高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂.pdf

Food and Fermentation Science&Food and Fermentation Science&TechnologyTechnology收稿日期：2022-10-07作者简介：胡燕（1982-），女，博士，高级工程师。研究方向：茶叶资源开发与利用及茶叶检测等。引用格式：胡燕.高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂 J.食品与发酵科技，2023，59（4）：137-142.高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂胡燕（1.雅安市质量检验检测院（雅安市食品药品检验所），四川雅安 625000；2.国家茶叶产品质量检验检测中心（四川），四川雅安 625000）摘要：建立使用高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂的方法。采用ZORBAX SB C18色谱柱（250mm4.6mm，5m）进行分离，以甲醇和0.02mol/L乙酸铵为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测样品，检测波长为254nm；确立样品的最佳前处理条件，采用聚酰胺吸附法提取合成着色剂。结果表明，5种合成着色剂在0.050.0g/mL范围内具有良好的线性关系，样品的平均加标回收率为91.9%97.8%；14个茶叶样品中均未检出柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝。该方法适用于对茶叶中添加柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝的测定，可为茶叶产品的质量控制提供一定的参考。关键词：茶叶；非法添加；合成着色剂；高效液相色谱法；水溶性色素中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1674-506X（2023）04-0137-0006Determination of Five Synthetic Colorants Illegally Added in TeaSamples by High Performance Liquid ChromatographyHU Yan（1.Yaan Quality Inspection and Testing Institute（Yaan Institute for Food and Drug Control），Yaan Sichuan 625000，China；2.National Tea Product Quality Inspection and Testing Center（Sichuan），Yaan Sichuan 625000，China）Abstract：It established a method of determining five synthetic colorants illegally added in tea samples byHPLC.The analysis was performed on a ZORBAX SB C18column（250 mm4.6 mm，5 m），using methanol and0.02 mol/L ammonium acetate system for gradient elution by diode array detector to detect samples at thewavelength of 254 nm.Established optimum pretreatment conditions，and the synthetic colorants were extractedbypolyamideadsorption.Theresultsshowedthatallfivesyntheticcolorantshadgoodlinearityintheconcentration range of 0.050.0 g/mL，and the average recoveries for tea samples were in the range of91.9%97.8%.Tartrazine，amaranth，coccinellin，sunset yellow and erioglaucine disodium salt werent detectedin 14 tea samples.The method was suitable for the determination of tartrazine，amaranth，coccinellin，sunsetyellow and erioglaucine disodium salt in tea samples and will provide helpful information for quality controlsof tea.Keywords：tea；illegally add；synthetic colorant；high performance liquid chromatography；water-solubility colourdoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2023.04-022茶叶的色泽是鉴别不同茶类及其质量优劣的一项重要感官指标，色素物质是形成茶叶色泽的基础，其是茶叶中具有生物活性的一系列天然色素的总称，主要由水溶性色素和脂溶性色素组成1，如叶胡燕：高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂2023年第4期绿素、类胡萝卜素、花青素以及在茶叶加工过程中由多酚类物质经氧化缩合作用形成的茶黄素类（TFs）、茶红素类（TRs）、茶褐素类（TBs）等2。天然色素一般无毒害作用，茶色素具有防癌抗癌、清除自由基、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗龋护齿等多种药理和保健功能3。柠檬黄、苋菜红等人工合成着色剂主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应化合而成，这些合成着色剂虽然具有色泽鲜艳、稳定性好、着色力强、易溶解、易调色、生产成本低等优点4-8，但其化学中间体和成品均具有一定的毒性，可影响人体的细胞代谢和酶活力，引起过敏、腹泻等症状，还可能对人体的肾脏、肝脏和神经系统造成危害，影响儿童的智力发育9，甚至能致癌、致胎儿畸形和致基因突变等，因此各国均严格控制其应用范围和使用量10-16，我国的GB 27602014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准17也对合成着色剂在食品中允许使用的品种、范围和限量作了严格的规定，其中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝均禁止在茶叶和茶制品中使用。在茶叶加工及贮存过程中，其色泽易受光、热、氧等因素的影响而发生变化，从而使茶叶丧失商品价值；一些不法商家通过添加人工合成着色剂来改变劣质或变质茶叶的感官品质；而现有国家标准没有专门针对茶叶中合成着色剂的检测方法，对茶叶中掺入该类物质的检测也鲜有报道。由于茶叶中所含成分的复杂性，为保证茶叶产品的质量安全，防止不法商家使用劣质茶叶以次充好，以不同类别的14个市售茶叶样品为实验材料，参考国家标准GB 5009.352016 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定18，确立了样品的最佳前处理条件，采用高效液相色谱法（HPLC）19建立了检测茶叶中非法添加柠檬黄、苋菜红等5种合成着色剂的方法，以期为茶叶中非法添加物检测方法的研究开发提供实验依据，为监管部门对茶叶产品的质量控制提供一定的技术支持和参考。1材料与方法1.1材料与试剂试验所用茶叶样品均为市售茶叶，共14个（序号114），茶样信息见表1。柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准物质（0.50 mg/mL），国家标准物质研究中心；乙酸铵、无水乙醇、氨水，均为分析纯，天津永大化学试剂有限公司；柠檬酸、甲酸、乙酸，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），美国 Fisher 公司；聚酰胺粉（100200目），国药集团化学试剂有限公司；0.45m滤膜，天津津腾实验设备有限公司。1.2仪器与设备U3000 高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器），赛默飞世尔科技公司；BT125电子天平，德国赛多利斯股份公司；HH-S数显恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司；GN-RO-20型纯水机，北京双峰纯水设备厂；SG3300HPT超声波清洗器，上海冠特超声波仪器有限公司；DFY-200万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；VELOCITY 18R台式冷冻离心机，澳大利亚Dynamica公司；WH-3微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；20目筛，浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；G3垂融漏斗，上海垒固仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1合成着色剂标准溶液配制分别取浓度为0.50 mg/mL的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准物质各2.5 mL于同一容量瓶（25mL）中，加水定容至刻度，配成浓度分别为50.0 g/mL的合成着色剂混合标准溶液；吸取1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL上述混合标准溶液，分别加水定容至10mL作为系列标准工作液，每1mL该系列标准工作液中，分别相当于含5.0、10.0、20.0、25.0、表1茶叶样品Tab.1Tea samples序号1234567891011121314样品名称雅安藏茶青砖茶红茶红茶绿毛峰绿茶乌龙茶铁观音白牡丹寿眉蒙顶黄芽霍山黄芽茉莉花茶毛峰飘雪产地四川雅安市雨城区湖北赤壁云南临沧四川雅安市名山区四川雅安市雨城区四川雅安市名山区四川雅安市名山区福建安溪福建宁德福建宁德四川雅安市名山区安徽霍山四川雅安市雨城区四川雅安市名山区茶叶类别黑茶黑茶红茶红茶绿茶绿茶青茶青茶白茶白茶黄茶黄茶花茶花茶138第59卷（总第236期）胡燕：高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂50.0g柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝。1.3.2样品制备前处理方法1：将序号为3的红茶样品粉碎后过20目筛，准确称取2.0g筛上物于150mL锥形瓶中，加入60纯水75mL左右，超声提取10min，随后置于60恒温水浴中30min，取出后滴加柠檬酸溶液（200g/L）调样品溶液的pH值到6，将1.5g聚酰胺粉加少许水调成粥状后倒入样品溶液中，搅拌片刻使着色剂充分吸附，然后将装有样品溶液的锥形瓶再放置于60 恒温水浴中15 min并不停搅拌，取恒温后的样品溶液以 G3 垂融漏斗抽滤，用60 pH 4的纯水（纯水加柠檬酸溶液调pH到4）洗涤5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液（6 4，v/v）洗涤5次，再用60 纯水洗涤至流出液呈中性，舍弃收集的流出液，另取一洁净的抽滤瓶，用无水乙醇-氨水-水混合溶液（7 2 1，v/v/v）解吸 5 次，每次5 mL，直至色素完全解吸，收集解吸液，加乙酸中和，倒入蒸发皿中，置水浴上蒸发至近干，加纯水溶解后定容至5 mL，经0.45 m滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。前处理方法2：将序号为3的红茶样品粉碎后过20目筛，准确称取2.0g筛上物于离心管中，加20mL无水乙醇 氨水 水混合溶液（7 2 1，v/v/v），漩涡混匀后超声提取10 min，离心10 min（5 000 r/min），重复提取1次，合并上清液，倒入蒸发皿中，加乙酸中和，置水浴上蒸发至近干，加纯水溶解后定容至5 mL，经0.45m滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。前处理方法3：准确称取序号为3的红茶样品5.0g于离心管中，加入20mL纯水，漩涡混匀后超声提取 10 min，离心 10 min（5 000 r/min），重复提取1次，合并上清液于50mL容量瓶中，用纯水定容，经0.45m滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。前处理方法 4：准确称取序号为 3 的红茶样品 5.0 g 于离心管中，加入 20 mL 60 纯水，漩涡混匀后置于 60 水浴中恒温 10 min，离心 10 min（5000r/min），重复提取1次，合并上清液于50mL容量瓶中，冷却后定容，经0.45m滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。前处理方法5：准确称取序号为3的红茶样品5.0g于离心管中，加入20mL沸水，漩涡混匀后置于沸水浴中10 min，离心10 min（5 000 r/min），重复提取1次，合并上清液于50mL容量瓶中，冷却后定容，经0.45m滤膜过滤后进高效液相色谱仪测定。1.3.3色谱条件流动相 A 为甲醇，流动相 B 为 0.02 mol/L 乙酸铵溶液，梯度洗脱程序见表 2；色谱柱为 ZORBAXSB C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），检测波长为254 nm，柱温为35，流速为1.0 mL/min，分析时间为22min。进样量为10L。表2流动相梯度洗脱程序Tab.2Procedure of gradient elution in mobile phase时间/min01481111.122流动相A/%553510010055流动相B/%9595650095951.3.4方法学考察线性关系和检出限：将“1.3.1”中5个浓度的5种合成着色剂混合标准溶液按“1.3.3”中的色谱条件分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归分析；用信噪比S/N3时的浓度计算方法检出限。精密度试验：将浓度为25.0 g/mL 的 5 种合成着色剂混合标准溶液按“1.3.3”中的色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算RSD值。重复性和加标回收率试验：分别称取序号为8的铁观音茶叶样品2.0 g，每份茶样按线性范围分别加入1mL浓度为50.0g/mL的5种合成着色剂混合标准溶液，按“1.3.2”中的前处理方法1平行制备6份供试品溶液，按“1.3.3”中的色谱条件分别进样，测定5种合成着色剂的含量，计算RSD值，考察方法的重复性，同时计算加标回收率。稳定性试验：称取序号为8的铁观音茶叶样品2.0g，加入1mL浓度为 50.0 g/mL 的 5 种合成着色剂混合标准溶液，按“1.3.2”中的前处理方法1制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h，按“1.3.3”中的色谱条件进样检测，测定5种合成着色剂的峰面积，考察样品提取液的稳定性。2结果与分析2.1方法学考察2.1.1线性关系与检出限实验结果表明，5种合成着色剂的浓度与其峰1392023年第4期面积呈良好的线性关系，相关系数在 0.999 81.0000之间，具体结果和方法检出限见表3，5个浓度的 5 种合成着色剂混合标准溶液的 HPLC 图谱见图1。2.1.2精密度试验计算得柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为 0.28%、0.29%、0.30%、0.33%、1.56%，表明仪器的精密度良好。2.1.3重复性和加标回收率试验由表4可知，5种合成着色剂的平均加标回收率在 91.9%97.8%之 间，重 复 性 试 验 的 RSD 在0.36%0.88%之间，表明试验方法的重复性良好。2.1.4稳定性试验计算得柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝峰面积的RSD分别为0.28%、0.39%、0.41%、0.36%、2.33%，表明样品提取液在10h内稳定。2.2测定波长的选择采用二极管阵列检测器扫描得柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝在可见光区的最大吸收波长分别为427、521、509、486、630nm，由图2可知，当选择427 nm作为检测波长时，苋菜红、胭脂红的响应值较低，当选择521nm或509nm作为检测波长时，柠檬黄无响应，当选择486nm作为检测波长时，亮蓝无响应，当选择630 nm作为检测波长时，亮蓝有较大响应值，但柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄在此检测波长下均无响应。利用二极管阵列检测器的多通道检测功能可使五种合成着色剂均在其最大吸收波长处测定，从而可大大提高各种合成着色剂特别是亮蓝的响应值；也可利用二极管阵列检测器的波长切换功能，将亮蓝的检测波长设为630 nm（见图3）；但目前检验检测实验室中液相色谱仪普遍使用的紫外检测器可能不具备多通道检测或波长切换功能，因此，从综合情况考虑，适当牺牲亮蓝的响应值，按照国标方法15统一采用254nm作为检测波长，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄在合成着色剂名称柠檬黄苋菜红胭脂红日落黄亮蓝保留时间/min5.6416.0136.8877.4828.498线性范围/（g/mL）0.050.00.050.00.050.00.050.00.050.0线性方程Y0.3368XY0.3593XY0.3354XY0.3393XY0.0622X相关系数R21.00001.00000.99980.99981.0000方法检出限/（mg/kg）0.200.250.350.301.00表35种合成着色剂的线性方程、线性范围、相关系数及方法检出限Tab.3The linear equations，linearity ranges，correlation coefficients and method detection limitsof the five synthetic colorants图1不同浓度的5种合成着色剂混合标准溶液的HPLC图谱Fig.1HPLC chromatogram of the mixed standard solutionof five synthetic colorants with different concentrations470100200300404mAU4.335.006.257.508.7510.0010.87时间/min1-柠檬黄2-苋菜红3-胭脂红4-日落黄5-亮蓝表4茶叶样品的加标回收率和重复性试验结果（n6）Tab.4The results of recovery and repeatability tests of the tea samples added standards（n6）合成着色剂名称柠檬黄苋菜红胭脂红日落黄亮蓝样品本底值/（g/mL）NDNDNDNDND加标量/g50.050.050.050.050.0测定值范围/（g/mL）9.359.459.329.499.459.689.059.279.679.86测定均值/（g/mL）9.419.429.619.199.78相对标准偏差/%0.360.630.880.830.82平均回收率/%94.194.296.191.997.8注：“ND”表示未检出或小于方法检出限。140第59卷（总第236期）胡燕：高效液相色谱法检测茶叶中5种非法添加合成着色剂此波长下均有较高的响应，而且在梯度洗脱时基线平稳，适合于基层单位检验检测工作的开展。2.3样品前处理以序号为 3 的红茶为供试品，按“1.3.2”中的5 种前处理方法分别进行样品前处理后测定；同时，前处理方法 1 和方法 2 分别加入 1 mL 浓度为50.0 g/mL的5种合成着色剂混合标准溶液，前处理方法3、4、5分别加入5 mL浓度为50.0 g/mL的5种合成着色剂混合标准溶液，分别计算加标回收率。柠檬黄等5种合成着色剂均属于水溶性化合物，在水中都有极好的溶解性，前处理方法3、4、5均用水作为提取剂，但由于茶叶中所含成分复杂，茶叶中的水溶性物质会一起被溶解到水提取液中，由图4可知，用前处理方法4和方法5处理后的茶样提取液杂质峰较多，而且随着提取温度的升高，杂质峰的响应值升高，基线波动大。前处理方法2是用无水乙醇-氨水-水（7 2 1，v/v/v）溶液作为提取剂超声提取，处理后的茶样提取液不经净化直接进样，不但杂质峰多，杂质峰的响应值高，而且基线不平稳，长期进样会降低色谱柱的寿命。前处理方法1参照国家标准GB 5009.35201618中的聚酰胺吸附法并略有改动，聚酰胺是具有二极性的化合物，聚酰胺粉末在弱酸性溶液中对色素的吸附力强，易与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离，再经水洗、酸洗除去杂质后在碱性条件下解吸色素，解吸液经蒸发除去氨和乙醇后定容；粉碎茶样溶液在加入聚酰胺粉末后溶液易呈糊状，当用G3垂融漏斗抽滤时茶样粉末易堵塞漏斗砂芯，因此，将茶样粉碎后过20目筛，称取筛上物进行实验，这样大大加快了抽滤的速度，缩短了前处理时间；由图4可知，用前处理方法1处理后的茶样提取液杂质峰少，杂质峰的响应值较低，基线平稳。前处理方法3是用水作为提取剂超声提取，虽然提取液的杂质峰少，但由表5可知，该前处理方法的回收率低，综合考虑，选择前处理方法1可以达到较好的检测效果。2.4样品的测定按“1.3.2”中的前处理方法1制备14个茶叶样品的供试品溶液，按“1.3.3”中的色谱条件进样检测，每个样品平行测定3次，不同类别茶叶样品制备液的HPLC图谱见图5；除不称取茶样外，按“1.3.2”中的前处理方法1制备空白对照样品，14个茶叶样品和空白对照样品中均未检出柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝。图35种合成着色剂混合标准溶液在程序检测波长下的HPLC图谱Fig.3HPLC chromatogram of mixed standard solution of fivesynthetic colorants at program detection wavelength1000200400600mAU0.02.04.06.08.010.0时间/min254nm630nm1-柠檬黄2-苋菜红3-胭脂红4-日落黄5-亮蓝图4茶叶样品的5种前处理方法的HPLC图谱Fig.4HPLC chromatogram of five pretreatmentmethods for tea samples405001000mAU0.55.010.015.0时间/min前处理2前处理1前处理5前处理4前处理3图25种合成着色剂混合标准溶液在不同检测波长下的HPLC图谱Fig.2HPLC chromatogram of mixed standard solution of five synthetic colorants at different detection wavelengths630nm486nm427nm254nm1-柠檬黄2-苋菜红3-胭脂红4-日落黄5-亮蓝1420200368mAU0.02.04.06.08.010.0 11.0时间/min1-柠檬黄2-苋菜红3-胭脂红4-日落黄5-亮蓝1190200400541mAU509nm521nm427nm254nm1.02.04.06.08.010.012.0时间/min1412023年第4期3结论与讨论色泽是评价茶叶质量的一项重要指标，茶叶中若加入有害着色剂会严重危害消费者的身体健康 20，扰乱市场秩序。目前对食品中合成着色剂的检测，基质比较单一，而对茶叶中添加该类物质的检测鲜有报道。茶叶中添加合成着色剂含量分析的特殊性和复杂性在于样品的基质复杂，本文建立了一种同时检测茶叶中非法添加柠檬黄、苋菜红等5种人工合成着色剂的方法，该方法选择二极管阵列检测器，以甲醇和0.02mol/L乙酸铵为流动相，采用梯度洗脱，检测波长为254nm。经方法学考察，5种合成着色剂在0.050.0 g/mL的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2在0.99981.0000之间，茶叶样品的平均加标回收率在91.9%97.8%之间，重复性试验的RSD在0.36%0.88%之间。对不同前处理方法进行了比较分析，最终选用前处理方法1，采用聚酰胺粉吸附色素，G3垂融漏斗抽滤，用酸化甲醇淋洗除去天然色素和水溶性杂质，乙醇氨水溶液洗脱，用HPLC对茶叶样品制备液进行测定；该方法稳定、提取效果好、回收率高，精密度和重复性良好，处理后的样品提取液纯净，采用的色谱条件出峰较快、峰形良好，可为茶叶中非法添加合成着色剂提供便捷、可靠的检测方法，本实验中随机购买的14个不同类别的市售茶叶样品经检验均未检出合成着色剂，表明产品安全可靠。该研究建立的茶叶中非法添加合成着色剂的探索性鉴别检测方法可为对市场上茶叶产品的监督提供一定的判定依据，同时为制定相关茶叶检测标准奠定理论基础。参考文献1 宛晓春，黄继轸，沈生荣，等.茶叶生物化学 M.北京：中国农业出版社，2003：194.2 陈键，王丽丽，宋振硕.茶叶色素研究进展 J.茶叶科学技术，2013（4）：13-16.3 宛晓春，李大祥，夏涛.茶色素及其药理学功能 J.天然产物研究与开发，2001，13（4）：65-70.4 朱海英，黄万琪.食品安全法背景下合成色素的问题及对策 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