DB2312_T 088-2023禽用油乳剂灭活疫苗细菌内毒素含量检验技术操作规程.docx

ICS 11.220CCS B 41DB2312黑 龙 江 省 绥 化 市 地 方 标 准DB2312/T 0882023禽用油乳剂灭活疫苗细菌内毒素含量检验技术操作规程2023-11-30 发布2024-01-01 实施绥化市市场监督管理局 发 布DB2312/T 0882023前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由绥化市农业农村局归口。本文件起草单位：黑龙江省百洲生物工程有限公司、明水县农业综合行政执法大队。 本文件主要起草人：张越、张洪楠、李山峰、汪洋、王海楠、王东升。IDB2312/T 0882023禽用油乳剂灭活疫苗细菌内毒素含量检验技术操作规程1 范围本文件规定了禽用油乳剂灭活疫苗细菌内毒素含量检验方法，本法为凝胶法是利用鲎试剂检测或 量化由革兰氏阴性菌产生的内毒素的方法。本文件适用于兽用生物制品生产企业以及经营企业对禽用油乳剂灭活疫苗细菌内毒素含量范围的 检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。中华人民共和国兽药典（2020 版）一部附录“细菌内毒素检查法”。3 术语和定义中华人民共和国兽药典（2020 版）一部附录“细菌内毒素检查法”界定的术语和定义适用于本文件。4 主要技术内容4.1 被检疫苗处理随机抽取油乳剂灭活疫苗 1 瓶，置-20以下条件下冷冻 24h48h，待其完全冻结后，将其取出置室温条件下融化 24h48h，如此反复冻融 3 次4 次，使被检疫苗破乳分层，取适量疫苗 3500r/min 离心 15min 后，用无热源吸管吸取下层液体作为供试品溶液。4.2 供试品溶液稀释用细菌内毒素检查用水（内毒素小于 0.015EU/ml 的无菌水）将供试品溶液做一系列稀释，稀释 10 倍、100 倍、500 倍、1000 倍等不同系列，通过对供试品不同稀释倍数下的细菌内毒素检测，用相应稀释倍数乘以鲎试剂灵敏度，计算供试品中所含细菌内毒素的范围。4.2.1 鲎试剂灵敏度复核实验当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生了任何可改变实验结果的改变时，应根据中华人民共和 国兽药典现行版一部附录“细菌内毒素检查法”进行灵敏度复核实验，确定鲎试剂的灵敏度与标示 值相符。4.2.2 供试品干扰试验供试品初次进行细菌内毒素实验之前，需根据中华人民共和国兽药典现行版一部附录“细菌内毒素检查法”先进行干扰试验，以检测供试品对内毒素检测试验是否有干扰或抑制作用，供试品如对实验有干扰，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加 热处理等)排除干扰。4.3 检测步骤24.3.1 实验前准备4.3.1.1 主要仪器超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、旋涡混合仪、离心机、移液枪、无热源枪头（或去热源的刻度吸管）、耐高温玻璃试管（外径 1075mm，250干烤 1h）。4.3.1.2 试剂鲎试剂（0.1ml/支）、细菌内毒素工作标准品（10EU/支）、细菌内毒素检查用水（内毒素小于0.015EU/ML 的无菌水）。4.3.2 操作步骤按照中华人民共和国兽药典现行版一部附录“细菌内毒素检查法”进行检验,制备供试品溶液、供试品阳性对照、阳性对照和阴性对照。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。取 0.1ml/支的鲎试剂原安瓿若干支，其中： 供试品溶液管：每个待测浓度系列各取 2 支，各加入 0.1ml 供试液； 供试品阳性对照管：根据供试品的不同目标稀释倍数，每个目标稀释倍数下选取 2 支，每个待测稀释倍数下各加入 0.1ml 浓度为的内毒素供试液溶液（分别用相对应的待测稀释倍数下的供试品溶液稀释内毒素标准品，使其溶度为）； 阳性对照管：2 支，各加入 0.1ml 浓度为的内毒素标准溶液（用内毒素检查用水稀释内毒素标准品，使其溶度为）； 阴性对照管：2 支，各加入 0.1ml 内毒素检查用水。将各瓶中溶液轻轻混匀后，封闭瓶口，垂直放入 371的恒温培养箱中，孵育 60min 2min。将安瓿从恒温培养箱中轻轻取出，缓缓倒转 180。若管内形成凝胶并且凝胶不变形、不从管壁脱落者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁脱落者为阴性。记录结果。4.4 结果判定若阴性对照管均为阴性，阳性对照管均为阳性，供试品阳性对照管均为阳性，判定试验有效。若 供试品管均为阴性，判定供试品内毒素含量小于测定值。若供试品管均为阳性，则判定供试品内毒素 含量大于测定值。若供试品出现阳性管和阴性管，需进行复试。复试时供试品管需做 4 支平行管，所有平行管需均为阴性或者均为阳性，则实验成立。5 检验记录填写检验记录，并建立检验档案，内容包括：疫苗名称、厂家、批号、生产日期、有效期、保存 温度、冰箱温度观察记录、内毒素检测记录以及相关检验人、复核人和检查时间，必要时可以拍照留 存电子记录。