药用植物内生菌的研究进展_叶云祥.pdf

药用植物内生菌的研究进展叶云祥1，2金夕雨1郭铃1，*(1 浙江省丽水学院生态学院丽水323000;2 浙江省丽水市云和县教育发展中心丽水323600)摘要药用植物内生菌研究对推动中药产业发展具有重要意义。本文对近年来药用植物内生菌的多样性、分离鉴定、代谢产物等方面的研究进展和技术难点进行综述，并对未来的重点研究方向进行展望，以期为生物学教学提供资料。关键词药用植物内生菌多样性分离鉴定代谢产物药用植物是指能直接用药或能提取药物的植物，是传统医学中天然药物的重要来源1，2。我国药用植物有 10000 多种，但绝大多数为野生。受自然繁殖能力低、环境破坏和过度采掘等因素影响，一些野生药用植物资源产量低、质量差3，4。传统的观点认为药用植物的产量和质量受环境和遗传因素的影响，然而随着植物微生物组学研究的发展，发现植物与其内生菌的相互作用也是影响药材产量和质量的重要因素4。研究表明，一些植物内生菌可以通过产生吲哚乙酸等植物生长激素促进宿主植物生长5。近年来，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌活性的植物内生微生物次生代谢产物的发现为天然药物的研发和生产提供了重要研究思3 李彦斌，齐青，郑晓慧，等 植物细胞内膜运输调控机制及相关前沿电子显微镜技术应用的研究进展J 厦门大学学报(自然科学版)，2022，61(3):4464584 CUI Y，ZHAO Q，HU S，et al Vacuole biogenesis in plants:howmany vacuoles，how many models?J Trends in Plant Science，2020，25(6):5385485 CHISPEELS MJ，AGE P Aquaporins:water channel proteinsof plant and animal cells J Trends in Biochemical Sciences，1994，19(10)4214256 MAUEL C，CHISPEELS MJ Aquaporins A molecular entryinto plant water relations J Plant Physiology，2001，125(1):1351387 雷琴，夏敦岭，任小林 水孔蛋白与植物的水分运输J 水土保持研究，2005，(3):81858 梅杨，李海蓝，杨尚元，等 植物水孔蛋白的功能J 植物生理学通讯，2007，(3):5635689 于秋菊，吴锜，林忠平，等 植物水孔蛋白研究进展J 北京大学学报(自然科学版)，2002，(6):855866 10 JOHANSSON I，KALSSON M，JOHANSON UThe role ofaquaporins in cellular and whole plant water balance J Biochimica Et Biophysica Acta Biomembranes，2000，1465(12):324342 11 ALF K，MATTHIAS F Functional aquaporin diversity in plantsJ Biochimica Et Biophysica Acta Biomembranes，2006，1758(8):11341141 12 DIEHN TILL A，POMMEENIG B，BENHADT N，et alGenome-wideidentificationofaquaporinencodinggenesinBrassica oleracea and their phylogenetic sequence comparison toBrassica crops and Arabidopsis J Frontiers in Plant Science，2015，6:120 13 李露露，曲长凤，郑洲，等 藻类水通道蛋白的研究进展J 生物技术通报，2017，33(8):16 14 黄崇政，白玲 植物液泡膜水通道 0 蛋白的结构、分布和功能研究进展 J 基因组学与应用生物学，2019，38(4):17191725 15 UEHLEIN N，OTTO B，DAVID T，et al Function of Nicotianatabacum aquaporins as chloroplast gas pores challenges the conceptof membrane CO2permeability J The Plant Cell，2008，20(3):648657 16 MIZUTANIM，WATANABES，NAKAGAWAT，etalAquaporin NIP2;1 is mainly localized to the E membrane andshows root-specific accumulation in Arabidopsis thaliana J Plant and Cell Physiology，2006，47(10):14201426 17 JIANG L，OGES JCIntegral membrane protein sorting tovacuoles in plant cells:evidence for two pathways JTheJournal of Cell Biology，1998，143(5):11831199 18 PAIS N，STANLEY CM，JONES L，et al Plant cells containtwo functionally distinct vacuolar compartmentsJ Cell，1996，85(4):563572 19 GUSTAVSSON S，LEBUN AS，NODN K，et al A novelplant major intrinsic protein in Physcomitrella patens most similar tobacterial glycerol channels J Plant Physiology，2005，139(1):287295 20 MAUEL C，SANTONI V，LUU DT，et al The cellular dynamicsof plant aquaporin expression and functionsJ Current Opinionin Plant Biology，2009，12(6):69069821 WUDICK MM，LUU DT，MAUEL C A look inside:localizationpatterns and functions of intracellular plant aquaporins J NewPhytologist，2009，184(2):289302 22 LI XJ，WANG XH，YANG Y，et al Single-molecule analysis ofPIP2;1 dynamics and partitioning reveals multiple modes ofArabidopsis plasma membrane aquaporin regulation J The PlantCell，2011，23(10):37803797 23 SINGH K，DESHMUKH，MUTHAMILAASAN M，et alVersatile roles of aquaporin in physiological processes and stresstolerance in plants J Plant Physiology and Biochemistry，2020，149:178189 24 MANUELACCPlantaquaporinsJ ActaBiologicaMarisiensis，2019，2(2):3648 5生物学教学2023 年(第 48 卷)第 5 期路6。本文对药用植物内生菌的多样性、分离鉴定、代谢产物等方面的研究进展和技术难题进行综述。1药用植物内生菌的多样性内生菌是指生活史某一阶段在健康的寄主植物体内，但暂时对寄主组织并不引起明显病症的细菌或真菌3，4。研究表明，几乎所有被研究的植物体内都存在内生菌7。不同植物种类内生菌种类和数量不同，不同地理环境的同一种类宿主植物的内生菌种类和数量也存在明显差异6。内生菌在植物体各器官和组织中分布，内生菌之间具有相互作用，并各自占据不同的生态位，建立一种生态平衡8。药用植物内生菌具有丰富的物种多样性。真菌是植物内生菌中最丰富的类群，目前国内外已报道来源于药用植物组织的 376 属以上的内生真菌，其中主要包括子囊菌、担子菌和无孢类群。子囊菌中的镰刀菌属(Fusarium)、链 格 孢 属(Alternaria)、青 霉 菌 属(Penicillium)、曲 霉 菌 属(Aspergillus)、刺 盘 孢 属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、炭 角 菌 属(Xylaria)等 是 优 势 菌群3。植物内生细菌中研究较多的为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和芽孢菌属(Bacillus)9。植物内生放线菌中研究最多的类群为链霉菌属(Streptomyces)，其活性 代 谢 产 物 得 率 也 较 高;其 次，诺 卡 氏 菌 属(Nocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)和小单孢菌属(Micromonospora)较为常见10。2药用植物内生菌的分离与鉴定内生菌分离的首要工作是植物表面消毒，通常在超净工作台的无菌环境中进行，常采用的消毒剂是次氯酸钠和酒精3。植物表面消毒的最佳条件可通过改变消毒剂和消毒时间等条件进行摸索。表面消毒法的关键是去除表面微生物的同时，尽可能保留更多的内生菌，以利于开展后续的形态学和分子生物学物种鉴定。植物内生菌的分离主要采用组织块法和研磨法。组织块法是将表面消毒后的植物组织块接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分别进行内生真菌、内生放线菌和内生细菌的分离和纯化;研磨法是将植物组织在无菌环境下研磨并稀释成一定浓度的植物组织匀浆，然后涂布于相应的琼脂培养基上进行内生菌的分离和纯化10。内生菌的形态学鉴定主要依据菌落特征和孢子的着生部位、大小及排列方式等形态特征。某些内生真菌在营养充足的人工培养条件下可能不产生孢子，从而无法进行形态学鉴定。目前研究发现，低温培养、紫外线诱导和低营养诱导等方法可诱导真菌产孢3，4。尽管研究人员采用多种诱导方法，但仍有约 41 3%的内生真菌不产孢，因此形态学鉴定方法存在一定限制性11。随着分子生物学技术的发展与应用，形态学观察结合分子生物学技术可有效解决不产孢内生真菌的分类鉴定难题。可利用通用引物扩增植物各部位内生真菌的 ITS 基因序列以及内生细菌和放线菌的 16SrDNA 序列，然后进行测序，并将测序结果在数据库进行比对或构建系统发育树鉴定内生菌种属3，4。3药用植物内生菌的代谢产物内生菌呈多样性，其代谢产物类型也呈多样性。药用植物内生菌活性代谢产物的研究对于天然新药研发与应用具有重要意义12，目前研究主要聚焦以下两个方面。3 1药用植物内生菌代谢产物的合成机制药用植物内生菌代谢产物研究大多针对真菌和放线菌。众多研究结果证明，内生菌参与宿主植物的生理或代谢过程，或与宿主植物相互作用介导次生代谢产物的积累13。关于内生菌活性代谢产物的合成有以下两种可能的机制:直接合成机制，由内生菌的代谢酶直接合成活性物质;间接合成机制，由内生菌和宿主植物的酶类或前体物质联合作用而增加合成量或生成新型化合物13，14。3 2药用植物内生菌代谢产物及其应用近年来研究者从药用植物内生菌发酵产物中分离的代谢产物繁多，其中包含具有抗肿瘤、抗病原微生物、抗氧化、止血和镇痛等功能的天然活性物质，主要包括生物碱、皂苷类、萜类、环肽类、蒽醌类、黄酮类等13，14。3 2 1抗肿瘤活性物质紫杉醇是一种具有抗肿瘤作用的萜类化合物，在植物中含量低，人工合成困难。但是，已有研究人员从红豆杉属及非红豆杉属植物中分离了多种能产生紫杉醇及其衍生物的内生菌14。除紫杉醇以外，喜树碱、石蒜碱、长春新碱、秋水仙素碱类等也属于抗肿瘤活性的内生菌代谢产物，其中长春新碱是作 为 治 疗 白 血 病 和 淋 巴 瘤 等 病 症 的 重 要药物9。3 2 2抗病原微生物活性物质从药用植物附子中分离的链霉菌属(Streptomyces sp)微生物能产生一种具有抗真菌活性的 2，2 联吡啶类化合物14，15。从荚兰属植物内生菌的代谢产物中分离的芳香倍半萜烯类物质对恶性疟原虫具有显著杀灭活性16。Castillo 等17 从药 用 植 物 Kennedia nigriscans 内 生 菌 StreptomycesNL 30562 中分离了 4 种肽类化合物，具有广谱抗菌活性。药用植物乌头的内生菌黑孢霉(Nigrospora sp)产生的代谢产物对流感病毒 H1N1 具有显著抗病毒活性18。6生物学教学2023 年(第 48 卷)第 5 期3 2 3抗氧化活性及其他活性物质目前已从药用植物内生菌及其次生代谢产物中筛选得到诸多生物碱类、黄酮类、酚酸类、萜类、香豆素类等具有抗氧化活性的物质13，14。这些天然抗氧化活性物质常具有抗炎、抗氧化损伤功能13。例如，甾体皂苷类化合物具有较强的止血和镇痛作用，环肽类化合物 discarine M 具有抗乙酰胆碱酯酶活性14。4内生菌对宿主植物的影响内生菌是植物微生态系统的重要组成部分，尽管内生菌的生物量在宿主植物中的比重较少，但内生菌通过信号传导作用或自身代谢产物对宿主植物产生重要影响，具体可分为下列三个方面。4 1促进宿主植物的生长发育植物活性成分的合成与各种环境因素有关，如光照、温度和微生物等，其中内生菌作为最重要的环境因子参与植物的重要生命过程。内生菌以不同方式促进植物的生长发育。例如，分泌铁载体的促生菌通过增加土壤中的含铁量提高植物对铁的利用率;具有固氮、溶解磷酸盐和钾作用的内生菌通过促进植物吸收氮、磷、钾提高生长能力;产植物激素的内生菌通过提供植物激素促进植物生长9。4 2提高宿主植物的抗逆能力内生菌能通过增强宿主植物中抗逆有关基因的表达，提高相关酶的活性，进而增强宿主植物的环境适应能力19。研究者分别将源于沿海植物、农作物和地热植物中的内生菌定植在目标植株上，可分别获得具有耐盐性、抗病性和耐热性能的植株，而宿主植物离开这些内生菌后也无法在原生栖息地生存6，20。此外，内生菌还可能产生抗生素类化合物、抗菌肽或生物碱等物质提高宿主植物的抗病虫害能力。4 3促进宿主植物活性成分的合成，包括活性物质的含量和种类内生菌促进植物活性成分合成可能存在以下两种途径:内生菌通过影响宿主植物的光合作用物质的积累，使植物营养摄入增加，从而促进宿主药用植物合成次生代谢产物;内生菌诱导子可能诱导宿主植物的靶向基因表达，激活宿主相关代谢途径合成活性物质14。肖丹等21 通过高效液相色谱法检测了人参培养须根及其内生菌中人参皂苷单体的含量，结果显示，内生菌 G22 和宿主植物的活性成分含量符合中华人民共和国药典 2010 版要求。郑雪等22 对黄芪内生真菌的活性代谢物进行检测发现，内生真菌 HZ13 的代谢产物与天然黄芪对照样品在相同保留时间内有对应的色谱峰。以上结果表明，内生菌能产生与宿主植物相同或相似的活性成分，从而增加药用植物活性成分的含量及种类。5展望药用植物及其内生菌是重要的药用资源，有利于天然药物的研究与开发，对民族药和中药产业的发展具有重要推动作用。从药用植物内生菌次生代谢产物中筛选新型活性物质是重点研究方向。目前植物内生菌的研究处于初始发展阶段，我国药用植物种类丰富，迄今为止仅针对数百种药用植物开展了内生菌研究。目前主要存在内生菌分离不完全，菌种特性退化或消失以及次级代谢产物活性成分含量低、不稳定、难分离等几方面问题。未来药用植物内生菌研究可以进一步融合基因组学、蛋白质组学、代谢组学、高通量筛选、基因工程和合成生物学等技术手段，重点研究内生菌株的分离筛选、种质资源库建立、活性成分单体筛选及高效活性成分的生物合成等内容。(基金项目:丽水市公益性技术应用研究项目，No 2022GYX15;*通信作者)主要参考文献1 赵小惠，刘霞，陈士林，等 药用植物遗传资源保护与应用J 中国现代中药，2019，21(11):145614632 AYE MM，AUNG HT，SEIN MM，et alA review on thephytochemistry，medicinal properties and pharmacological activitiesof 15 selected myanmar medicinal plants J Molecules，2019，24(2):2933 谭小明，周雅琴，陈娟，等 药用植物内生真菌多样性研究进展 J 中国药学杂志，2015，50(18):156315804 陈丽媛，孙翠焕 药用植物内生真菌研究进展J 微生物学杂志，2015，35(5):981015 GUO SX，WANG QY Character and action of good strain onstimulating seed germination of Gastrodia elata J Mycosystema，2001，20(3):4084126 常恺莉，张琳，周红英，等 药用植物内生菌资源在农业中的应用与研究进展 J 山东农业科学，2021，53(7):1351417 ALY AH，DEBBAB A，POKSCH P，et al Fungal 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期基于境脉学习的生物学教学设计吴举宏(江苏省教育科学研究院南京210013)摘要境脉学习理论认为，个体学习的过程即为个体学习境脉所构成的内部世界和外部信息发生有意义的交互作用的过程。境脉学习理论重视认知的具身性、情境化和螺旋式，可为生物学教学凸显“有人、有情、有义”的原初教学意义提供良好支持。基于境脉学习的教学设计致力于知识境脉、认知境脉和教学境脉的研究，但是不再满足于知识的逻辑性、认知的发展性和教学的系统性，而是追求有效教学境脉下协调发展具身认知、理性逻辑的有序教学组织。关键词境脉学习教学设计生物学教学应秉持“有人、有情、有义”的“三有教学”理念。“有人”强调以学生为中心的教学，“有情”主张教学的情境化，而“有义”则倡导有意义的学习。当代基础教育的重大危机在于“脱境(decontextualized)”和“离身(disembodied)”1，无论是脱境还是离身的教学，都背离了“三有教学”的基本理念，将学习者及其情感，以及学习的意义，从知识学习中剥离出来并弃至教学之外，课堂教学走上无人、无情、无义的不归之路。境脉学习(contextual learning)理论重视认知的具身性、情境化和螺旋式，可为生物学教学凸显“三有教学”的原初意义提供良好支持。1境脉学习理论的意涵“境脉(context)”一词，英汉词典解释为“上下文”“语境”“文脉”，或者指“人或事存在于其中的各种有关的情况”、来龙去脉、背景、环境等2。这一概念最初用于语言分析，意指决定词语或段落意义的特定语言环境。近年来，“境脉”概念在信息技术、教育理论和学习科学等领域逐渐得到重视和应用。境脉学习理论最初是在美国推出的教育者手册中提出来的，其中境脉是指包括多种因素在内而表现出来的一种协同作用，这些因素不仅包括教学的物理环境，更多关注的是学生的情感、心理、认知等方面3。境脉学习理论认为，学习者学习的内部世界是由自身原有的记忆、经验、动机、情感和反应构成的，学习者处理新的信息和学习新的知识时，关键在于与其内部世界发生意义，个体学习的过程即为个体学习境脉所构成的内部世界和外部信息发生有意义的交互作用的过程。境脉学习理论更关注学习者现有知识结构、学习兴趣、学习动机的分析，强调学习者内部世界对学习的重要性，教师需要深入分析学生的内部世界和外部信息特征，并促进外部学习内容以适合的方式与其内部世界发生有效联结、生成意义。2基于境脉学习的教学设计境脉概念具有强烈的指向性、动态性和整合性。境脉的指向性直指学生(学习主体)，力求全面地观察、探查、捕捉学生学习的相关信息;境脉的动态性意指学生的各种境脉信息总是处在动态发展之中;境脉的整合性强调对学生各种境脉信息的互为关联、相互影响进行研究和梳理，从“境”的多重性、复杂性走向“脉”的承接性和结构性。基于境脉学习的教学设计需要从知识境脉、认知境脉和教学境脉三个方面进行研究，这三者并不是相互游离而独立存在，而是可以互 13 张昊，刘苗苗，刘晓娜，等 内生菌影响药用植物产生药理活性化合物的研究进展J 生物技术通报，2022，38(9):173183 14 杨志军，邓毅，曼琼，等 内生菌在天然药物研究中的研究进展J 中国临床药理学杂志，2018，34(5):593596 15 殷海兴，林家富，褚以文 附子内生放线菌 EA12432 抗真菌次级代谢产物研究 J 中国抗生素杂志，2016，41(9):653657 16 HEMTASIN C，KANOKMEDHAKUL S，KANOKMEDHAKUL K，et al Cytotoxic pentacyclic and tetracyclic aromatic sesquiterpenesfrom Phomopsis archeri J Journal of Natural Products，2011，74(4):609613 17 CASTILLO UF，STOBEL GA，FOD EJ，et al Munumbicins，wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NL 30562，endophytic on Kennedia nigriscansJ Microbiology，2002，148(9):26752685 18 ZHANG SP，HUANG，LI FF，et al Antiviral anthraquinonesand azaphilones produced by an endophytic fungus Nigrospora spfrom Aconitum carmichaeli J Fitoterapia，2016，112:8589 19 MALINOWSKI DP，BELESKY DP Adaptations of endophyte-infected cool-season grasses to environmental stresses:mechanismsof drought and mineral stress toleranceJ Crop Science，2000，40(4):923940 20 ODIGUEZ，EDMAN More than 400 million years ofevolution and some plants still cant make it on their own:plantstress tolerance via fungal symbiosisJ Journal of ExperimentalBotany，2008，59(5):11091114 21 肖丹，杨洪岩，吴昊 高效液相色谱法检测人参培养须根及内生菌中皂苷的含量J 安徽农业科学，2014，42(17):54185421 22 郑雪，徐慧超，李伟，等 东北膜荚黄芪内生真菌的分离及其活性代谢物分析J 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