1、ICS 65.020.30CCS B 441509乌兰察布市地方标准DB 1509/T 00012023奶绵羊冷冻精液生产技术规程Technical regulations for the production of dairy sheep frozen seme2023 - 12 - 08 发布2024 - 01 - 08 实施乌兰察布市市场监督管理局发 布DB 1509/T 00012023前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由乌兰察布市农牧局提提出。本文件由乌兰察布市农牧局提归口。本文件起草单位:乌兰察布市畜牧工作站
2、、内蒙古大学、蒙天然牧业科技发展有限公司、乌兰察布 市市场监督管理局、内蒙古丰东知盈牧业科技有限公司、察右中旗市场监督管理局。本文件主要起草人:张立果、张立、王申元、苏小虎、魏润元、李光鹏、寇慧娟、朱怡静、郑重、 刘建宁、于涛、刘权、苏广华、杨磊、萨仁格勒、杨柳、闫鑫鹏、侯仕农、王景龙、郝佳惠、刘信、贾俊欣、米布农、郑少华、张莉、窦英杰、赵跃芳。IDB 1509/T 00012023奶绵羊冷冻精液生产技术规程1 范围本文件规定了奶绵羊冷冻精液生产的基本要求、精液处理、精液冷冻、标志、包装、运输、贮存。 本文件适用于奶绵羊冷冻精液生产。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成
3、本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定GB/T 5458 液氮生物容器GB 20557 山羊冷冻精液3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。奶绵羊 dairy sheep以产奶为主的绵羊。精子活力 sperm motility在显微镜恒温载物台38 环境下直线前进运动精子占总精子数的百分率。精子畸形率 abnormal sperm percentage畸形精子占总精子数的百分率。细菌数 bacteria count每剂量
4、精液经培养后观察到的细菌菌落数。顶体完整性 acrosome integrity顶体完整的精子占总精子数的百分率。质膜完整性 plasma membrane integrity质膜完整的精子占总精子数的百分率。冷冻精液 frozen semen经特殊方法处理超低温冷冻后在液氮中(-196 )保存的精液。1DB 1509/T 000120234 精液采集 种公羊选择具有种用价值、系谱完整、体质健康、无遗传病,不应有已发布的动物防疫法中所明确的二级疫病 中的任何一种疾病。 采集精液4.2.1 台羊选择性格温顺、四肢健康的发情母羊作为台羊,将台羊后驱清理干净。4.2.2 种公羊处理采精前剪短包皮周围
5、长毛,清洗消毒包皮。4.2.3 采精器假阴道、集精杯提前灭菌消毒。安装采精器,保证采精器结实不漏水。采精时在采精器分层中注入 适量40 45 的水。吹气使其外口呈三角形,假阴道上端均匀涂抹凡士林。4.2.4 精液采集采精时,工作人员半蹲于台羊的左侧后方,右手握住假阴道,并与地面成约45。当公羊稳定爬胯 时,利用假阴道迅速采集精液并将其置于38 水浴锅中,记录采精量。 新鲜精液评估采集精液符合以下评估标准方可进行稀释、冷冻:a) 色泽呈乳白色或浅黄色,肉眼可见云雾状运动;b) 精子活力65%;c) 精子密度2109 个/mL;d) 精子畸形率15%。5 稀释液配制 仪器烧杯、量筒、磁力搅拌器、天
6、平。 化学试剂所有化学试剂(化学纯以上): Tris、柠檬酸、果糖、 M199、大豆卵磷脂、青霉素、链霉素、甘油、超纯水。 稀释液配方A液:Tris 2.71 g、柠檬酸1.4g、果糖1g、 M199 2 mL、大豆卵磷脂1 g、青霉素10000 IU、链霉素10 g,加超纯水至100 mL。B液:取A液90 mL,甘油10 mL。2DB 1509/T 000120236 精液稀释 稀释密度稀释密度大于等于1.2108个/mL。 精液稀释6.2.1 将稀释液在 38 水浴锅中预热 30 min,通过测定鲜精密度和采精量,计算出稀释后总体积;6.2.2 选用合适容积的器皿用 A 液先对其进行 1
7、:1(鲜精:A 液)稀释;静置 10 min 后 1:4 稀释(鲜精:A 液); 静置 10 min 后 1:8(鲜精:A 液)稀释,静置 10 min;6.2.3 加 A 液至总体积的一半;6.2.4 将稀释后的精液封口并放于含有 38 水的烧杯中,6.2.5 将其放置 4 冰箱中平衡 2 h 后加稀释液 B 液至总体积,置于 4 冰箱中平衡 1 h。 细管精液的分装、标识用无菌0.25 mL细管分装,两端封口应严密,管内无气泡。细管横向标识顺序从左到右依次为:羊号、生产日期。7 精液冷冻 冷冻设备制作冻精的设备为适用0.25 mL细管的程控冷冻仪。 冷冻程序及操作步骤7.2.1 按照程控冷
8、冻仪的操作步骤对精液进行冷冻。冷冻程序为:4 -10 (降温速率 5 /min);-10 -100 (降温速率 60/min);-100 -140 (降温速率 20 /min)。7.2.2 精液冷冻前 30 min,将液氮阀和排气阀打开以平衡液氮罐和冷冻箱内的压力,待冷冻箱内温度降至 4 时,维持 30 s;7.2.3 打开冷冻箱盖,将放有细管精液的托架放入冷冻箱内,关闭冷冻箱盖进行精液冷冻;7.2.4 当温度下降至-140 时冷冻结束,保持 30 s 后取出分装。 冻精包装和贮存细管置入液氮并分装冻存,同时留样检测冻精质量。细管冻精用专用的塑料管包装,每管25支,再将塑料管装入纱布袋,纱布袋
9、系紧口,确保细管不掉。 贮存冻精的低温容器应符合GB/T 5458的要求;及时补充液氮,每年补充液氮;取放冻精时,冻精离开液氮不应超过10 s。8 精液解冻水浴锅38 40 预热30 min以上,待水浴锅温度稳定后,迅速从贮存罐中取出预留冻精,在空气中放置15 s20 s,然后放入3840水浴锅中15 s20 s并轻轻摇晃;取出细管用无菌吸水纸擦拭干净。3DB 1509/T 000120239 冻精质量检测 细管外观细管无裂痕,两端封口严密,标识清晰。 冻精解冻后的要求9.2.1 活力35%,应符合 GB 20557 的要求。9.2.2 精子畸形率25%,应符合 GB 20557 的要求。9.
10、2.3 细菌数800 个/0.25 mL,检测方法见 GB 4789.29.2.4 顶体完整性45%,检测方法见附录 A。9.2.5 质膜完整性35%,检测方法见附录 B。4DB 1509/T 00012023附 录A(资料性)奶绵羊冷冻精液精子顶体完整性检测方法A.1 器材、试剂荧光显微镜、烘片机、多聚赖氨酸粘附性的载玻片、PBS、4%多聚甲醛、FITC-PSA、DAPI、甘油。A.2 操作步骤A.2.1 冻精准备解冻3管冷精于1.5 mL离心管中,加入1 mL洗精液并混匀;1500 rpm离心5 min,弃上清,留约20 L。A.2.2 固定加入适量的PBS重悬精子沉淀,并向其中加入4%多
11、聚甲醛对精子进行固定,固定约30 min。A.2.3 洗涤向精液中加入PBS 1 mL,1500 rpm离心5 min洗涤2次以除去精浆,多聚甲醛等,洗涤后加入1 mL PBS 重悬精子沉淀。A.2.4 涂片染色取10L精液均匀涂于多聚赖氨酸粘附性的载玻片上,并将其放于烘片机上干燥;加10L FITC-PSA 对精子进行避光染色15 min;用超纯水缓慢洗涤玻片并干燥;加5L DAPI染色液避光染色5 min。A.2.5 洗涤干燥用超纯水缓慢洗涤玻片,放烘片机上干燥,并用PBS与甘油的混合物封片。A.2.6 镜检荧光显微镜下观察,共计数至少200个精子来统计冻后精子顶体完整性,若精子头部均染成
12、明亮的绿色荧光且均匀即顶体完整(AI);已发生顶体反应(AR)的精子仅在赤道带出现荧光染色,或者头部 无绿色荧光。A.2.7 计算所检冻精的顶体完整率按照公式A.1计算:C=C1/S100%(A.1)式中:C顶体完整率,%;C1顶体完整,单位为个; S总精子数,单位为个。5DB 1509/T 00012023附 录B(资料性)奶绵羊冷冻精液质膜完整性检测方法B.1 器材、试剂荧光显微镜、恒温水浴锅、洗精液、低渗溶液、PBS。B.2 操作步骤B.2.1 冻精准备B.2.2 低渗溶液处理吸取200L精液加到1 mL低渗溶液中。放入恒温水浴锅里38 ,30 min。B.2.3 封片取10L精液滴到载玻片上并盖上盖玻片。B.2.4 镜检自然干燥后在显微镜下观察,每个视野观察200个以上的精子。B.2.5 计算质膜完整率按照公式B.1计算:D=D1/S100(B.1)式中:D质膜完整率,%;D1质膜完整精子,单位为个;S精子总数,单位为个。6