重庆养殖中华鳖群体遗传多样性的RAPD分析_赵华一.pdf

重庆养殖中华鳖群体遗传多样性的 分析赵华一，刁晓明，李 华，杨焕超，陈彦伶，涂全宇，刘 钊（四川省农业科学院水产研究所，四川成都；西南大学水产学院 重庆三峡生态渔业产业技术研究院，重庆）摘要 目的利用 标记技术对重庆 个养殖地区中华鳖的遗传多样性进行分析。方法选取（潼南、永川、江津、长寿）个地区养殖中华鳖样本，运用 方法对 个地区的中华鳖遗传多样性与其遗传距离进行了分析。结果用 个随机扩增引物得到 个扩增片段，多态片段数量为 个，个地区的多态位点比例范围为 ，总多态位点比例为，总基因多样性为.，种群内基因多样性为，遗传分化系数为，基因流为。个养殖中华鳖群体的遗传距离为。结论重庆 个地区养殖中华鳖遗传多样性较高，且大部分遗传变异存在于种群内，个体间亲缘关系较近，遗传变异度较小。关键词 中华鳖；遗传多样性；重庆地区中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，），（，），.，.，；基金项目 重庆市农业委员会“生态渔产业体系”项目（）；重庆市基础科学与前沿技术研究项目（）；重庆市水产科技创新联盟（）。作者简介 赵华一（），男，土家族，重庆人，研究实习员，硕士，从事渔业生物学方面研究。通信作者，副教授，从事繁殖生物学方面研究。收稿日期；修回日期 中华鳖（）俗称团鱼、甲鱼、王八等，隶属于爬行纲龟鳖目鳖科中华鳖属。我国已报道的中华鳖有 种，均属于鳖亚科。中华鳖在我国除宁夏、新疆、青海及西藏未见报道外，其余各省、市、自治区均有分布。中华鳖在我国是一种重要的经济养殖水生生物。是于 世纪 年代发展起来的第 代分子标记技术，是一种基于 技术的 标记技术。世纪 年代，等运用随机引物扩增技术，即 技术扩增出的多态 片段作为分子遗传标记。等研究也发现，技术检测具有灵敏方便、多态性强的优点。在水产方面，郭珂等运用 技术对赣州水系的鲤鱼进行遗传多样性分析，得出了赣江水系鲤鱼遗传多样性较高的结论。石洪玥等运用 技术对七里海中华绒螯蟹第代繁育群体进行了遗传多样性分析，得到了 个不同的多态位点。林基亮等则利用 技术对青岛鳌山卫和红岛的 个四角蛤蜊自然群体进行遗传多样性研究，并在 个群体中共检测出 个多态位点。刘至治等对黄河鳖、淮河鳖、洞庭湖鳖、鄱阳湖鳖及太湖鳖 个群体进行 分析，结果表明，中华鳖的遗传多样性较丰富，其多态位点比例顺序为：太湖鳖洞庭湖鳖鄱阳湖鳖淮河鳖黄河鳖；黄丽英利用 条随机引物在日本种群、台湾种群、乌鳖种群、太湖种群 个种群中共检测出多样位点 个，其中 总多态百分率占。中华鳖作为我国优质名特优水产品种，在全国范围内都有大量的养殖，但在重庆市中华鳖的养殖上，养殖户追求的是中华鳖的产量与销量及其品质，很少在意其种质及来源，致使重庆地区的中华鳖品种品系较为混乱。且目前关于重庆养殖中华鳖群体的种质研究与遗传研究较少，因此利用分子技术研究重庆养殖中华鳖的遗传多样性对重庆地区中华鳖的养殖与繁育有积极的推进作用。为此，笔者利用 技术从分子水平对重庆地区养殖中华鳖进行遗传多样性分析，旨在为今后如何保护其种质资源及基因库、防止在规模化养殖后造成的基因流失提供理论指导，同时为中华鳖合理开发利用及选择育种提供科学依据。材料与方法 材料 试验用中华鳖样本采样于重庆 个地区（永川来苏、江津珞璜、潼南塘坝、长寿双龙）的中华鳖养殖场。每个地区各取 只中华鳖样本，取裙边肌肉，置于 冰箱保存，后期用来提取。聚合酶采购于上海生工科技有限公司，随机引物和 提取试剂盒采购于上海擎科有限公司，试验仪器主要有 仪、电泳仪和 凝胶成像分析仪。安徽农业科学，（）：，基因组 的提取与 扩增 基因组 的提取与 扩增反应体系。取 中华鳖裙边肌肉组织材料，用上海擎科有限公司 柱式动物基因组 试剂盒提取基因组。扩增引物的选择主要参考刘至治等与肖亚梅等关于中华鳖 相关研究数据，筛选出 对引物。反应体系总体积为 ：，酶 ，引物 ，模板，。扩增程序为：预变性，然后 变性、复性（退火）、延伸，循环次数为，最后在 继续延伸 。完成后置于 环境保存。扩增产物的检测。扩增产物的检测用 对引物对样品进行 扩增，将 产物在 的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，电压为 ，电泳结束后用 凝胶成像分析仪进行观察。数据的分析与处理 琼脂糖凝胶电泳过后，在凝胶成像仪上进行观察，如有清晰可见的扩增条带，则进行试验记录。对于不同个体扩增出来的 条带，如果在胶板上有同一个位置的迁移都视为显性，可以将其赋值为；如果此位置无条带的迁移则视为隐性，将其赋值为。与 可以构成 元数据矩阵，用计算机统计软件 统计其相应结果。将以上统计可以算出多态位点的比例，多态位点比例（）多态位点数 位点数，算出 氏遗传相似指数（）。将其共有的扩增带（）和各自的扩增带（与）作比较，则可以得出遗传相似指数。而遗传距离（）则为，同时也可得出基因流，基因多样性指数与 信息指数。多态性位点的选择主要参考刘至治的相关方法，引物主要参考黄丽英的随机引物，反应体系则用标准的 总反应体系，程序的选择则在退火温度上设置梯度退火温度，退火温度设置为 ，预备试验后优选退火温度 。表 引物编号及其序列 引物编号 核苷酸序列 引物编号 核苷酸序列 结果与分析 扩增结果该试验用 对随机引物对 只 个地区养殖中华鳖的基因组 进行了 扩增，其中 引物对江津地区养殖中华鳖基因组 扩增电泳图如图 所示。每个引物得到的扩增片段在 个之间，个引物总共检测到 个 扩增片段，多态片段数量为 个，多态位点比例约为。图 引物 对江津地区扩增电泳结果 重庆 个地区养殖中华鳖内部的遗传变异 表 表明，个地区养殖中华鳖的 基因多样性指数数值范围为.；指数数值范围为。可以看出 个地区养殖中华鳖种群内的遗传多样性并不高。表 个地区养殖中华鳖遗传多样性参数 地区遗传距离 指数 基因多样性指数 江津地区 长寿地区 永川地区 潼南地区 重庆 个地区养殖中华鳖不同种群间的遗传变异 个地区中华鳖的种群遗传多样性参数结果表明，重庆养殖中华鳖总基因多样性（）数值为，而各种群内的基因多样性（）数值为，种群内的基因多样性所占总基因多样性的数值（）为。根据种群内的基因占总基因多样性的占比可以看出，个种群的遗传变异主要集中于种群内；根据种群遗传分化系数的数值（）可看出，个种群在不同种群间也产生了一定的遗传分化，而根据种群遗传分化系数的数值得出的基因流（）为，其数值大于，说明种群间存在某些量的基因交流。通过聚类分析的树状图可以看出，江津与潼南地区的养殖中华鳖先聚为一支，而长寿与永川的养殖中华鳖则分别单独聚为一支。从表 中可以看出，江津地区和潼南地区养殖中华鳖种群的遗传相似性指数为，遗传距离为，此结论与聚类树状图结果一致。长寿地区养殖中华鳖与江津地区养殖中华鳖遗传相似度指数最低，仅有；从地区上看，江津地区与其他 个地区的养殖中华鳖遗传相似度均高于，而潼南地区与其他 个地区的养殖中华鳖遗传相 安徽农业科学 年似度均低于。表 重庆 个地区养殖中华鳖的遗传距离与遗传相似度 地区潼南地区 长寿地区 永川地区 江津地区 潼南地区 长寿地区 永川地区 江津地区 图 个地区养殖中华鳖的聚类分析结果 讨论 重庆 个地区养殖群体的遗传多样性 遗传多样性与一个物种对生态环境的适应性、在生态环境中的生存能力与其繁殖后代的存活率等都有密切关系，没有遗传多样性，整个生物界将会失去活力与基础。而多态位点的比例就是衡量遗传多样性的一个重要指标。黄丽英对太湖种群、日本种群、乌鳖种群、台湾种群 个养殖品系进行了 遗传多样性分析，得出 个品系的平均多态位点比例为.，略高于该研究得出的平均多态位点比例（）。就野生水生生物而言，平均多态位点比例为。王广银等报道的关于野生香鱼的平均多态位点比例为.；符书源等报道的野生鞍带石斑鱼的平均多态位点比例为；李明云等报道的花鲈多态位点比例范围为。从以上报道可看出，野生种类遗传多样性都较低，且很大程度上低于该研究的养殖中华鳖群体多态性，也低于黄丽英研究中 种养殖品系的平均多态性，可见人工养殖对多态性有一定程度的影响。在遗传距离上，个地区的遗传距离范围为，与黄丽英得出的遗传距离相似。认为，不同物种间遗传相似度范围应该为；而同种不同群体间遗传相似度范围应该为，与该试验得出的遗传距离结论一致。个地区养殖中华鳖的种群内基因多样性为，占总基因遗传多样性的，说明 个地区种群间也存在一定的遗传分化。而根据聚类分析来看，永川养殖中华鳖群体聚为单独一支，长寿养殖中华鳖群体聚为单独一支，潼南养殖中华鳖群体和江津养殖中华鳖群体聚为一支。总体而言，养殖中华鳖遗传多样性明显低于野生中华鳖，鱼类也相同。在我国，已经建立了一些中华鳖的良种场对其种质资源进行保护，其中在浙江、湖南和广东都设立了国家级中华鳖良种场，但在重庆地区的中华鳖良种场较少，因此重庆应对中华鳖的种质保护进行重视。同时重庆存在一种俗名为紫砂鳖的当地土鳖，但近年来对其研究接近空白，后期可以对其进行相关研究。关于 试验和试验数据的统计 是 世纪基于 分子技术发展而来的一项分子标记技术，其引物不需要单独设计，而是用随机引物进行扩增，因此更加简便高效。但其也存在一定的不稳定性，其反应体系如受到污染则对试验结果会有较大影响，因此离心管、小管、移液枪头等试验器材的灭菌操作非常必要。同时 体系的 模板浓度与引物浓度也会对试验数据有一定的影响。该试验发现，模板浓度过高则容易造成拖带，而引物浓度过低会出现条带看不清甚至没有条带的现象。而退火温度的选择也是影响试验结果的一个非常重要的因素，因此该试验在退火温度上设置了一个梯度，即进行了梯度 扩增试验，退火温度设置为 ，从而寻求该试验的最佳退火温度。在 试验数据的统计上，容易由于试验人员的主观原因影响试验结果，因此需要探寻更好的电泳条带分析方法。也有学者使用其他分子标记方法对中华鳖的遗传多样性进行研究，如王利华等运用 标记法对淮河品系中华鳖的遗传多样性进行了分析，今后可考虑运用其他分子标记法对重庆地区的养殖中华鳖进行遗传多样性研究。参考文献 张孟闻，宗愉，马积藩，等中国动物志：爬行纲 第一卷 总论 龟鳖目 鳄形目北京：科学出版社，：王培潮中国的龟鳖上海：华东师范大学出版社，：，：，（）：，：，（）：郭珂，朱学春，赵丽丽，等 分析江西贡江水系鲤鱼种群遗传多样性南昌大学学报（理科版），（）：石洪玥，刘阳，王晓梅，等七里海中华绒螯蟹遗传多样性的 和 分析水产科学，（）：林基亮，王春德，吕倩，等青岛地区四角蛤蜊（）个自然群体遗传多样性 分析青岛农业大学学报（自然科学版），（）：，刘至治，蔡完其，李思发中华鳖五群体遗传变异的 分析水产学报，（）：，黄丽英中华鳖 个不同种群的遗传结构和分子遗传标记研究重庆：西南大学，（下转第 页）卷 期 刘灏宇等 基于形态学特征和线粒体 序列的横带髭鲷野生与养殖群体比较学方面的比较研究。王世峰等关于评估厦门近海横带髭鲷野生群体的遗传多样性研究表明，该群体具有较高的遗传多样性，但未与养殖群体进行比较。近年来，线粒体 基因因其进化速度适中、变异率相对较高等特点，已被用于多种鱼类的种内群体间的比较研究。该研究横带髭鲷线粒体 片段测序结果显示，野生横带髭鲷的单倍型多样度为（），核苷酸多样度为（），均高于养殖群体。据推测，在人工繁育过程中发生的近亲繁殖、亲本数量减少以及遗传漂变等现象可能是导致该物种养殖群体遗传多样性较低的原因。此外，较高水平的物种多样性有助于提高该物种的环境适应及生存能力。该研究结果也表明，更能适应外界环境变化的野生群体比养殖群体有更高的遗传多样性。养殖群体的遗传多样性低于野生群体的现象在其他鱼类研究中也有所报道。宋娜等通过对香鱼野生与养殖群体进行比较发现，该物种养殖群体单倍型多样度与核苷酸多样度均低于野生群体；赵祥等通过对黄姑鱼 个养殖群体及 个野生群体的线粒体控制区序列进行比较，发现养殖群体单倍型多样度与核苷酸多样度均低于野生群体。从横带髭鲷的群体单倍型分布来看，养殖群体单倍型单一，结合线粒体 遵循母系遗传的特点，推测可能是因该物种人工繁育过程中所用亲鱼数目较少所致。结论横带髭鲷野生群体与养殖群体在形态学上差异不明显。在遗传学方面，与横带髭鲷野生群体相比，养殖群体遗传多样性较低。在今后的横带髭鲷人工繁育工作中，应保证足够多的野生横带髭鲷亲本数量，以确保养殖群体的遗传多样水平维持在一个较高的水平。同时，应保证今后用于增殖放流的苗种群体遗传学监测，以减轻增殖放流对野生横带髭鲷资源的遗传学影响，实现横带髭鲷野外资源的可持续利用。参考文献 许文军，辛剑，张学舒，等横带髭鲷 （）白点虫病的防治研究现代渔业信息，（）：，徐田军，王健鑫，孙悦娜，等基于髭鲷属鱼类 基因全序列探讨髭鲷属在鲈总科的分类地位动物分类学报，（）：史海东，毛国民，王海岳温度和盐度对横带髭鲷胚胎发育的影响上海水产大学学报，（）：姚海富，毛国民，史海东横带髭鲷 （）亲鱼培育、产卵和孵化的初步试验现代渔业信息，（）：平洪领，张涛，史会来，等横带髭鲷早期生长发育特征中国水产科学，（）：喻子牛，孔晓瑜，徐文武，等斜带髭鲷 （）和横带髭鲷（）的核型青岛海洋大学学报，（）：喻子牛，孔晓瑜，谢宗墉山东近海 种经济鱼类的核型研究中国水产科学，（）：卓孝磊，邹记兴我国海水鱼类核型及染色体显带研究进展热带海洋学报，（）：王世锋，杜佳莹，苏永全，等厦门近海横带髭鲷野生群体遗传结构分析厦门大学学报（自然科学版），（）：杨天燕，蒋艳琳，郭易佳，等基于线粒体 基因的龙头鱼及其近缘物种分子系统发育研究海洋湖沼通报，（）：俞正森，宋娜，韩志强，等浙江海域天竺鲷科鱼类新纪录种 黑边银口天竺鲷（）形态特征与 条形码研究海洋与湖沼，（）：，：，徐胜勇，张辉，柳本卓，等中日褐菖鲉群体形态学比较研究水生生物学报，（）：李龙，徐胜勇，张辉，等中日褐菖鲉群体耳石形态学比较分析集美大学学报（自然科学版），（）：杨彦平，许萌原，马凤娇，等基于线粒体 基因的长江刀鲚群体遗传结构分析江西农业学报，（）：，欧阳美，张晓宇，张富铁，等基于线粒体 基因序列的长江中上游草鱼野生和养殖群体遗传多样性比较研究淡水渔业，（）：，（）：，（）：林浩然重要海水养殖鱼类遗传多样性与种质基因组的研究科技导报，（）：宋娜，都基隆，王志勇，等香鱼野生群体和养殖群体遗传多样性比较水产学报，（）：赵祥，郑建，高天翔，等基于线粒体 控制区的黄姑鱼养殖群体与野生群体比较研究中国海洋大学学报（自然科学版），（）：（上接第 页）肖亚梅，陈丽莉，陈合格，等中华鳖种群 分析湖南师范大学自然科学学报，（）：，（）：，（）：，：，：，：庞广昌，姜冬梅群体遗传多样性和数据分析林业科学，（）：王广银，丁文勇，陈少波，等浙闽香鱼 个群体遗传多样性的 分析科技通报，（）：符书源，尹绍武，陈国华，等海南近海野生鞍带石斑鱼群体遗传多样性的 分析海洋通报，（）：李明云，赵明忠，钟爱华，等山东日照和福建厦门沿海花鲈（）遗传多样性的 研究海洋与湖沼，（）：，：王利华，张英萍，邹桂伟，等基于微卫星标记的中华鳖淮河品系遗传多样性分析中国农学通报，（）：卷 期 刘灏宇等 基于形态学特征和线粒体 序列的横带髭鲷野生与养殖群体比较