二代测序建库中福尔马林固定石蜡包埋标本DNA超声打断方法的优化效果观察.pdf

论 著24 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 二代测序建库中福尔马林固定石蜡包埋标本 DNA 超声 打断方法的优化效果观察李余发，许 洁（南方医科大学附属广东省人民医院 病理科 广东 广州 510010）【摘要】目的：分析 24 例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本 DNA 采用新的改良的超声打断方法得到的结果与原打断方法得到结果的一致性，进一步优化目前福尔马林固定石蜡包埋样本 DNA 超声打断方法。方法：收集广东省人民医院病理科 2023 年 45 月进行二代测序检测病例 24 例，建库过程中根据使用的打断方法不同分为两组，1 组采用原DNA 打断方法（打断条件为：稀释后样本转移入配套的 microTUBE AFA Fiber Snap-Cap 打断管），2 组采用改良 DNA打断方法（打断条件为：稀释后样本转移入一次性超声波核酸打断耗材），比较两组实验结果是否一致。结果：两组实验结果得到的插入片段大小均150 bp，符合二代测序实验需要，差异无统计学意义（P0.05）。结论：在临床实践中，二代测序建库过程中采用新的福尔马林固定石蜡包埋标本 DNA 超声打断方法可以达到原方法的实验效果，且更加经济实惠，从而能降低二代测序实验成本，值得在临床应用。【关键词】DNA；超声打断；福尔马林固定石蜡包埋；二代测序【中图分类号】R445.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2023）20-0024-04Optimization of DNA ultrasonic interruption method for Formalin-fixed and paraffin-embedding samples in the Second Generation Sequencing DatabaseLI Yufa,XU JiePathology Department,Guangdong Provincial Peoples Hospital of Southern Medical University(Guangdong Academy of Medical Sciences),Guangzhou,Guangdong 510010,China【Abstract】Objective To investigate the consistency between the results of 24 Formalin-fixed and paraffin-embedding(FFPE)sample DNA using the new improved ultrasonic interruption method and the results obtained by the original interruption method,and further optimize the current formaldehyde fixed paraffin embedded sample DNA ultrasonic interruption method.Methods A total of 24 cases of second-generation sequencing were collected from the Department of Pathology of Guangdong Provincial Peoples Hospital from April to May 2023,and were divided into two groups according to the different interruption methods used during the construction of the database.The first group was treated with the original DNA interruption method(the interruption condition was:After dilution,the samples were transferred into the matching microTUBE AFA Fiber Snap-Cap interrupting tube),and the improved DNA interrupting method was adopted in the second group(the interrupting condition was:After dilution,the samples were transferred into disposable ultrasonic nucleic acid interrupting consumables).The final experimental results of the two groups were compared.Results The insertion fragment sizes obtained from both experimental groups were greater than 150 bp,which meeted the needs of second-generation sequencing experiments,and the difference was not statistically significant(P 0.05).Conclusions In clinical practice,the new Formaldehyde fixed paraffin embedded DNA ultrasonic interruption method can achieve the experimental effect of the original method in the process of building the second generation sequencing database,and it is more economical,which can reduce the cost of the second generation sequencing experiment,its worth of the clinical promotion.【Key words】DNA;Ultrasonic interruption;Formalin-fixed and paraffin-embedding(FFPE);Second generation sequencing下一代测序（next generation sequencing,NGS）可以发现隐匿的单基因突变、多基因突变以及融合基因等异常，这对于肿瘤的诊断及辅助诊断非常重要；可以获得多基因多位点的突变信息，并利用这些突变信息为患者选择合适的靶向治疗1。临床靶向测序的方法主要分为多重扩增子测序和杂交捕获测序 2 条技术路线，目前应用的主要是液相杂交捕获测序，即基于碱基互补配对原理，设计合成核酸探针，对 DNA 文库进行基于液相环境的目标区域杂交富集，并进行测序。杂交捕获法建库流程首先需要将待测序的 DNA 分子用超声波打碎成 200 500 bp 长的片段，短的 DNA 片段有利于进行 DNA 分子快速杂交和高灵敏目标基因检测。NGS 分为实验操作和生物信息分析，包括众多的实验处理和分析环节2，首先将模板 DNA 随机打断成小片段，短的片段有利于进行 DNA 分子快速杂交和高灵敏目标探测，然后对上百万条甚至数十亿 DNA 片段进行测序，最后，通过生物信息学分析，这些小片段会被拼接成长片段。常见的 DNA分子片段化方法有 4 种，分别为：DNA 限制性酶切法、论 著 医药前沿 25医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 水动力剪切法、超声波断裂法和喷射雾化法。其中，超声波断裂法被广泛应用于现代基因组研究中，因为它是一种简便、有效的 DNA 机械降解方法3。本实验应用Covaris M220 超声打断仪，采用改良打断方法对福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed and paraffin-embedding,FFPE）标本 DNA 进行打断，得到比较满意的结果，现报道如下。1 资料与方法1.1 主要仪器与试剂超声波打断仪（美国，Covaris M220），microTUBE AFA Fiber Snap-Cap 打 断 管（美 国 Covaris，货 号006806），一次性超声波核酸打断耗材（元码基因科技有限公司，货号 Geneis-GC001），生物分析仪（美国，Agilent，2100），核酸定量仪（美国，Life，Qubit 4.0），梯度 PCR 仪（新加坡，Veriti），高通量测序仪（美国，Illumina，NextSeqDx550），核酸定量仪（美国，Life，Qubit 4.0）；石蜡标本 DNA 提取试剂盒 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（德国，Qiagen，56404），QUBIT dsDNA HS Assay（Life,Q32856），EGFR/ALK/ROS1/BRAF/KRAS/HER2 基因突变检测试剂盒（南京世和医疗器械有限公司）。1.2 标本来源选取广东省人民医院病理科 2023 年 45 月 24 例FFPE 标本，均为手术大标本，其中结直肠癌 9 例，肺癌9 例，乳腺癌 6 例；男性 14 例，女性 10 例。1.3 方法1.3.1 DNA 提取 切取 5 m 厚度组织 6 片，切片贴于干净的玻片上。二甲苯脱蜡至水后，按照 HE 染色片所选取的肿瘤区域小心用无菌刀片将肿瘤组织刮入1.5 mL 的 EP 管中。应用石蜡组织 DNA 抽提试剂盒提取DNA。1.3.2 核酸降解等级分级 取上一步提取 DNA 样品约0.2 g，用质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察条带的集中上限，A 级：电泳后主带 2 500 bp；B 级：主带在 1 500 2 500 bp；C 级：主带 1 500 bp。1.3.3 Covaris M220 超声打断仪对样品进行处理 根据样本 DNA 浓度使用 Tris EDTA（pH8.0）将样本稀释至总量为 200 ng（体积 50 L），每个样本各稀释两管，按照仪器说明书进行操作。1.3.4 每个样本根据打断方法不同进行分组 1 组打断条件为：稀释后样本转移入配套的 microTUBE AFA Fiber Snap-Cap 打断管（Covaris,006806），持续时间：70 s；最高入射功率）：50 W；工作系数：20%，超声波作用于样品过程中超声波能量传递的数目：200；温度：4 8。2 组打断条件为：稀释后样本转移入一次性超声波核酸打断耗材（元码基因，Geneis-GC001），持续时间：70 s；最高入射功率：75 W；工作系数：10%；超声波作用于样品过程中超声波能量传递的数目：200，温度：4 8。1.3.5 二 代 测 序 建 库 实 验 将 上 一 步 提 取 的样 本 DNA 随 机 打 断 后 应 用 EGFR/ALK/ROS1/BRAF/KRAS/HER2 基因突变检测试剂盒建库，最后得到 20 L 终文库，对其进行质控：使用核酸定量仪对其浓度进行定量，5 ng/L 合格；使用 2100 生物分析仪对打断后的样本片段进行评估，打断后的 DNA 的片段要求 200 550 bp 占比 50%，且主峰在 250 450 bp。1.3.6 二代测序上机 两组终文库在 NextSeqDx550高通量测序仪上机测序，根据 NextSeqDx550 高通量测序仪标准操作流程操作，对下机数据 Q30 值及簇通过率进行质控：Q30 是基因检测技术中使用的常见指标，一般要求 75%，它表示测序质量得分，一般来说，基因检测的Q30越高，测序的质量就越高，即测序的准确度越高，相反的，如果 Q30 较低，说明测序片段质量和准确度较低，数据分析加以处理时可能会出错；簇通过率是指在二代测序中，原始序列经过过滤和质量控制后，能够成功被分配到簇中的比例，一般要求75%，簇通过率越高，说明测序数据的质量越好，能够更准确地进行后续的分析和解读。1.4 统计学方法使用 SPSS 20.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料采用均数标准差（x-s）表示，行t检验；计数资料用频数和百分率 n（%）表示，组间比较采用2检验。P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果24 例 FFPE 标本提取的 DNA 中，A 级 11 例，B 级9 例，C 级 4 例。NextSeqDx550 高通量测序仪下机数据质控均合格（Q30 80%，簇通过率 85%）。二代测序检测的结果显示，经2种方法进行DNA打断后，评级为A、B、C 级的 DNA 插入片段范围保持在 190 250 bp，符合二代测序的质控要求，两组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。此外，2 组的成本远低于 1 组，大约为其1/10。见表 1。论 著26 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 表 1 两组福尔马林固定石蜡包埋标本提取的 DNA 超声打断结果比较核酸评级1 组打断方法2 组打断方法插入片段/bpQ30/%插入片段/bpQ30/%A21584.2521086.05B20883.1122885.11B21584.9922784.33A22284.4820385.27A22182.2621384.20A24684.1420783.77A26583.4320885.10C20085.0122285.64A21083.6320885.24A22884.3924182.96C19584.0022083.08B24084.6023582.39B20484.6922083.27A23883.8022983.35B20083.2620281.69B21083.8720681.51B23183.9620481.18A23583.2620781.70B22584.0021282.16B21683.4520679.10B20683.5219679.93C20783.6121082.25C19884.1421381.94A23483.1520382.073 讨论有学者以 DNA 长链和小鼠基因组 DNA 短链为实验材料，对气泡增强超声DNA破碎系统的性能进行测试，结果表明气泡是超声 DNA 破碎的有效增强剂，可以明显提高整个溶液的声压级，从而达到更好地吸收超声能量的目的。这种气泡增强的超声方法可以在标准的超声水浴中广泛获得基因组 DNA 片段，即使没有良好的医疗设施，也可以满足许多病毒测序的要求4。超声波破碎仪的基本原理是将电能通过换能器转换为声能，当声能穿过含水介质时变成密集的小气泡，随着气泡炸裂而产生机械剪切力对 DNA 等物质进行打断。将 DNA 剪切到一定大小是许多医学和生物学应用的第一步，尤其是在下一代基因测序技术中。Covaris M220 超声打断仪基于自动声波聚焦技术，可以非常快速和完全地进行均质化，样本回收效率高，重复性好，是目前国内主要使用的方法。工作中根据本实验室样本情况设定合适平均入射功率，在确定打断平均功率之后，还可以通过改变打断时间来调整打断效果，随着打断时间的增加，打断片段的大小也随之变小，反之亦然。目前，Illumina 测序平台已成为主要使用平台。在使用 Illumina 测序仪进行测序时，每个测序片段的长度通常为 150bp2。采用双端测序时，所需的样本 DNA 片段长度约为 300 bp 左右。若 DNA 片段过长或过短，均无法以高效且经济实惠的方式实现高通量测序实验。若片段过长，会影响后续的测序效果并降低测序量。而若片段过短，会导致测序读长减少，增加测序成本和后续拼接的工作量。因此，在进行测序之前，首要任务是获取适当长度的核酸片段。病理科使用的 FFPE 标本受固定处理等多种因素的干扰，会导致DNA发生变性和断裂。甲醛（福尔马林）与 DNA 发生反应形成羟甲基基团以及高度不稳定的 Carboxonium 离子，从而导致 DNA 的变性和断裂，形成较短的 DNA 片段。同时，由于组织中残留一定量的核糖核酸酶，会持续降解 DNA5-7。插入片段长度是指 DNA 文库插入片段长度的中位数，体现了原始 DNA 片段的长度分布，组织样本如果小于 150bp 则提示 DNA 存在比较严重的降解，可能会引入由于 DNA 损伤造成的假阳性。碱基质量 Q30 占比是指测序数据中碱基质量在 Q30 以上（即错误率在千分之一以下）的占比，Q30 值越高，代表碱基被测错的概率越小，测序的质量越好。本文结果显示，评级 A、B及 C 的 DNA 经 2 种打断方法得到插入片段范围一致，差异无统计学意义（P 0.05），且 Q30 均 80%，符合二代测序检测质控需要。相关研究显示使用 Covaris 配套的 microTUBE AFA Fiber Snap-Cap 打断管进行超声打断时，单个样本打断时间过长，打断管的液面上方管壁有比较多的小水滴，存在打断不均匀的风险，影响 DNA破碎效率；同时由于其开口不密闭，容易引入打断仪水槽中的水造成污染，且 Covaris 仪器价格较高，通过超声剪切（100 600 m）玻璃微珠和超声波浴，对 550 250 bp DNA 片段的破碎条件进行了优化，将裂解结果与Covaris 仪器的几种特性进行了比较，得到了几种适合于Illumina NGS 平台的细菌 NGS 文库8-10。本研究选用一次性超声波核酸打断耗材，不仅价格比 Covaris 配套的microTUBE AFA Fiber Snap-Cap 打断管便宜，且由于其配有密闭的盖子，可以很好地预防交叉污染，并可通过调整打断平均功率以及改变打断时间从而达到与原打断方法一致的打断效果。一次性超声波核酸打断耗材还具有以下优点：为单个容器，通过机械力打断核酸，得到某一范围的核酸目的片段，具有非接触、等温无热损伤、无偏向、能量可控、重现性好、标准化、易用性、避免交叉污染和样本损失等优点。综上所述，利用 Covaris M220 超声打断仪片段化基因组 DNA，使用改良的方法对 FFPE 标本的下机插入片段几乎没有影响，可以获得比较理想的片段，并且适用论 著 医药前沿 27医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 于所有评级的样本，由于采用低成本的打断管，从而达到降低二代测序实验成本的目的。【参考文献】1 黄清洁，陈天东，陈海瑞，等基于二代测序的 300 例非小细胞肺癌中驱动基因突变与临床病理特征的关系 J临床与实验病理学杂志，2019,35(3)286-290.2 时姗姗，张智弘二代测序技术检测临床 FFPE 样本文库制备中的问题与对策 J临床与实验病理学杂志，2022,38(12)1504-1506.3 GARAFUTDINOV R R,GALIMOVA A A,SAKHABUTDINOVA A R,et al.PCR-based evaluation of sequence specificity of DNA fragmentation by ultrasound J.Mol Biol(Mosk),2016,50(2):272-278.4 SUN L,LIU Y,LEHNERT T,et al.The enhancement of DNA fragmentation in a bench top ultrasonic water bath with needle-induced air bubbles:simulation and experimental investigation J/OL.Biomicrofluidics,2022,16(4):044103.https:/doi.org/10.1063/5.0101740.5 杨军，张标，马恒辉，等FFPE 组织提取 DNA 样本质量评价的多中心调研 J临床与实验病理学杂志，2018,34(6):691-695.6 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