高原林蛙线粒体全基因组序列测定及系统发育分析.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.054高原林蛙线粒体全基因组序列测定及系统发育分析张湑泽1,2,董 豹1,哈金强1,赵 英1,魏生楠1,韦迎婷1(1.青海民族大学 生态环境与资源学院,西宁 810007;2.青海省特色经济植物高值化利用重点实验室,西宁 810007)摘 要 利用二代测序技术 Illumina 平台对高原林蛙(Rana kukunoris)线粒体进行低覆盖全基因组测序,对线粒体基因组进行获取、拼接与注释,获得高原林蛙线粒体全基因组序列,序列全长 21 913 bp,主要包括 tRNA 基因(22 个)、rRNA 基因(2 个)、CDS(13 个)和 D-loop(1 个)4 部分。除轻链中的 NAD6 外,其他蛋白质编码基因都在同一条链上。在编码基因中,共发现 3 个重叠基因:COX1/trnS2、ATP6/ATP8 和 NAD4L/NAD4。高原林蛙线粒体基因组具有 AT 偏好性,蛋白质编码基因中氨基酸使用最频繁的是 Leu 和 Ser,tRNA 基因都有经典的三叶草结构。KaKs分析显示,高原林蛙线粒体基因组编码基因未检测到正选择作用。基于高原林蛙线粒体全基因组构建的系统发育树表明,高原林蛙与中国林蛙亲缘关系最近。研究结果将为高原林蛙的起源、分化和遗传多样性研究提供数据支持。关键词 高原林蛙;线粒体全基因组;序列分析;系统发育;物种分化中图分类号 Q951+.3文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0054-08Complete mitochondrial genome sequence and phylogenetic analysis of Rana kukunorisZHANG Xuze1 2 DONG Bao1 HA Jinqiang1 ZHAO Ying1 WEI Shengnan1 WEI Yingting1 1.College of Eco-Environment and Resources Qinghai Minzu University Xining 810007 China 2.Qinghai Provincial Key Laboratory of High Value Utilization of Characteristic Economic Plants Xining 810007 China Abstract The high-throughput sequencing of illumina platform was used to sequence the whole mitochondrial genome of Rana kukuno-ris.Then the mitochondrial genome was assembled and annotated.The total length of the sequence was 21 913 bp which mainly in-cluded four parts tRNA gene 22 rRNA gene 2 CDS 13 and D-loop 1.Except NAD6 in the light chain other protein cod-ing genes were on the same chain.Of the coding genes three overlapping genes were found COX1/trnS2 ATP6/ATP8 and NAD4L/NAD4.Mitochondrial genome of Rana kukunoris had AT preference.Leu and Ser were the most frequently used amino acids in protein coding genes and all tRNA had the classic clover structure.KaKs analysis showed that the coding genes of mitochondrial genome were not significantly positively selected in Rana kukunoris.The phylogenetic tree constructed based on the whole mitochondrial genome showed that Rana kukunoris was closely related to Rana chensinensis.It provided the genetic information of Rana kukunoris mitochondri-al genome and aid future investigation of phylogenetics speciation and evolution of Rana genus.Keywords Rana kukunoris mitochondrial genome sequence analysis phylogeny species differentiation 高原林蛙(Rana kukunoris),隶属于无尾目(Anu-ra)蛙科(Ranidae)林蛙属(Rana),是青藏高原特有种1。高原林蛙曾被认为是中国林蛙的亚种,属于中国林蛙复合体。谢锋等2将中国西北地区的林蛙种群分为两个有效种,即中国林蛙和高原林蛙,以 Nikol skii 等于 1918 年在青海湖采集的高原林蛙(Rana amu-45第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-04-23;最后修回日期:2022-06-30基金项目:青海省自然科学基金项目(2020-ZJ-965Q);青海民族大学校级规划项目(2021XJGH15);青海省动物生态基因组学重点实验室开放课题项目(QHEG-2019-04)作者简介:张湑泽,硕士,副教授,研究方向为高原两栖动物多样性与进化,E-mail:zxz1904 rensis kukunoris Nikol skii 1918)标本为模式标本。江建平等3采用 Cytb 基因对高原林蛙不同居群之间的遗传多样性进行分析,基于分子生物学证据确定高原林蛙是林蛙属单独物种,染色体 2n=24。Chen 等4发现高原林蛙存在两性异型现象;Zhou 等5认为青藏高原隆升和气候环境变化促进中国林蛙复合体物种形成,且中国林蛙部分群体与高原林蛙存在渐渗杂交现象;基于 Cytb 基因的高原林蛙群体进化分析,发现青藏高原东北部高原林蛙存在多个冰期避难所,并在祁连山南北形成两个高度分化的世系6;米志平等7研究了高原林蛙皮肤结构,发现其皮肤形态特征与其他物种不同,推测可能因为生活在高海拔地区,生存环境气温低,水分不易蒸发;张湑泽等8对青藏高原东北部高原林蛙皮肤结构观察发现,高原林蛙对青藏高原环境有明显的适应性;Yang 等9通过林蛙属 3 个物种线粒体全基因组序列,分析蛙科的进化关系。Wang等10对来自贺兰山的高原林蛙的线粒体全基因组开展测序,进行系统发育分析。但以上研究还未对高原林蛙线粒体基因组具体编码信息、基因结构、遗传多样性和分子进化开展分析。线粒体 DNA 不仅具有结构简单、无重复、母系遗传和进化速率快等特点11-13,还具有很高的专一性和独特性,是动物系统发育分析和物种鉴定的重要工具14。探究线粒体结构可以为物种起源、分化和系统发育分析提供良好的参考。如今越来越多的学者通过对线粒体基因组的研究分析物种间的进化关系15-17。本研究基于高原林蛙线粒体全基因组,对其组成和结构进行分析,以期对高原林蛙遗传多样性、分类地位和物种保护进行深入研究。1 材料与方法1.1 材料高原林蛙样本于 2020 年 6 月采自青藏高原东北部青海湖周边黑马河镇(363726.63 N,1000720.82 E,3 194 m)。样本采集后保存于 95%乙醇中,采用标准苯酚/氯仿法从高原林蛙肌肉组织中提取基因组DNA,采用 Illumina NovaSeq 平台进行测序,测序读长为 PE150,测序获得 5G 数据量,使用 fastp(version 0.20.0,https: 据 进 行 过 滤,获 得 Clean Data 总 碱 基 数 为6 972 984 300 bp,用 SPAdes 组装成一个完整的高原林蛙线粒体基因组。线粒体基因组全长为 21 913 bp,该序列已经提交 NCBI 基因数据库(GenBank 登录号:MZ043820)。另有下载自 GenBank 的 25 份其他物种的线粒体全基因组序列,并参照 NCBI 上所提交的高原林蛙线粒体全基因组序列(MN733918 和 KU246049)开展分析。实验样本信息见表 1。表 1 用于系统进化分析的物种线粒体 DNA 序列信息Table 1 Mitochondrial DNA sequence of species forphylogenetic analysisGenBank登录号GenBankaccession No.线粒体基因组大小Mt DNA size/bp物种SpeciesNC02352918 808中国林蛙 Rana chensinensisKF84051622 255昆嵛林蛙 Rana kunyuensisMK48311820 120峨眉林蛙 Rana omeimontisKP22228117 343北美洲木蛙 Rana sylvaticaMW52698918 291大别山林蛙 Rana dabieshanensisKT58807119 253桓仁林蛙 Rana huanrensisMF37034820 571黑龙江林蛙 Rana amurensisNC02352818 864东北林蛙 Rana dybowskiiKM59055015 765韩国林蛙 Rana coreanaKP01311017 805加利福尼亚红腿蛙 Rana draytoniiMN21868719 205镇海林蛙 Rana zhenhaiensisKU24604818 591昭觉林蛙 Rana chaochiaoensisMN73391816 644高原林蛙 Rana kukunorisKU24604918 863高原林蛙 Rana kukunorisKX68610817 681牛蛙 Rana catesbeianaNC04222616 061欧洲林蛙 Rana temporariaKU72030017 211比利斯牛蛙 Rana pyrenaicaMZ57136517 873越南趾沟蛙 Rana johnsiKP01309617 504佛罗里达沼泽蛙 Rana okaloosaeMT78212119 207桑植蛙 Rana sangzhiensisNC03232817 656中亚林蛙 Rana asiaticaMW00906717 370上野蛙 Rana uenoiMZ68052919 395寒露林蛙 Rana hanluicaMZ68052817 833长肢林蛙 Rana longicrusOL46732117 779武夷林蛙 Rana wuyiensisKP31748217 837高山倭蛙 Nanorana parkeriHQ32423217 660倭蛙 Nanorana pleskei1.2 方法1.2.1 全序列特征分析采用 SPAdes v 3.10.1(http:cab.spbu.ru/soft-ware/spades/)软件组装线粒体基因组,组装不依赖参考基因组。使用 Perl 脚本进行计算,包括碱基组成与偏移分析、密码子偏好性。使用 OGDRAW(https:chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)制作线粒体基因组图谱。使用 Mitos2(http:mitos2.bioinf.uni-leipzig.de)对组装好的序列进行注释,获得 tRNA二级结构。55第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.20231.2.2 高原林蛙线粒体基因组编码基因 KaKs 分析使用 mafft v 7.310(https:mafft.cbrc.jp/align-ment/software/)软件进行基因序列的比对18,使用KaKsCalculator v 2.0(https: 值19。1.2.3 遗传距离分析基于 Kimura 2-parameter 碱基替代模型,使用软件 MEGA11.020计算高原林蛙与其他林蛙属之间的遗传距离。1.2.4 系统进化分析基于测序获得的高原林蛙线粒体全基因组序列和GenBank 上下载的 25 条林蛙属物种线粒体全基因组序列以及 2 条倭蛙属线粒体全基因组序列开展系统发育分析,物种间序列用 MAFFT 软件(v7.427,auto 模式)进行多序列比对,将比对好的数据用 BioEdit 编辑21,使用 RAxMLv8.2.1022(https:cme.h-its.org/exelixis/software.html)和 jModeltest 2.1.723软件进行分析,选用 GTR+GAMMA 模型,构建最大似然进化树,Bootstrap=1 000。2 结果与分析2.1 高原林蛙线粒体全基因组序列分析高原林蛙线粒体全基因组序列总长 21 913 bp,包括 22 个 tRNA 基因、2 个 rRNA 基因、13 个蛋白质编码基因和 1 个 D-loop 区。其中,蛋白质编码基因序列全长11 287 bp,tRNAs 总长 1 530 bp,rRNAs 总长 2 503 bp。高原林蛙线粒体全基因组序列中 A、T、G、C 的碱基含量分别为 28.41%、30.17%、14.28%和 27.13%(图 1),A+T 的碱基含量为 58.58%,G+C 的碱基含量为 41.42%,表现出明显的 A+T 偏好性。不同物种在其基因组上各有差异,表 2 所示为高原林蛙线粒体 DNA 上的 D-loop 区、RNA 基因、蛋白质编码基因所在位置、蛋白质编码基因的密码子、起始密码子和终止密码子。表 2 高原林蛙线粒体基因组结构Table 2 Mitochondrial genome structure of Rana kukunoris基因Gene位置Location长度Length/bp结构区位置Strand密码子Codon反密码子Anticodon起始密码子Star codon终止密码子Stop codonD-loop16 3236 323+trnL16 3246 39572+TAGtrnT6 3986 46770+TGTtrnP6 4686 53669-TGGtrnF6 5386 60770+GAArrnS6 6087 535928-trnV7 5377 60569+TACrrnL7 6089 1821 575+trnL29 1829 25473+TAANAD19 25510 212958+ATT/TAAATTTAAtrnI10 21310 28371+GATtrnQ10 28410 35471-TTGtrnM10 35410 42269+CATNAD210 42311 4551 033-ATG/TATATGTATtrnW11 45611 52570+TCAtrnA11 52611 59570-TGCtrnN11 59611 66873-GTTtrnC11 69711 76165-GCAtrnY11 76211 82867-GTACOX111 83313 3831 551+ATA/AGGATAAGGtrnS213 37513 44571-TGAtrnD13 44713 51567+GTCCOX213 51614 203688+ATG/CCTATGCCTtrnK14 20414 27269+TTTATP814 27414 435162+ATG/TAAATGTAAATP614 42915 110682+ATG/CTTATGCTTCOX315 11115 894784+ATG/CATATGCATtrnG15 89515 96268+TCCNAD315 96316 302340+ATG/AGTATGAGT65第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023续表 2(Continued Table 2)基因Gene位置Location长度Length/bp结构区位置Strand密码子Codon反密码子Anticodon起始密码子Star codon终止密码子Stop codontrnR16 30316 37169+TCGNAD4L16 37216 656285+GTG/TAAGTGTAANAD416 65018 0091 360+ATG/TCTATGTCTtrnH18 01018 07869+GTGtrnS118 07918 14567+GCTNAD518 14819 9531 806+ATG/AGGATGAGGNAD620 20420 698495-ATG/CATATGCATtrnE20 69920 76769-TTCCOB20 77121 9131 143+ATG/TAAATGTAA图 1 高原林蛙线粒体基因组序列结构图谱Figure 1 Sequence map of mitochondrial genome of Rana kukunoris2.2 高原林蛙蛋白质编码基因分析高原林蛙线粒体基因组共有13个蛋白质编码基因,包括 1 个 Cytb 基因,2 个 ATP 酶(ATP6、ATP8),3个氧化酶亚基(COX1、COX2、COX3)和 7 个脱氢酶亚基(NAD1、NAD2、NAD3、NAD4、NAD4L、NAD5、NAD6)。在高原林蛙线粒体基因组中,L 链和 H 链都有蛋白质编码基因,但是除了 NAD6 以外,其他蛋白质编码基因都在 H 链上。在编码基因中共发现 3 个重叠基因:COX1/trnS2、ATP6/ATP8、NAD4L/NAD4。重叠基因在表达、调控及进化过程中具有重要作用24。除了 NAD1 以 ATT 起始密码子、COX1 以 ATA 起始密码子和 NAD4L 以 GTG 起始密码子外,其余 10 个蛋白质编码基因(NAD2、NAD3、NAD4、NAD5、NAD6、COX2、COX3、ATP6、ATP8)均以 ATG 为起始密码子。13 个蛋白质编码基因总长 11 287 bp,A、T、G、C 含量分别为 25.18%、30.69%、15.08%和 29.05%,A+T 的总含量为 55.87%。所有蛋白质编码基因均呈现 AT碱基偏好性(表 3)。高原林蛙线粒体基因组中各蛋白质编码基因氨基酸使用情况如图 2 所示,结果表明,13 个蛋白质编码的基因中氨基酸使用最频繁的是 Leu 和 Ser。密码子使用最频繁的为 GCC、GCU、CAA、ATA、TCC、ACA,而使用较少的密码子为 GCG、CAG、CCG、ACG、TCG。表 3 高原林蛙线粒体 DNA 蛋白质编码基因核苷酸含量Table 3 Nucleotide content of the protein-coding genes of Rana kukunoris mitochondrial DNA基因 GeneA/%T/%C/%G/%AT/%GC/%NAD123.3832.2531.2113.1555.6344.37NAD227.4030.1130.8811.6257.5142.49COX125.0829.7927.6617.4754.8745.13COX230.0927.1827.3315.4157.2742.73ATP832.7229.0127.7810.4961.7338.27ATP624.6332.4030.9412.0257.0342.97COX322.3230.4829.9717.2252.8047.20NAD319.4133.2431.4715.8852.6547.35NAD4L24.9130.8831.5812.6355.7944.21NAD426.2530.3730.8812.5056.6243.38NAD526.0831.4028.5214.0157.4842.52NAD632.9318.9935.7612.3251.9248.08COX24.8530.1031.5013.5654.9545.0575第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023图 2 高原林蛙线粒体基因组蛋白质编码基因的密码子偏好性Figure 2 RSCU of protein coding gene in mitochondrial genome of Rana kukunoris2.3 高原林蛙 tRNA 基因结构分析高原林蛙线粒体基因组上共有 22 个tRNA 基因,总长度 1 530 bp,范围从 65 bp(trnC)73 bp(trnL2,trnN),A、T、G、C 的含量分别为 29.35%、28.37%、22.16%和20.13%,其中,8 个 tRNA 基因(trnP、trnQ、trnA、trnN、trnC、trnY、trnS2、trnE)位于 L 链上,其余 14 个 tRNA 基因在 H 链上。通过生物信息学分析对高原林蛙线粒体基因组编码 22 个 tRNA 的二级结构进行预测,结果表明:22 个 tRNA 基因都有经典的三叶草结构(图 3);在 22 个 tRNA 基因的二级结构中出现了碱基错配现象,其中最多的为 A-C 错配。图 3 高原林蛙线粒体基因组编码的 tRNA 二级结构Figure 3 Secondary structure of tRNA encoded by mitochondrial genome of Rana kukunoris85第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.20232.4 高原林蛙 rRNA 基因结构分析高原林蛙的 mtDNA 中 2 个 rRNA 的长度分别为928 bp(rrnS)和 1 575 bp(rrnL),两者相距 69 bp,被trnV 隔开,A、T、G、C 的含量分别为 32.60%、23.89%、18.58%和 24.93%,A+T 的偏倚度为 0.154。2.5 高原林蛙线粒体基因组编码基因 KaKs 分析高原林蛙线粒体基因组 13 个编码基因与林蛙属其他物种线粒体基因组序列进行 KaKs 分析(表 4),Ka/Ks 值均小于 1(P0.05),表明高原林蛙线粒体基因组编码基因未受到正选择作用25-26。2.6 林蛙属遗传距离分析对包括高原林蛙在内的林蛙属 24 个物种进行基于线粒体全基因组的遗传距离分析。结果表明(表5):对不同地区高原林蛙,青海湖高原林蛙种群与若尔盖高原林蛙种群遗传距离最近,与贺兰山高原林蛙种群遗传距离较远,遗传距离为0.003;对不同物种来说,高原林蛙与中国林蛙、桓仁林蛙遗传距离最近,遗传距离分别为 0.032 和 0.046;与北美洲木蛙、佛罗里达沼泽蛙、牛蛙遗传距离最远,遗传距离分别为 0.188、0.183 和 0.183。表 4 高原林蛙线粒体基因组编码基因 KaKs 分析Table 4 Analysis of KaKs encoding gene in mitochondrial genome of Rana kukunoris物种 Species登录号 GenBank accession No.KaKsKa/KsRana huanrensis 桓仁林蛙KT5880710.1202.1310.06Rana chensinensis 中国林蛙KF8983560.0701.1210.06Rana dybowskii 东北林蛙KF8983550.4376.2850.07Rana chaochiaoensis 昭觉林蛙KU2460480.8758.7250.10Rana kukunoris 高原林蛙MN7339180.0070.0510.13Rana asiatica 中亚林蛙NC_0323280.6857.4520.09表 5 基于线粒体全基因组的林蛙属种内遗传距离分析Table 5 Intraspecific genetic distance of Rana genusR1234567891011121314151617181920212223242526R.kunyuensisR.dybowskii0.160R.chensinensis0.155 0.119R.coreana0.010 0.160 0.155R.okaloosae0.184 0.186 0.186 0.184R.draytonii0.172 0.175 0.167 0.173 0.168R.sylvatica0.188 0.194 0.191 0.188 0.149 0.168R.huanrensis0.154 0.117 0.050 0.154 0.183 0.166 0.192R.chaochiaoensis 0.160 0.154 0.150 0.161 0.190 0.173 0.193 0.148R.pyrenaica0.153 0.148 0.140 0.153 0.179 0.160 0.182 0.140 0.148R.asiatica0.149 0.138 0.132 0.149 0.171 0.150 0.177 0.128 0.145 0.110R.catesbeianus 0.185 0.187 0.186 0.185 0.059 0.167 0.150 0.182 0.190 0.177 0.170R.amurensis0.111 0.155 0.150 0.111 0.184 0.169 0.186 0.152 0.157 0.151 0.143 0.185R.temporaria0.153 0.149 0.142 0.154 0.178 0.158 0.183 0.141 0.150 0.081 0.114 0.179 0.150R.kukunoris0.153 0.115 0.033 0.153 0.184 0.166 0.188 0.046 0.146 0.138 0.128 0.183 0.151 0.141R.sangzhiensis0.173 0.165 0.166 0.174 0.205 0.185 0.209 0.169 0.118 0.163 0.156 0.205 0.166 0.161 0.163R.omeimontis0.169 0.162 0.164 0.170 0.199 0.180 0.204 0.166 0.113 0.159 0.155 0.198 0.161 0.159 0.162 0.080R.dabieshanensis 0.170 0.162 0.165 0.172 0.197 0.181 0.204 0.166 0.111 0.158 0.153 0.199 0.163 0.160 0.161 0.080 0.040R.zhenhaiensis 0.185 0.179 0.178 0.185 0.217 0.199 0.218 0.179 0.127 0.177 0.169 0.218 0.182 0.179 0.175 0.090 0.087 0.084R.johnsi0.165 0.165 0.159 0.166 0.179 0.162 0.185 0.161 0.163 0.145 0.139 0.180 0.161 0.151 0.156 0.175 0.171 0.171 0.188R.kukunoris0.153 0.115 0.032 0.153 0.183 0.166 0.188 0.046 0.146 0.139 0.128 0.183 0.151 0.141 0.003 0.163 0.162 0.162 0.175 0.157R.hanluica0.168 0.161 0.161 0.169 0.199 0.180 0.202 0.164 0.113 0.158 0.152 0.200 0.161 0.157 0.158 0.008 0.074 0.074 0.082 0.169 0.158R.longicrus0.168 0.162 0.162 0.168 0.200 0.181 0.205 0.166 0.114 0.159 0.154 0.200 0.164 0.162 0.160 0.086 0.081 0.083 0.040 0.171 0.160 0.078R.wuyiensis0.165 0.166 0.159 0.166 0.180 0.162 0.184 0.161 0.163 0.148 0.137 0.180 0.161 0.150 0.157 0.173 0.172 0.171 0.190 0.030 0.157 0.169 0.171R.uenoi0.154 0.110 0.116 0.154 0.185 0.173 0.190 0.114 0.150 0.148 0.140 0.187 0.151 0.148 0.113 0.163 0.160 0.160 0.175 0.160 0.114 0.158 0.160 0.161R.kukunoris0.153 0.115 0.032 0.153 0.184 0.166 0.189 0.046 0.146 0.139 0.128 0.183 0.151 0.141 0.003 0.163 0.162 0.162 0.175 0.157 0.000 0.158 0.160 0.157 0.1142.7 高原林蛙与林蛙属其他物种的系统进化关系根据高原林蛙和林蛙属其他物种线粒体全基因组序列,以高山倭蛙和倭蛙为外群,采用最大似然法(maximum likelihood method,ML)构建系统发育树,结果如图 4 所示,青海湖高原林蛙与若尔盖高原林蛙聚为一支,再与贺兰山高原林蛙聚为一支,与中国林蛙、95第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023桓仁林蛙形成姊妹群,东北林蛙、昭觉林蛙等聚为一支;韩国林蛙、昆嵛林蛙和黑龙江林蛙聚为一支,这表明三者亲缘关系最近,可能是因为三者分布的地理位置较近。欧洲林蛙与比利斯牛蛙和中亚林蛙聚为一支,越南趾沟蛙27和武夷林蛙聚为一支。牛蛙与佛罗里达沼泽蛙聚为一支,与北美洲木蛙形成姊妹群。高山倭蛙和倭蛙设置为外群。图 4 基于林蛙属 26 条线粒体全基因组序列构建的最大似然树Figure 4 The maximum likelihood tree constructed based on 26 mitochondrial genome sequences of the genus Rana3 讨论与结论线粒体基因组在真核生物中具有高度保守性,是遗传进化分析的重要分子标记28-29。线粒体基因组测序及分析是两栖动物遗传多样性研究的重要方式30。林蛙属线粒体基因组序列长度大约为 18 kb,通常包括13 个蛋白质编码基因,22 个 tRNA,2 个 rRNA 和 1 个控制区(CR)。高原林蛙线粒体 基因组长度 约为22 kb,与昆嵛林蛙接近31。研究采集的高原林蛙样品来自高原林蛙模式标本产地青海湖,具有更好的代表性。测定的青海湖高原林蛙线粒体基因组的组成结构与林蛙属其他物种相似,全长 21 913 bp,其中,控制区长度为 6 323 bp,AT 含量 58.58%,呈现 AT 碱基偏好性32。贺兰山高原林蛙线粒体全基因组由 13 个蛋白质编码、22 个 tRNA、2 个 rRNA 基因和 1 个控制区(CR)组 成,总 长 度 为 16 644 bp,控 制 区 长 度 为837 bp,核 苷 酸 成 分 为A 27.49%、T 29.06%、G 14.77%、C 28.68%,AT 含量为 56.55%10。若尔盖高原林蛙线粒体全基因组组成基因与以上两者相同,其总长度为 18 863 bp,控制区长度为 3 272 bp,种群核苷酸含量与其接近9。三者的线粒体基因组除控制区外序列长度分别为 15 590、15 807 和 15 591 bp,无明显差异。因此,造成青海湖高原林蛙线粒体基因组全长较长的原因主要是其控制区长度较长。在 13 个蛋白质编码基因中发现 3 个重叠:ATP8/ATP6、NAD4L/NAD4 和 NAD5/NAD6,这种重叠在其他两个高原林蛙线粒体中也都存在。在高原林蛙线粒体基因组中,L 链和 H 链都有蛋白质编码基因,除了NAD6 外,其余蛋白质编码基因都在 H 链上,高原林蛙3 个种群结构基本相似。高原林蛙 13 个蛋白质编码基因中氨基酸使用最频繁的是 Leu 和 Ser,密码子使用最频繁的有 GCC、GCU、CAA、ATA、TCC 和 ACA。高原林蛙 22 个 tRNA 的二级结构都具有经典的三叶草结构,出现碱基错配现象,其中最多的为 A-C 错配。在林蛙属线粒体全基因组序列中,这种序列长度和碱基组成差异主要是因为 D-loop 区重复以及串联重复元件数目变化9,33。基于高原林蛙线粒体基因组 13 个蛋白编码基因与林蛙属其他物种线粒体基因组的 KaKs 分析表明,高原林蛙线粒体基因组编码基因中没有检测到正选择信号,可能与两栖动物基因组相对较慢的进化速率有关34。青藏高原东北部地区分布的高原林蛙居群之间存在河流孤岛效应,基于 Cytb 基因的高原林蛙谱系地理分析发现,高原林蛙在祁连山地区具有明显的冰期避难所,形成两个世系:一个世系在末次冰期后经历了种群数量的突然扩张,向南迁徙到达横断山区;另一世系在祁连山北麓不同河流周边形成了斑块状生境6。高原林蛙贺兰山种群与中国林蛙黄土高原种群分布存在重叠,这种地理重叠可能导致线粒体基因组交流与渐渗,并与中国林蛙产生渐渗杂交现象,导致遗传结构产生了一定变化5。这表明 mtDNA 序列数据可以作为基因渗入研究的遗传标记35。研究发现,青海湖高原林蛙与若尔盖高原林蛙聚为一支,再与贺兰山高原林蛙形成姊妹群,进一步支持了高原林蛙南北世系的有效性6,也支持高原林蛙与中国林蛙存在最近共同祖先。两栖动物由于对气候变化敏感,且生存繁衍离不开水,分布的范围往往表现出边缘效应和距离隔离36,其种群衰退和灭绝速度更快37。遗传多样性是物种适应环境变化的基础,对物种起源、分化、多样性分析具有重要意义38。青藏高原东部地区高原林蛙种群分布广泛,遗传多样性高,应通过对栖息地保护,保护其遗传多样性。研究结果将为高原林蛙的起源、分化和遗传多样性研究提供数据支持。参考文献 1 费梁 叶昌媛 江建平.中国两栖动物彩色图鉴 M.成都 四川科学技术出版社 2010 310-311.2 谢锋 叶昌媛 费梁 等.中国西北地区中国林蛙各居群的分类学研究 两栖纲 蛙科 J.动物分类学报 2000 25 2 228-235.06第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023 3 江建平 谢锋 郑中华.我国林蛙分子系统关系及染色体演化的研究 J.四川大学学报 自