果胶@壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能.pdf

果胶(Pec)是由一串具有羧基残基的-1-4-半乳糖醛酸序列组成的一种长链线型聚合物1,2，其中一些羧基以甲酯化形式存在，来源不同的果胶的准确化学结构也不一样。壳聚糖(CS)由-(1，4)糖苷键连接的2-乙酰氨基-2脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2脱氧-D-吡喃葡萄糖单元组成3，是甲壳素脱去乙酰基后的产物，也是自然界中唯一富含氨基的碱性多糖共聚物。奥沙拉嗪在结肠菌群分泌的偶氮还原酶作用下可分解为2份五氨基水杨酸，药效比常规的美沙拉嗪、柳氮磺吡啶更好4。果胶可以与多价阳离子5或相反电荷的聚电解质6凝聚交联生成三维网络聚合物凝胶。壳聚糖与京尼平、戊二醛等可交联形成共价键凝胶7，也可与无机离子(如聚磷酸盐、硫酸盐)通过静电作用形成凝胶8。果胶和壳聚糖均是安全无毒、生物相容性高和生物降解性良好的天然多糖材料9,10，它们在持续变化的消化道中保持稳定，仅在结肠菌群产生的特定多糖酶作用下降解11,12，减少了在上消化道的损耗，最小化全身不良反应，被认为是结肠药物递送系统的绝佳选择。本文以奥沙拉嗪为模型药物，选用果胶和壳聚糖2种天然多糖为原料，制备了果胶壳聚糖复合凝胶微球为载体材料，通过单因素变量法优化了制备工艺，考察了微球的形貌、核壳结构、粒径分布及Zeta电位，并评价了该材料的体外释药性能，以延长奥沙拉嗪的局部滞留时间。现阶段的果胶-壳聚糖复合微球的制备多采用两者直接混合得到，并添加戊二醛作为交联剂，但这类微球并非多层包覆，无法达到对药物的高度包封，同时，醛类交联剂会对人体呼吸道、皮肤黏膜等造成巨大刺激，不适合作为药物递送系统的组成部分。相较于单一材料形成的大尺寸载药微球13或者多种材料简单混合制备的药物载体14，本论文制备的10 m左右的核壳结构载药微球，尺寸巧妙，恰好利于材料黏附在肠道内部褶皱处，不易被蠕动排出，且双层包封结构实现了真正意义上的层层包封，既弥补http:/果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能李佳颖1,孙琪琪2，樊 曦2，蔡文睿1，潘 杨2，王增增1,何 斌2,李 赛1(1.四川大学 化学工程学院,四川 成都 610065;2.国家生物医学材料工程技术研究中心,四川大学生物医学工程学院,四川 成都 610064)摘要：文中以天然多糖果胶和壳聚糖为原料，采用乳化交联的方法制备了果胶酸锌微球，再通过自组装壳聚糖层并用柠檬酸钠固化，得到了核壳结构的凝胶微球，将药物奥沙拉嗪封装在凝胶微球中，考察了其药物缓释性能。通过红外光谱、扫描电镜、能谱分析和荧光显微镜对微球形貌和核壳结构进行了表征。通过单因素变量法对凝胶微球的制备进行了优化，并对微球的药物负载性能及在模拟结肠环境中的释药行为进行了研究。结果表明，果胶壳聚糖载药微球的最高载药量和包封率分别为 29.4%和37.3%，果胶壳聚糖复合载药微球在pH=7.4的模拟结肠液中，前12 h内的释放量仅为35.29%，72 h后奥沙拉嗪的释放量达到了89.90%，而纯果胶载药微球前12 h的释放量就已经高达78.65%，体现了壳聚糖包封层在药物缓释中的重要性。锌离子在果胶壳聚糖复合微球和果胶微球中的释放趋势与奥沙拉嗪一致，相比于果胶微球，果胶壳聚糖复合微球具备良好的缓释性能，可用于治疗结肠炎症疾病。关键词：果胶；壳聚糖；凝胶微球；核壳结构；药物缓释中图分类号：TQ427.2+6文献标识码：A文章编号：1000-7555（2023）06-0042-12高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期了简单微球快速释放药物的问题，又提高了药物的生物利用率。另外，本文选择锌离子为交联剂，随着多糖微球溶胀，锌离子也会随着奥沙拉嗪缓慢释放，其消炎杀菌的功效可辅助奥沙拉嗪治疗炎症性肠病，提高疗效。1实验部分1.1试剂及仪器果胶（Pec）：半乳糖醛酸含量74.0%，阿拉丁试剂（上海）有限公司；壳聚糖（CS）：脱乙酰度95%，黏度为100200 mPas，上海麦克林生化科技股份有限公司；奥沙拉嗪钠（Olsalazine）和柠檬酸钠：阿拉丁试剂（上海）有限公司；液体石蜡、吐温-80（TW-80）、司班-80（SP-80）、氯化锌和1，2-丙二醇：均来自成都科隆化学试剂公司。其他试剂均为分析纯。傅里叶变换红外光谱仪：Nicolet iS50型，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；pH计：Seven Multi型，瑞士梅特勒-托利多公司；台式扫描电子显微镜：PhenomPro-X，复纳科学仪器（上海）有限公司；激光粒度粒径分析仪：S3500-SI型，美国麦奇克有限公司；纳米粒度及电位分析仪：ZS90型，马尔文仪器公司；紫外分光光度计：U3900型，美国珀金埃尔默公司；原子吸收分光光度计：AA32DCRT型，上海仪器公司；DMI1000显微镜、DMI4000B高分辨率倒置荧光显微镜：德国徕卡仪器公司。1.2果胶壳聚糖载药微球的制备Fig.1 Schematic formation process of the Olsalazine-loaded PecCS microspheres and crosslinkingmechanism of core-shell structure microspheresAppearance of microspheresParticles are round,uniform in size and dispersed separatelyParticles are round,uniform in size and clumped togetherParticles are squashed,uneven in size and numerous clasticParticles are agglomerated malformed lumpsParticles are shapeless and haphazardly distributedScore0.810.60.80.40.60.20.400.2Tab.1 Appearance evaluation criteria of microspheres43高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期空白的果胶壳聚糖复合微球（PecCS Ms）是基于乳液交联固化法4,15和层层自组装16合成的，其具体制备过程和交联机理如Fig.1所示。取一定量果胶于烧杯中，加入蒸馏水并置于磁力搅拌器上搅拌溶解。取一定量司班-80、吐温-80和液体石蜡共搅拌组成有机相，再将果胶溶液逐滴添加到油相中，在室温用磁力搅拌器以5000 r/min的转速搅拌1 h获得均一稳定的油包水乳液。缓慢地往乳液中滴加一定量的10%氯化锌溶液，后改为较低转速（2000 r/min）搅拌3h，使其交联固化。分别用乙醇、石油醚和蒸馏水洗涤3遍，以8000 r/min的转速离心10 min，得到果胶微球沉淀。接下来，将上述沉淀分散于200 mL蒸馏水中，缓慢滴加一定量含2%醋酸的壳聚糖溶液，搅拌2 h后再低速离心（2500 r/min）分离微球，逐步滴加一定量的5%柠檬酸纳溶液并持续搅拌2 h，再用蒸馏水以2000r/min的转速离心洗涤10 min，重复3次，收集离心沉淀。将上述沉淀放置于20 的冰箱冷冻10 h，再放入冷冻干燥机干燥24 h后得到干燥的壳聚糖包裹的果胶微球。同样地，负载奥沙拉嗪的果胶壳聚糖复合微球（Olsalazine-PecCS Ms）也按上述步骤制备，只是需在一开始加入一定量奥沙拉嗪钠溶解于果胶溶液中。1.3制备微球影响因素的考察根据前期的预实验探究和文献调研，通过单因素变量法优化制备方案，在一定范围内对表面活性剂中司班-80和吐温-80的比值、乳液中油相和水相的比值、果胶浓度、氯化锌加量、壳聚糖浓度及柠檬酸钠加量6个因素进行考察，以微球外观形貌、微球粒径和电位为优化指标。冷冻干燥后微球的圆整度、均一性及分布状态对微球释药效果有极大影响，Tab.1 为微球外观形貌的评分标准。1.4微球表征1.4.1微球形貌分析及元素组成表征：将样品稀释至一定浓度后滴加到载玻片上，在光学显微镜下观察微球的外观形貌。将微球黏附于金属负载平台，然后在高真空蒸发器中溅射喷金70 s。通过台式扫描电镜分析果胶酸锌微球、果胶壳聚糖复合微球的形貌差异，扫描电压10 kV。同时采用能量色散光谱仪（Oxford）测定微球的元素组成及含量分布。1.4.2微球粒径分布及 Zeta电位测定：取10 mg样品均匀分散于10 mL蒸馏水中，再转移至激光粒径粒度分析仪的检测仓中，对微球的平均粒径及其分布进行测量。从分散均匀的样品中取 1 mL 注入到电位池，再将电位池插入Zeta电位仪中，进行Zeta电位测定，重复测试3次。1.4.3傅里叶变换红外光谱分析：在室温（252），取适量原料及微球样品与溴化钾混合，研磨，压制成片，用傅里叶变换红外光谱仪采用衰减全反射模式，在4004000 cm-1波数范围内扫描记录，扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1，最终得到样品及原料的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。1.4.4微球的核壳结构表征：用异硫氰酸荧光素（FITC）标记壳聚糖壳层，用罗丹明 B 标记果胶微球核,在荧光显微镜下观察果胶壳聚糖复合微球的核壳结构。配制含有2%醋酸的壳聚糖溶液和1 mg/mL的FITC甲醇溶液。在壳聚糖溶液中缓慢滴加FITC甲醇溶液，轻轻搅拌并置于 4 避光孵育 4 h，加入NaOH调节pH值为9，终止反应并析出FITC标记的壳聚糖，用甲醇/水混合溶剂反复洗涤并离心除杂。将罗丹明B溶解于果胶溶液中，调节pH值为9，在25 持续避光搅拌10 h后离心洗涤，得到罗丹明B标记的果胶。采用乳液交联法和层层自组装法制备了含有FITC和罗丹明B标记的果胶壳聚糖复合微球。1.5包封率和载药量测定1.5.1标准曲线的制备：首先通过紫外分光光度计全扫描发现奥沙拉嗪在磷酸盐缓冲溶液的最大吸收波长为360 nm。配制一系列浓度梯度的奥沙拉嗪溶液（0.04 mg/mL，0.02 mg/mL，0.01 mg/mL，0.005mg/mL，0.0025 mg/mL 和 0.00125 mg/mL），并在360 nm处检测其对应吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，利用Origin软件模拟标准曲线，得到相应方程(R20.999)。类比于上述步骤在原子吸收分光光度计中模拟出Zn2+的标准曲线。1.5.2包封率和载药量的测定：采用直接消化法测定果胶壳聚糖复合微球中奥沙拉嗪的含量。将10mg微球分散于30 mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中并加入2 mg果胶酶和2 mg纤维素酶。混合物在恒温振荡器中于37 振荡48 h，然后用超声波粉碎，使药物完全从微球中分离出来。以1104r/min的速度离心10 min，收集上清液，用紫外分光光度计在360nm处测定吸光度，依据标准曲线倒推出奥沙拉嗪的含量。实验重复3次，载药量(DL)和包封率(EE)由式（1）和式（2）计算EE=mm0(1)DL=mmt(2)44高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期式中：m微球内药物含量；m0添加的总药量；mt载药微球的总质量。1.6载药微球的释放性能测试采用透析法考察微球在模拟内消化道环境下的释药行为。将约 20 mg 样品分散于含有 2 mL PBS(pH=7.4)的透析袋(截止分子量2000)中。透析袋浸泡在装有 20 mL 模拟结肠液(PBS,pH=7.4)的离心管中，置于转速为100 r/min、温度为(370.5)的恒温摇床中。在设定的时间节点，从分散介质中提取1mL PBS，加入等量新鲜分散介质，保持介质体积恒定,直至72 h后结束。用紫外-可见分光光度计在360 nm处测量各时间点提取样品的吸光度。根据标准曲线推导出药物浓度，并计算药物的累积释放率，根据以上采集数据绘制药物释放曲线。类比于上述步骤在原子吸收分光光度计中测出Zn2+的释放量并绘制释放曲线。2结果与讨论2.1微球制备的优化方案2.1.1司班-80和吐温-80的比例对微球的影响：改变表面活性剂司班-80和吐温-80的比例，固定乳液中油相和水相的比例为10:1，以及果胶和壳聚糖溶液的浓度分别为5%和0.5%，同时固定氯化锌加量为2.5mL和柠檬酸钠的加量为0.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，观察微球形貌并记录其平均粒径和Zeta电位，结果见Tab.2。由Tab.2可见，司班-80含量越多，形成的微球平均粒径越小，Zeta电位均为正值且逐步增大，说明壳聚糖层的成功包覆，但Zeta电位均低于30 mV，微球间不够稳定易凝聚。这是由于司班-80为亲油性的表面活性剂，吐温-80为亲水性表面活性剂，两者复配形成的表面活性剂有利于维持乳液稳定，复配表面活性剂中司班-80含量越高，亲水亲油平衡值（HLB）越小，越容易形成油包水乳液。同时，果胶水溶液在液体石蜡中的分散越均匀，形成的液滴平均粒径越小，加入Zn2+交联后，液滴固化成微球，不易团聚且粒径均一，后续探究固定司班-80和吐温-80的体积比为9:1。2.1.2油水相体积比对微球的影响：改变乳液中油相液体石蜡和水相的比值，固定表面活性剂司班-80和吐温-80的体积比为9:1，固定果胶和壳聚糖溶液的浓度分别为5%和0.5%，固定柠檬酸钠的加量为 0.5mL，以及氯化锌加量为2.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，记录数据，结果见Tab.3。显而易见，随着液体石蜡的量增多，微球的平均粒径不断减小，Zeta电位也逐渐变大。这是因为油相含量越多，果胶溶液分散越均匀，更易形成油包水乳液，但油水相比值为5:1与7:1，10:1时的结果相差不大，而比值过大时，果胶含量过少、产率低，不便于后续加工，因而固定油水相的比例为5:1。2.1.3果胶溶液浓度对微球的影响：改变果胶溶液的浓度，固定乳液中油相和水相的比值为5:1，司班-80 和吐温-80 的体积比为 9:1，壳聚糖溶液的浓度为Tab.2 Effect of the volume ratio of Span-80 and Tween-80 on microspheresV(SP-80):V(TW-80)1:15:17:19:1Microspheres diameter/m26.323.8317.322.3714.731.4713.861.85Zeta potential/mV16.321.7920.862.1422.312.0224.832.83Appearance rating0.10.30.60.7Tab.3 Effect of the oil-water phase volume ratio on microspheresV(oil phase):V(water hase)2:15:17:110:1Microspheres diameter/m18.971.2114.190.9712.310.5312.820.68Zeta potential/mV24.91.5828.41.3928.91.8729.32.54Appearance rating0.40.80.80.745高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期0.5%，以及氯化锌加量为2.5 mL，固定柠檬酸钠加量为 0.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，观察微球形貌并记录粒径和Zeta电位,结果如Tab.4所示。分析Tab.4中数据发现，随着果胶溶液的浓度增大，微球的平均粒径不断增大，Zeta电位减小，这是由于果胶浓度过高时，生成的微球平均粒径较大，冷冻干燥后容易坍塌破损，并且浓度为8%和10%时，微球易多颗抱团分布,分散不够均匀，因而后续实验固定果胶浓度为2%。2.1.4氯化锌加量对微球载药量和包封率的影响：改变氯化锌加量，固定乳液中油水相的比值为5:1，且表面活性剂司班-80和吐温-80的体积比为9:1，固定果胶溶液和壳聚糖溶液的浓度分别为2%和0.5%，固定柠檬酸钠的加量为 0.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，观察微球形貌并记录平均粒径和Zeta电位,结果如Tab.5所示。分析发现，锌离子加量越多微球粒径越大，电位越低，这是因为其加量不足时交联固化不完全，冷冻干燥后微球易破损,而加量过多时微球又易相互黏附团聚成大块。同时，为不影响乳液内油水相的比例，交联剂锌离子固定为较高浓度（10%），且后续固定氯化锌加量为0.5 mL。2.1.5壳聚糖溶液浓度对微球的影响：改变壳聚糖溶液的浓度，固定乳液中油相和水相的比值为5:1，且表面活性剂司班-80和吐温-80的体积比为9:1，固定果胶浓度为2%且氯化锌加量为0.5 mL，固定柠檬酸钠的加量为 0.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，并观察微球形貌记录平均粒径、Zeta电位。根据Tab.6中数据可知，滴加的壳聚糖溶液浓度越大时，Zeta电位值越高，说明微球越稳定。随着壳聚糖溶液增大，微球平均粒径先增大后减小，是因为当添加的壳聚糖量过少时（0.1%），几乎无壳聚糖层包裹于果胶微球上,而当壳聚糖浓度为0.5%时不足以完全包裹微球表面，只能同时粘连着几颗微球，形成大堆的团聚物，平均粒径反而偏大，选择壳聚糖浓度为1%时较为合适。2.1.6柠檬酸钠的加量对微球载药量和包封率的影Tab.4 Effect of pectin concentration on microspheresPectin concentration/(gmL-1)2%5%8%10%Microspheres diameter/m11.270.6814.190.9726.821.3229.821.21Zeta potential/mV24.90.8319.41.2316.01.1614.361.39Appearance rating0.90.60.40.4Tab.5 Effect of Zn2+dosage on microspheresV(Zn2+)/mL0.51.53.55.0Microspheres diameter/m10.300.6922.373.2127.922.4632.782.04Zeta potential/mV28.12.6425.52.3520.831.8917.41.43Appearance rating0.80.40.30.2Tab.6 Effect of chitosan concentration on microspheresChitosan concentration/(gmL-1)0.1%0.5%1%2%Microspheres diameter/m10.520.5117.951.0211.120.6212.230.76Zeta potential/mV-1.420.4828.41.9838.51.540.071.8Appearance rating0.60.40.90.746高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期响：改变柠檬酸钠加量，固定乳液中油相和水相的比值为5:1，表面活性剂司班-80和吐温-80的体积比为9:1，固定果胶和壳聚糖浓度分别为2%和1%，且氯化锌加量为0.5 mL，按照1.2节的方法制备果胶壳聚糖复合微球，观察微球形貌并记录平均粒径和Zeta电位，结果如Tab.7所示。分析发现，1.5 mL 5%柠檬酸钠容易和多余的壳聚糖交联团聚成絮状物，冷冻干燥后样品中多碎屑。同时，在一定范围内柠檬酸钠越多，平均粒径越小，是因为其交联更紧密，微球越牢固，扫描电镜下碎屑也较少，因而添加1.0 mL 5%的柠檬酸钠比较恰当。综上所述，通过一系列的单因素变量法的筛选，最终选定最佳制备条件是司班-80和吐温-80的体积比为9:1，油水相的比例为5:1，果胶浓度为2%，壳聚糖浓度为1%，氯化锌加量为0.5mL 10%，以及柠檬酸钠加量为1 mL 5%。基于最佳制备条件，通过添加不同浓度的药物测量其载药量和包封率，并记录包封过程中的粒径及电位变化。2.2微球的化学结构采用红外光谱法对果胶微球的形成和壳聚糖包覆过程进行了评价，所有原料、中间体和最终产物均经过FT-IR光谱表征和确认，如Fig.2所示。在3354cm-1处有 OH（羟基）的伸缩振动，2936 cm-1处有CH（CH3基团）的伸缩振动，1742 cm-1处是酯化羧基的吸收峰。1639 cm-1处和1437 cm-1处的吸收峰分别是CO（羧基）的不对称伸缩振动和对称伸缩振动。1148 cm 1，1076 cm 1和1014 cm 1处的条带是由糖苷键、吡喃糖环的 CC，CO 收缩振动引起（Fig.2a）。形成果胶微球后（Fig.2b），由于羧基与Zn2+离子结合，使能带发生位移，其中OH伸缩的吸收带变窄且中心移动到3323 cm 1，而属于非对称和对称 CO 伸缩的吸收带移动到 1611 cm 1和 1413cm-1。壳聚糖原料中（Fig.2c），在3392 cm-1处的吸收峰是由 OH 和 NH 的伸缩振动重叠而成的宽峰，2923 cm-1处的吸收峰是 CH3基团的伸缩振动，在1654 cm-1处出现了乙酰基酰胺带（C=O伸缩振动），在1582 cm-1处出现了乙酰基酰胺带（NH弯曲振动），1422 cm-1为COCH3甲基弯曲振动引起的吸收峰。壳聚糖涂层后，光谱出现了一些差异（Fig.2d），在3347 cm-1处出现的强而宽的吸收峰是果胶和壳聚糖的羟基叠加形成的。果胶羧基对应的条带强度减小至1599 cm1和1407 cm1，壳聚糖氨基对应的条带强度减小至1528 cm1。果胶的COOH基团和壳聚糖的NH2基团之间的静电相互作用导致了这些波段向低波数区域的移动且强度明显减弱17。Fig.2 FT-IR spectra of(a)raw pectin,(b)Pec microspheres,(c)raw chitosan and(d)PecCS microspheres2.3微球形貌和元素分布基于最佳研究方案制备的果胶酸锌微球（Pec Ms）和果胶壳聚糖复合微球（PecCS Ms）在光学显微镜中均呈现圆整球形且单分散，如Fig.3所示。在扫描电镜中，无论是果胶微球（Fig.4(a)）还是果胶壳聚糖复合微球（Fig.4(c)）都呈现出圆整球形，且单一分散。而在高倍扫描电镜下可观察到微球表面形貌由最初的光滑变得粗糙和起皱（Fig.4(b)和 Fig.4(d)），说明壳聚糖成功黏附于果胶微球表面。微球的元素分布（Fig.4(e)和 Fig.4(f)）及元素含量（Tab.8 和Tab.9）均如下所示，果胶微球中的元素主要是C，O，H和Zn元素，而覆盖壳聚糖层的PecCS微球具备了特Tab.7 Effect of chitosan concentration on microspheresV(sodium citrate)/mL0.10.51.01.5Microspheres diameter/m13.320.9411.830.7310.250.6110.420.12Zeta potential/mV38.652.2139.521.8837.452.926.51.5Appearance rating0.60.70.90.447高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期Fig.3 Typical images of(a)Pec and(b)PecCS microspheres under optical microscope(100times)Fig.4 Representative SEM images and elemental analysis of the microspheres.(a)Panoramic graph ofthe Pec microspheres(2500 times);(b)magnified view of the Pec microspheres(8000 times);(c)Panoramic graph of the PecCS microspheres(2500 times);(d)magnified view of the PecCSmicrospheres(8000 times);(e)elemental analysis of the Pec microspheres;(f)elemental analysisof the PecCS microspheresMicrospheresPec microspheresElement symbolCOZnAtomic fraction/%63.9531.764.29Mass fraction/%47.9534.5317.52Tab.8 Elemental analysis of Pec microspheresTab.9 Elemental analysis of PecCS microspheresMicrospheresPecCS microspheresElement symbolCONAtomic fraction/%57.4336.685.89Mass fraction/%50.2742.786.9548高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期征性N元素，证明了果胶壳聚糖的成功制备。Fig.6Reversalaboutsurfacezetapotentialofthemicrospheres after each layer coated2.4微球粒径分布与电位测定空白的果胶微球（Pec Ms）、果胶壳聚糖复合微球（PecCS Ms）和奥沙拉嗪负载的果胶壳聚糖复合 微 球（Olsa-PecCS Ms）的 粒 径 分 布 如 Fig.5(ac)所示,包裹壳聚糖层后微球的平均粒径由(8.140.31)m增大为(10.560.66)m,由于奥沙拉嗪富含羧基，可与壳聚糖的氨基紧密交联，负载奥沙拉嗪后微球粒径反而减小至(9.320.74)m。空白果胶微球（Pec Ms）、果胶壳聚糖复合微球（PecCS Ms）和奥沙拉嗪负载的果胶壳聚糖复合微球（Olsa-PecCS Ms）的电位如Fig.6所示。包裹壳聚糖层后微球的电位由(-24.30.62)mV 翻转为(33.7 2.31)mV,载药微球的电位为(38.6 1.46)mV。包裹壳聚糖层后粒径增大和电位翻转也都证明了核壳结构水凝胶载药微球的成功制备。2.5微球核壳结构Fig.7(a)是拍摄于明场下的微球形貌，其与光学显微镜观察的结果一致。在Fig.7(b)中呈绿色的是标记的果胶核，在Fig.7(c)中呈红色的是标记的壳聚糖层。如Fig.7(d)所示，通过罗丹明B和FITC分别标记果胶和壳聚糖后，微球的核壳结构在荧光显微镜下十分清晰。2.6微球的载药量和包封率测定由Fig.8可知，随着负载药物的浓度逐渐增大，果胶壳聚糖复合凝胶微球的载药量（DL）从13.9%上涨至29.4%，且包封率（EE）从19.2%上涨至37.3%。而果胶微球的最大载药量和包封率分别为19.1%和22.3%，说明果胶壳聚糖复合凝胶微球的载药和包封效果更佳，这都得益于核壳结构的多层包封效果。由于凝胶微球为三维网状结构，果胶微球内的奥沙拉嗪在后续浸泡和洗涤过程中，可从内层游离出来，导致了药物不可避免的损失，但在果胶壳聚糖复合微Fig.5(a)Size distribution of blank Pec microspheres,(b)blank PecCS microspheres,(c)Olsazine-loaded PecCS and(d)average size of different microspheres49高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期球中，奥沙拉嗪含有丰富的羧基，游离出来后也能与壳聚糖层的氨基紧密结合，可减少损失。2.7载药微球的药物释放行为目前，核壳结构载药微球主要依靠溶蚀释放、扩散释放和表面释放3种方式18。在药物释放探究中发现，果胶壳聚糖核壳微球（PecCS Ms）比单纯果胶微球(Pec Ms)的缓释效果好得多。在 PBS 溶液（pH=7.4）中模拟体外生理环境下载药微球释放特性，负载奥沙拉嗪的 2 种载药微球的药物释放性能如Fig.9(b)所示，前5 h内奥沙拉嗪在果胶微球中释放了约37.09%，而在果胶壳聚糖复合凝胶微球中仅仅释放了16.22%，同样地，前24 h内奥沙拉嗪在果胶微球内已经释放了高达81.98%，但在果胶壳聚糖复合凝胶微球中只释放了49.23%，直到48 h后奥沙拉嗪 在 果 胶 壳 聚 糖 复 合 凝 胶 微 球 内 释 放 量 为80.29%，到72 h后奥沙拉嗪在果胶壳聚糖复合凝胶微球内释放量高达 89.90%，但在果胶微球中，从24 h到72 h内奥沙拉嗪的释放量变化不大。分析其原因，相较于果胶微球，果胶壳聚糖复合凝胶微球多了壳聚糖层的包覆后，奥沙拉嗪被更好地保护在微球内部，在模拟结肠生理环境中逐步缓慢释放，说明果胶壳聚糖核壳结构载药微球的缓释效果更好。Zn2+具备显著的消炎杀菌功能，常作为离子交联剂用于凝胶多糖材料的合成，有利于病症减轻。根据Fig.10(b)Fig.7 Representative images of core(green)-shell(red)of PecCS microspheres under fluorescencemicroscopy.(a)PecCS microspheres image under bright filed;(b)pectin core(green)ofPecCS microspheres;(c)chitosan shell(red)of PecCS microspheres;(d)merge image ofPecCS microspheresFig.8 Drug loading(DL)and encapsulation efficiency(EE)of(a)PecMs and(b)PecCS microspheresat feeding Olsalazine amounts of 30 mg/mL,40 mg/mL,and 50 mg/mL(n=3)50高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期分析可知，Zn2+在微球内的释放趋势类似于奥沙拉嗪的，同样说明了核壳结构微球的优秀缓释效果。3结论单组分凝胶微球虽可用作药物载体，但由于其单一性，在药物递送方面的应用仍会受到限制，因此，开发具有智能化、多功能的复杂凝胶微球具有更大的实际应用价值。本文以奥沙拉嗪为模型药物，锌离子和柠檬酸为交联剂，通过乳液交联和自组装方法合成了果胶壳聚糖核壳结构微球，并研究了其载药微球的载药效果和缓释性能。结果表明，将药物包封在果胶酸锌微球内部，添加壳聚糖层进一步包封并借助柠檬酸钠交联固化外层，这种设计的双层包封微球的载药效果十分优异，包封率和载药量比普通微球高得多。另外发现奥沙拉嗪在模拟结肠液中前12 h内释放量仅 为 30%，后 续 逐 步 增 加，直 到 72 h 后 才 达 到89.90%，缓释效果极好，双层包封的载药微球减少了药物在上消化道的暴露，有利于其在结肠炎症部位的长时间滞留，发挥更大药效。同时，锌离子在72 h内也逐步缓慢释放，辅助奥沙拉嗪减轻炎症，调节结肠菌群平衡，双重作用有效地提高了炎症性肠病的治愈机率，为后续研究药物缓释的微球载体提供了更多的选择，也为体内探究如何更高效地治疗溃疡性结肠炎提供了新的思路。参考文献：1Lemos T S A,Souza J F,Fajardo A R.Magnetic microspheresbased on pectin coated by chitosan towards smart drug releaseJ.Carbohydrate Polymers,2021,265:118013.2Wang X,Li Y,Dai T,et al.Preparation of pectin/poly(m-phenylenediamine)microsphere and its application for Pb2+removalJ.Carbohydrate Polymers,2021,260:117811.3Jeddi M K,Mahkam M.Magnetic nano carboxymethyl cellulose-alginate/chitosan hydrogel beads as biodegradable devices forcontrolled drug deliveryJ.International Journal of BiologicalFig.9(a)Standard release curve of Olsalazine sodium;(b)in vitro Olsalazine release from PecCSmicrospheres under simulating pH conditionsFig.10(a)Standard release curve of Zn2+;(b)zinc ion(Zn2+)release curves from PCAMs in simulatingthe real gastrointestinal tract detected by atomic absorption spectrophotometer51高分子材料科学与工程2023年李佳颖等：果胶壳聚糖复合凝胶微球的制备及释药性能第6期Macromolecules,2019,135:829-838.4Ibrahim M A,Elagawany M,Ibrahim T S.Green and catalyst-free synthesis of olsalazine analogsJ.Green Chemistry Lettersand Reviews,2016,9:91-95.5Das,S.Pectin based multi-particulate carriers for colon-specificdeliveryoftherapeuticagentsJ.InternationalJournalofPharmaceutics,2021,605:120814.6Chacn-Cerdas R,Medaglia-Mata A,Flores-Mora D,et al.Synthesis of chitosan,pectin,and chitosan/pectin microspheresby two water-in-oil emulsion crosslinking methodsJ.ChemicalPapers,2019,74:509-520.7Sinha A,Gill P P S,Jawandha S K,et al.Composite coating ofchitosan with salicylic acid retards pear fruit softening under coldand supermarket storageJ.Food Research International,2022,160:111724.8Yang W,Zhao P,Li X,et al.The potential roles of n