceaeDelftiaKlenkiaOttowiaEsoherichia?shigellaNorank_f_norank_o_gaiellalesFlavobacteriumEndobacterNorank_f_PHOS-HE36NocardioidesNitrosomonasClostridium_sensu_stricto_8OKOKOKOKOKOKOKOKOKOK90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%MassiliaUnclassified_f_microbacteriace上半圈表示样本中物种组成情况,内层彩带的颜色代表物种,长度代表该物种在对应样本中的相对多度;下半圈表示该分类学水平下物种在不同样本中的分布比例情况,长度代表该样本在某一物种中的分布比例The upper half of the circle represents the species composition in the sample,the color of the inner ribbon represents the species,and the length re-presents the relative abundance of the species in the corresponding sample.The bottom half represents the distribution proportion of species in different samples at the taxonomic level,and the length represents the distribution proportion of the sample in a particular species.图 4 内生真菌和细菌在属水平上的 Circos 图Fig.4 Circos diagram of endophytic fungi and bacteria at the genus level2.3 群落结构多样性分析2.3.1 Alpha 多样性由表 2 可知,本研究将相似度为 97%的序列划分为 1 个 OTU,进行多样性指数计算,并以 5 个衡量指数详细列出了 4 组样品中微生物的丰富度和多样性分布情况。所有样品真菌及细菌的覆盖度(Coverage)均超过 99.67%,表明真菌及细菌的测序深度已达到较高水平,数据可靠。感病前后人工林与天然林 4 组红豆杉针叶样品中真菌与细菌群落的 Alpha 多样性指数部分有差异。4 组样品的真菌与细菌群落中 S2(天然林健康样品)的 Chao1 指数最高,即测得 OTU 数最高,其次分别为 L2(天然林感病样品)、S1(人工林健康样品)和 L1(人工林感病样品),样品 S1 及 L1 的Chao1 指数差异不显著,Ace 多样性指数所表现的多样性规律与 Chao1 多样性指数结果一致。表明天然林样品的真菌与细菌丰富度指数高于人工林样品;在天然林及人工林中,健康样品的真菌与细菌丰富度指数高于感病样品,但人工林健康样品与感病样品相差不大。51森 林 工 程第 39 卷4 组样品的真菌与细菌群落中 S1 的 Shannon指数最高,其次分别为 S2、L2、L1,4 组样品的真菌与细菌群落中 Shannon 指数均差异较大,Simpson 多样性指数所表现的多样性规律与 Shannon 多样性指数结果相反。表明健康样品的真菌与细菌多样性指数高于感病样品;相比于天然林,在人工林中,健康样品的真菌与细菌多样性指数明显高于感病样品。表 2 Alpha 多样性指数统计Tab.2 The Alpha diversity index of statistics微生物Microorganism样本SampleAc