基于ZrO_%282%29_AuNPs膜修饰电极的适配体传感器用于凝血酶的检测研究.pdf

收稿日期:2 0 2 2-0 6-1 5 修回日期:2 0 2 2-0 6-2 9基金项目:国家自然科学基金(N o.2 1 2 7 5 0 5 1,2 1 4 7 5 0 4 3);湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室开放基金课题(K L C B T CMR 2 0 1 5-0 4,K L C B T CMR 1 8-0 9)*通讯作者:龙倩,女,硕士,工程师,主要研究方向:光谱电化学及生物传感.E-m a i l:5 9 4 6 5 9 3 6 6q q.c o m第3 9卷第3期V o l.3 9 N o.3分 析 科 学 学 报J OUR NA LO FANA L Y T I C A LS C I E N C E2 0 2 3年6月J u n e 2 0 2 3D O I:1 0.1 3 5 2 6/j.i s s n.1 0 0 6-6 1 4 4.2 0 2 3.0 3.0 1 2基于Z r O2/A u N P s膜修饰电极的适配体传感器用于凝血酶的检测研究文艳清1,龙 倩*1,张友玉2,李海涛2(1湖南安全技术职业学院,湖南长沙4 1 0 1 5 1;2.湖南师范大学化学化工学院,湖南长沙4 1 0 1 8 1)摘 要:提出了一种简单、无标记、可再生的电化学方法研究适配体和凝血酶之间的相互作用,采用亚甲基蓝(MB)做电化学指示剂,氧化锆(Z r O2)-金纳米粒子(A u N P s)涂层修饰玻碳电极(G C E)。利用金-硫键及杂交化学反应,捕获探针和适配体依次修饰到电极表面,亚甲基蓝插入到D NA上,形成适配体传感器。电极表面的D NA双链在凝血酶的存在下发生解旋,MB在D NA上的吸附量随之减少,峰电流也显著降低,达到检测凝血酶的目的。实验显示,凝血酶在2 0p m o l/L1 5 0n m o l/L的浓度范围内,峰电流的减小量随凝血酶浓度的升高而增大,检出限为2 0.6f m o l/L。该方法简单、灵敏、选择性好,并成功用于实际样品检测。关键词:氧化锆;金纳米粒子;适配体;凝血酶;亚甲基蓝;电化学适配体传感器中图分类号:O 6 5 7.1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-6 1 4 4(2 0 2 3)0 3-3 3 1-0 6凝血酶是一种在凝血过程中非常重要的蛋白酶,有加速并巩固凝血的作用,能抑制血栓,活化血小板,对许多心血管疾病的诊断有重要作用,还能调控多种炎症,利于伤口愈合。因此,发展简单、高灵敏的凝血酶定量检测方法在医学上具有十分重要的意义。适配体是通过S E L E X技术从体外筛选合成的寡核苷酸链1。与传统抗体相比,适配体在生化分析中的分子识别方面具有检测目标的多样性、亲和性高、易于合成、便于标记以及稳定性高等优点,基于此,适配体传感器有了很大的发展,可用来识别和检测各种靶物质,如药物,蛋白质和其它一些小分子2-4。凝血酶适配体最先从体外筛选出来,研究表明它能形成一种G-四重体空间结构,在特定位点与凝血酶特异性结合5。目前,各种技术也广泛地应用于凝血酶的检测,例如比色法2,光谱化学技术3,6,表面等离子体共振(S P R)7,石英微天平8以及电化学9,1 0。相较其它方法,电化学方法简单,灵敏,响应快,处理方便,成本低,在凝血酶检测方面有明显的优势1 1,1 2。氧化锆是一种无机氧化物,化学性质稳定,热稳定性高,生物相容性好,易与含氧基团结合。有文献报道,A u N P s与Z r O2纳米粒子的协同作用能有效的提高D NA杂交的检测灵敏度1 3。亚甲基蓝(MB)是一种吩噻嗪类芳香族阳离子染色剂,具有光学和电化学活性,本文以MB作为电化学指示剂,设计了一种无标记电化学凝血酶适配体传感器。研究发现,凝血酶与适配体结合形成G-四重体结构,使传感界面发生变化,峰电流下降,从而可快速定量检测凝血酶,方法对凝血酶检测灵敏,选择性高,且操作简单。1 实验部分1.1 仪器和试剂差分脉冲伏安(D P V)检测在CH I 6 6 0 C电化学工作站(CH I I n s t r u m e n t I n c.,美国)上进行。以玻碳133第3期文艳清等:基于Z r O2/A u N P s膜修饰电极的适配体传感器用于凝血酶的检测研究第3 9卷电极(G C E)为工作电极,A g/A g C l电极为参比电极,碳电极为辅助电极。本研究中的寡核苷酸链参照文献设计7,购自上海生物工程技术与服务有限公司,序列如下:适配体(5 -AG TC C GT G GT AGG G CAG GT T GG G GT GAC T-3);巯基-D NA链(5 -S H-C6-T T TT T TT C AC C CC AAC C T-3),下划线部分是互补序列。D NA储备液(1 0 0m o l/L)用2 0mm o l/Lp H=7.4的磷酸盐缓冲溶液(P B S)配制并冷冻保存。亚甲基蓝和Z r O C l28 H2O购自天津科密尔试剂公司;氯金酸购于S i g m a公司(美国);?-凝血酶、牛血清白蛋白(B S A)、人血清白蛋白(H S A)及纤维蛋白原(F i b r i n o g e n)均购自S i g m a-A l d r i c h公司,蛋白质溶解在2 0mm o l/LP B S缓冲溶液中。其他试剂均为分析纯,所有试剂均使用超纯水配制。1.2 适配体传感器的构建玻碳电极(G C E)分别用0.3和0.0 5m-A l2O3粉抛光,冲洗后再分别用无水乙醇和蒸馏水超声清洗5m i n。G C E置于5.0mm o l/LZ r O C l2和0.1m o l/LK C l的混合溶液中,在-1.1和+0.7V(v s.A g/A g C l)的电位之间以2 0mV/s的扫描速度进行循环伏安连续扫描1 0圈,氧化锆(Z r O2)薄层沉积在电极上得Z r O2/G C E。然后将电极浸没在纳米金溶胶(根据文献制备1 4)中,在1.5V电沉积7 0 0s,金纳米粒子沉积到Z r O2/G C E电极上,用超纯水冲洗,氮气吹干备用。将上述修饰电极浸泡到含1 0m o l/L的捕获探针溶液中过夜(4)。冲洗电极后,用1mm o l/L的巯基乙醇封闭电极1h,然后将5L1 0m o l/L的凝血酶适配体滴加到修饰电极上,在3 5与捕获探针反应2h,彻底冲洗后即得到适配体修饰电极(d s D NA/A u/Z r O2/G C E),再将电极浸泡到包含2 0m o l/LMB和2 0mm o l/LK C l的1 0mm o l/LP B S中,室温下搅拌1 0m i n,通过特异性吸附,MB被修饰到电极表面,得到适配体传感器。1.3 电化学检测凝血酶用不同浓度的凝血酶溶液分别浸泡“1.2”制备的适配体传感器1h,凝血酶和适配体形成G-四重体稳定结构,D NA双链解旋,MB从电极上脱落。在P B S中,采用差分脉冲伏安法(D P V)扫描,检测峰电流。D P V参数:振幅5 0mV,脉冲宽度6 0m s,脉冲周期0.2s,扫描范围0-0.5V。采用循环伏安法(C V)和交流阻抗谱(E I S)对电极进行表征,在1mm o l/L含0.1m o l/LK C l支持电解液的F e(C N)63-/4-溶液中进行。C V的扫描速率是1 0 0mV/s。E I S电压振幅是5mV,电压频率是从10 0 0到0.0 1H z,初始电位是0.1 7 2V。2 结果和讨论2.1 传感器的构成和实验原理实验以MB为电化学指示剂,设计了一种无标记的电化学凝血酶适配体传感器。实验原理如图1。图1 适配体传感器形成及凝血酶检测示意图F i g.1 S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f t h ea p t a s e n s o r f o r m a t i o na n dt h r o m b i nd e t e c t i o n233第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷首先,使用电沉积法将Z r O2和A u N P s依次修饰到电极表面。然后,捕获探针和适配体通过杂交反应形成半双链D NA,修饰到电极表面,接着,MB插入到双链D NA中,或与单链D NA上的鸟嘌呤结合,因此,双链的长度和自由碱基鸟嘌呤的数量决定了修饰电极上MB的吸附量。本工作中,适配体只有1 2个碱基与捕获探针杂交,自由碱基中含有较多的鸟嘌呤,能大量吸附MB,得到较大的峰电流。当传感器浸入到凝血酶溶液中时,双链解旋,适配体与凝血酶形成稳定的G-四重体稳定结构,与MB一起从电极表面脱落,峰电流下降,下降程度与凝血酶浓度呈一定关系,达到定量分析的目的。2.2 修饰电极的电化学表征使用循环伏安法和交流阻抗法对传感器进行表征,结果如图2所示。图2 A为传感器的循环伏安图。曲线a表明,F e(C N)63-/4-电对在裸玻碳电极上有较大的氧化还原峰电流;当电极依次沉积了Z r O2和A u N P s后,峰电流先减小再增大(曲线b和c),这是因为电极表面的电活性位点被Z r O2占据1 5,影响F e(C N)63-/4-电对向电极表面扩散,而继续沉积A u N P s后,修饰电极的比表面积增加,电活性面积也增大。随后,带负电的捕获探针D NA与 F e(C N)63-/4-之间产生静电排斥1 6,使峰电流急剧下降(曲线d);杂交反应后,峰电流继续降低(曲线e),这是因为双链D NA刚性结构的影响以及继续引入负电荷的结果。以上结果表明,电极修饰成功。交流阻抗谱图(E I S)一般包括一个半圆部分和直线部分,半圆表示高频范围内的电子传递过程,其直径表示电子传递阻抗(Re t),直径越大,Re t越大,直线表示低频范围内电解质扩散过程1 7。图2 B显示了不同电极在F e(C N)63-/4-溶液中的E I S图,曲线a为裸玻碳电极(Re t=2.8 21 03),曲线b是Z r O2修饰的玻碳电极(Re t=3.4 71 03),与a相比,曲线b阻抗增大了,原因是修饰在电极表面的Z r O2显示出弱的导电性;继续沉积A u N P s后,高导电性的纳米金可以促进电子传递,E I S图的半圆直径很小(Re t=1.6 8 1 03,曲线c);修饰捕获探针及适配体后,Re t值逐渐增大,由9.3 4 1 03(曲线d)到1 9.8 91 03(曲线e),这些结果与循环伏安法的表征结论一致。图2 不同电极的循环伏安图(A)和交流阻抗图(B):b a r eG C E(a),Z r O2/G C E(b),A u/Z r O2/G C E(c),s s D N A/A u/Z r O2/G C E(d),d s D N A/A u/Z r O2/G C E(e).F i g.2 C y c l i c v o l t a mm o g r a m s(A)a n dN y q u i s t p l o t s(B)o f d i f f e r e n t e l e c t r o d e s.b a r eG C E(a),Z r O2/G C E(b),A u/Z r O2/G C E(c),s s D N A/A u/Z r O2/G C E(d),d s D N A/A u/Z r O2/G C E(e).2.3 实验条件的优化实验分别考察了不同p H值(4.5、5.5、6.5、7.4、8.5)、反应温度(4、1 0、2 0、3 7)和反应时间(0、5、1 5、3 0、4 5、6 0m i n)对检测结果的影响。图3 A表明了p H值对检测结果的影响,p H值为7.4时,峰电流变化最大,而高于或低于此值则变化较小,但影响并不大。因此,最佳p H值为7.4。图3 B显示了反应温度对检测结果的影响,反应温度为4时峰电流的降低幅度(ip)最大,表明凝血酶-适配体在低温下更容易结合形成G-四重体,与文献报道3,7的结果一致。因此,实验选择4作为孵化温度。图3 C表明了反应时间对检测结果的影响,在03 0m i n内,峰电流的变化值(ip)随着时间的增加而增大,3 0m i n后趋于平缓,4 5m i n内,凝血酶与其适配体几乎全部反应。因此,选择4 5m i n作为最佳反应时间。2.4 凝血酶的检测传感器表面的适配体遇到凝血酶时,双链D N A解旋,吸附在D N A上的M B从电极脱落,峰电流下降,下降幅度(ip)与凝血酶浓度呈一定的函数关系,如图4 A所示。结果发现,凝血酶浓度在2 0p m o l/L到333第3期文艳清等:基于Z r O2/A u N P s膜修饰电极的适配体传感器用于凝血酶的检测研究第3 9卷图3 不同p H值(A)、温度(B)和反应时间(C)对峰电流的影响F i g.3 I n f l u e n c eo fb u f f e rp H(A),t e m p e p a t r u e(B)a n di n c u b a t i o nt i m eo nt h es t r i p p i n gp e a kc u r r e n t(5 0n m o l/Lt h r o m b i ni n1 0mm o l/LP B S)1 5 0n m o l/L范围内,ip与其对数值成线性关系(图4(B),线性方程为:ip(A)=3.7 1 2 7+0.7 9 7 8l o gct h r o m b i n(p m o l/L),相关系数为0.9 9 1 3,检出限(S/N=3)为2 0.6f m o l/L,与其他文献报道1 8,1 9相比,本方法线性范围更宽,检出限更低。为了证实Z r O2的协同作用,将玻碳电极表面沉积和不沉积Z r O2作对照实验,图4 B中a、b,分别表示电极表面存在、不存在Z r O2时传感器检测凝血酶的校准曲线。结果可见,该方法用于凝血酶的检测时,基于Z r O2/A u膜修饰电极能固定更多单链D NA探针,具有更宽的线性范围和更低的检出限。表1对不同方法检测凝血酶的性能进行了比较。图4 不同浓度凝血酶的D P V图(A)与不同修饰电极检测凝血酶的校正曲线(B)F i g.4 D P Vr e s p o n s eo f a p t a m e r-b a s e de l e c t r o c h e m i c a l a s s a yw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h r o m b i n(A)a n dc a l i b r a-t i o nc u r v e f o r t h ed e t e c t i o no f t h r o m b i n(B)A(1-1 2):0,0.0 2,0.0 5,0.1,0.5,1.0,5.0,1 0.0,2 0.0,5 0.0,1 0 0.0,1 5 0.0n m o l/L;B:a.c a p t u r ep r o b ew a s i mm o b i l i z e do nt h eA u/Z r O2/G C E;b.c a p t u r ep r o b ew a s i mm o b i l i z e do nt h eA u/G C E.表1 不同方法检测凝血酶性能比较T a b l e1 C o m p a r i s o no f t h r o m i np r o p e r t i e sb yd i f f r e n tm e t h o d sP r o p e r t yT h i sm e t h o dA u/Z r O2/G C EA u/G C ER e f.1 8R e f.1 9L i n e a r r a n g e0.0 2-1 5 0n m o l/L0.2-2 0n m o l/L1 0 0-20 0 0n m o l/L0.5 5-3 3n m o l/LL i m i to fd e t e c t e d2 0.6f m o l/L4 7.4f m o l/L1 0 0n m o l/L0.1 1n m o l/L2.5 特异性研究图5为适配体传感器的特异性检测结果。在相同实验条件下,以蛋白质B S A、H S A及纤维蛋白原(浓度均为0.1m o l/L)为干扰对象,考察不同蛋白质与该传感界面适配体作用后的电流响应。结果显示,凝血酶(图5 E)存在时会产生明显的峰电流变化,其他蛋白质和空白溶液仅引起很小的峰电流变化(如图5,A,B,C,D),即使是0.1m o l/LH S A共存时也几乎不受干扰(图5 F),说明此传感器具有较高的特异性。2.6 传感器的再生能力及稳定性适配体链可通过D NA杂交反应重新固定到电极表面,吸附MB后即可再生,其再生能力如图6所示,结果表明,重复使用7次后,传感器依然表现出较强的电化学响应。433第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷图5 特异性实验F i g.5 S p e c i f i c i t yo ft h ea p t a s e n s o r(A)b u f f e r,(B)0.1 m o l/Lo fB S A,(C)0.1 m o l/Lo fH S A,(D)0.1 m o l/Lo fF i b r i n o g e n,(E)5 0n m o l/Lo f t h r o m b i n,(F)5 0n m o l/Lo ft h r o m b i nw h e n0.1 m o l/Lo fH S Aw a s c o e x i s t e d.图6 传感器的再生能力F i g.6 T h e r e g e n e r a t i v ec a p a b i l i t yo f t h e s e n s o r 传感器的稳定性对于实际检测十分重要。本研究中,传感器在4下储存一周后依然有很好的电流响应,表明该适配体传感器稳定性良好。2.7 实际样品分析为了验证本方法的实用性,将健康人血清样品稀释10 0 0倍,分别添加不同浓度的凝血酶进行了加标回收实验。如表2所示。人血清中凝血酶的平均回收率在9 3.3%1 0 5.8%之间,相对标准偏差小于4.8%,说明本方法能很好的应用于血样中凝血酶的检测。表2 全血中凝血酶的分析结果T a b l e2 A s s a yr e s u l t so f t h r o m b i ni nw h o l eb l o o dS a m p l eT h r o m b i nD e t e r m i n e d(n m o l/L)A d d e d(n m o l/L)R e c o v e r y(%)R S D(%,n=3)10.2 80.39 3.33.223.1 23.01 0 4.04.133 1.7 53 0.01 0 5.84.83 结论本研究基于Z r O2/A u N P s膜修饰电极,以亚甲基蓝为指示剂,建立了一种简单,无标记及可再生的适配体传感器用来检测凝血酶。凝血酶与其适配体特异性结合,导致适配体及MB从修饰电极表面脱落,造成峰电流显著下降,实现凝血酶的定量检测。Z r O2/A u N P s膜对电极的修饰,其协同作用显著增大线性范围至2 0p m o l/L1 5 0n m o l/L,检出限达2 0.6f m o l/L。该传感器操作简单,灵敏度高,再生能力强,在凝血酶实际样品的检测中有良好的应用前景。参考文献:1 Q i uHJ,S u nYL,H u a n gXR,Q uYB.C o l l i dS u r f a c eB,2 0 1 0,7 9(1):3 0 4.2 T a n gXD,Y i nZZ,L e iXL,Z e n gYB,Z h a n gZL,L uYX,Z h o uGB,L iL,WuXH.N a n o m a t e r i a l s,2 0 1 9,9(3):3 3 2.3 Z h a n gFY,L i uLY,N i SN,D e n gJK,L i uGJ,R y a nM,D a v i dWL,W a n gS,L i uGZ.N a n o m a t e r i a l s,2 0 1 9,9(1):1 0 4.4 T I ANYZ,Z HANGXL,TANK,L IXC.J o u r n a lo fA n a l y t i c a lS c i e n c e(田耀宗,张校亮,谭慷,李晓春.分析科学学报),2 0 2 1,3 7(1):2 9.5 X u,JP,W e i z m a n nY,K r i k h e l yN,B a r o nR,W i l l n e r I.S m a l l,2 0 0 6,2(1 0):1 1 7 8.6 Z HOUB,CHE NY,HUXJ.J o u r n a l o fA n a l y t i c a lS c i e n c e(周斌,陈尧,胡晞江.分析科学学报),2 0 2 2,3 8(2):2 1 9.7 S e d aK,S e m r aA,H a n d a nY,A r z u mE,A d i lD.T a l a n t a,2 0 1 9,1 9 4(1):5 2 8.8 G u l a yB,C e n g i zO,M e r v eO,U l k uG,B e k i rS,A r i c aM Y.T a l a n t a,2 0 1 9,1 9 1(1):5 9.9 Z HUAN GYJ,WUXQ,WANGYR,WE N M,L UOGL,S UN W,N I UYY.J o u r n a l o fA n a l y t i c a l S c i e n c e(庄玉娇,巫仙群,王宇蕊,文勉,罗贵铃,孙伟,牛燕燕.分析科学学报),2 0 2 0,3 6(1):1 1 6.1 0E n s a f iAA,A k b a r i a nF,E y d a r i SE,R e z a e iB.B i o s e n s o r sa n dB i o e l e c t r o n i c s,2 0 1 8,1 2 2(3 0):2 5.533第3期文艳清等:基于Z r O2/A u N P s膜修饰电极的适配体传感器用于凝血酶的检测研究第3 9卷1 1W a n gL,M e n gTJ,Y uGS,W uSS,S u nJJ,J i aH X,W a n gH,Y a n gXJ,Z h a n gYF.B i o s e n s o r sa n dB i o e l e c t r o n i c s,2 0 1 9,1 2 4-1 2 5(1 5):5 3.1 2R e e mK,S o n d e sBA,T a u q i rAS,G a e l l eC,A k h t a rH,J e a n L o u i sM.M o l e c u l e s,2 0 1 9,2 4(6):1 0 1 7.1 3R o h sR,S k l e n a rH,L a v e r yR,R o d e rB.J o u r n a l o f t h eAm e r i c a nC h e m i c a lS o c i e t y,2 0 0 0,1 2 2(1 1):2 8 6 0.1 4Z h a n gW,Y a n gT,J i a n gC,J i a oK.A p p l i e dS u r f a c eS c i e n c e,2 0 0 8,2 5 4(1 5):4 7 5 0.1 5W a n gH,W a n gJ,C h o iD,T a n gZW,WuH,L i nY H.B i o s e n s o r sa n dB i o e l e c t r o n i c s,2 0 0 9,2 4(8):2 3 7 7.1 6G r a b a rKC,F r e e m a nRG,H o mm e rMB,N a t a nMJ.A n a l y t i c a lC h e m i s t r y1 9 9 5,6 7(4):7 3 5.1 7H a nT,L iX,L iY.S e n s o r sa n dA c t u a t o r sB:C h e m i c a l,2 0 1 4,2 0 5(1 2):1 7 6.1 8D E NGY,Y IRF,Z HOUXD,HUJM.J o u r n a l o fA n a l y t i c a l S c i e n c e(邓媛,易润芳,周晓东,胡继明.分析科学学报),2 0 1 8,3 4(5):5 7 7.1 9T ANJW,Z HOUL,Z HANGYJ,S HANXQ,Z HOU M M,MAY.C h i n e s e J o u r n a l o fA n a l y s i sL a b o r a t o r y(谭靖威,周璐,张亚杰,单晓庆,周美美,马勇.分析试验室),2 0 2 0,3 9(1):2 3.S e n s i t i v eE l e c t r o c h e m i c a lA p t a s e n s o r f o rt h eD e t e c t i o no fT h r o m b i nb a s e do nZ i r c o n i a/N a n o g o l dF i l m M o d i f i e dE l e c t r o d eWE NY a n q i n g1,L ON GQ i a n*1,Z HAN GY o u y u2,L IH a i t a o2(1.S u p p o r t C e n t e rf o rS a f e t yT e c h n o l o g y,H u n a nV o c a t i o n a l I n s t i t u t eo fS a f e t yT e c h n o l o g y,C h a n g s h a4 1 0 1 5 12.C o l l e g e o fC h e m i s t r ya n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,H u n a nN o r m a lU n i v e r s i t y,C h a n g s h a4 1 0 0 8 1)A b s t r a c t:I nt h i sp a p e r,as i m p l e,l a b e l-f r e ea n dr e g e n e r a t i v ee l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d w a sp r o p o s e dt os t u d yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e na p t a m e r a n d t h r o m b i nb yu s i n gm e t h y l e n eb l u e(MB)a s a ne l e c t r o c h e m i c a li n d i c a t o rb a s e do nz i r c o n i a(Z r O2)a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s(NG)f i l m m o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e(G C E).At h i o l a t e dc a p t u r ep r o b ew a sf i r s t l ya t t a c h e do n t ot h eNG/Z r O2/G C Eb yg o l d-s u l f u ra f f i n i t y.A p t a m e rp r o b ew h i c hw a su s e d t op a r t l yh y b r i d i z i ew i t hc a p t u r eD NAs e q u e n c e a n ds p e c i f i c a l l y r e c o g n i z et h r o m b i n,w a st h e ni mm o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c eb yh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n.T h ei n t e r a c t i o no ft h r o m b i nw i t ht h ea p t a m e rd i s p l a c e s t h ea p t a m e r s e q u e n c ea n dc a u s e s i t t od i s s o c i a t e f r o mt h e i n t e r f a c e.T h i s r e s u l t s i nad e c r e a s e i nt h ea m o u n to fa p t a m e r/c a p t u r ep r o b ed u p l e xf o r m.A c c o r d i n g l y,m e t h y l e n eb l u e,a ne l e c t r o a c t i v e i n d i c a t o rb o u n d t o t h ed u p l e x,i sd e s o r p e d f r o mt h e e l e c t r o d e s u r f a c e,w h i c h i n d u c e st h ep e a kc u r r e n to f MB d e c r e a s e do b v i o u s l y.T h ep e a kc u r r e n to f MBl i n e a r l yd e c r e a s e s w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f t h r o m b i no v e rar a n g eo f 2 0p m o l/Lt o1 5 0n m o l/Lw i t had e t e c t i o n l i m i to f 2 0.6f m o l/L.T h u s,t h e f a b r i c a t e ds e n s o r i s s h o w n t oe x h i b i th i g hs e n s i t i v i t y.K e y w o r d s:Z i r c o n i a;G o l dn a n o p a r t i c l e s;A p t a m e r s;T h r o m b i n;M e t h y l e n eb l u e;E l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r633