负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能.pdf

负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能 赵子伟，池哲人，孙奇奇，李永生，牛德超（华东理工大学材料科学与工程学院，低维材料化学研究室，上海 200237）摘要：利用 Pluronic嵌段共聚物 F127的自组装特性和 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）在 碱 性 环 境 下 的 水 解 缩 聚 反 应，制 备 了 具 有 高 稳 定 性 的 F127 有 机 氧 化 硅 基 杂 化 胶 束PdFOMs；借助杂化胶束表面的巯基与钯物种的配位作用，利用“原位限域生长”策略制备得到负载钯纳米团簇的 F127有机氧化硅基杂化胶束 PdFOMs。采用动态光散射、透射电镜表征了 PdFOMs 的水合动力学直径和形貌，使用 X射线衍射、红外光谱和拉曼光谱分析了PdFOMs的结构，并使用 3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）进行显色反应验证了该体系的类过氧化物酶活性。在双氧水作为底物的情况下，PdFOMs 能够将 TMB 转化为 TMB 氧化物，该氧化物在 652nm 处存在特征吸收峰；PdFOMs 的米氏常数（Km）为 113.91mmol/L。此外，测定了 PdFOMs 的光热性能，PdFOMs 溶液（(Pd)=100mg/L）在 808nm近红外光（1.0W/cm2）照射 300s 后，温度从 18.1 升至 52.9；PdFOMs 有着良好的光热稳定性，光热转换效率高达 65.76%。细胞实验结果表明，PdFOMs能够被肿瘤细胞 SMMC-7721 摄取，并具备良好的生物安全性和光热毒性，有望作为一种类过氧化物酶成像引导的光热治疗剂用于癌症的高效安全诊疗。关键词：钯簇；胶束；有机氧化硅；过氧化物酶；光热治疗中图分类号：TB33文献标志码：A光热治疗（PTT）是一种新兴的治疗手段，其利用激发源（射频、微波、激光等）照射光热剂，将光能转化为热能，以达到杀死癌细胞的目的1。PTT 的生物侵袭性小，成本低，可以选择性地进行局部热疗，因此备受关注2。光热剂的选择是 PTT 的关键。理想的光热剂其吸收波长应当处于 7001100nm的近红外区间，此外还需具备良好的生物安全性和均匀的尺寸。各类纳米材料，包括有机化合物（吲哚菁绿、聚苯胺和聚吡咯）3-6、碳材料（碳纳米管和石墨烯）7-8和硫系化合物（FeS、Cu2-xS、MoS2）9-12等已被广泛开发并用作光热剂。然而，有机化合物容易发生光漂白现象3,5；碳材料虽然拥有良好的光稳定性，但是在近红外区域的吸收较弱，导致其光热转换效率较低；过渡金属硫系化合物虽然具备较强的近红外吸收能力，但其潜在的长期毒性尚不明确；金属硫化物通常使用剧毒溶剂和试剂通过热分解制备，从而在一定程度上增加了其加工成本和生理毒性9,13；贵金属纳米材料具有强烈的表面等离子体共振（SPR）效应和合成可调节性，以及优异的光学和光热特性，例如高吸收截面、出色的近红外区光热转换效率和潜在的生物成像能力，因此作为一种简单高效的光热剂，受到越来越多的关注14。尤其是钯基贵金属纳米材料在近红外区域具有显著的 SPR 效应和良好的生物相容性，在肿瘤诊断和治疗中显示出良好的应用前景15-16。Huang 等17合成了厚度不到 10 个原子层的六方钯纳米片，该纳米片具有良好的光热稳定性和生物相容性。Miller 等18使用 PLGA-PEG纳米颗粒包裹 Pd()预催化剂，通过活体共聚焦荧光显微镜收稿日期：2022-04-24基金项目：国家自然科学基金（52072124）作者简介：赵子伟（1998），男，河北邢台人，硕士生，主要研究方向为纳米生物材料。E-mail:通信联系人：牛德超，E-mail:引用本文：赵子伟,池哲人,孙奇奇,等.负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能 J.华东理工大学学报（自然科学版）,2023,49(4):498-507.Citation：ZHAOZiwei,CHIZheren,SUNQiqi,et al.PreparationandPerformanceofPalladiumClusters-LoadedSilica-BasedHybridMicellesJ.JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology,2023,49(4):498-507.华东理工大学学报（自然科学版）Vol.49No.4498JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology2023-08检测催化剂在肿瘤内的递送和局部催化活性，证明了纳米封装的 Pd 可以安全有效地全身给药。此外，一类具有强螯合有机配体的 Pd()络合物已经进入了/期临床试验，用于光动力治疗19。近年来，一些贵金属基纳米材料被发现具有过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等类酶活性20。与天然生物酶相比，纳米酶是一种具有类似生物酶活性的纳米材料，能够在生理条件下催化酶底物的反应，具有与天然酶相似的催化能力和效率21。此外，它还具有稳定性高、易于修饰、制备简单、成本低等优势，有利于在疾病诊疗领域的广泛应用。Loynachan 等22使用具有类 POD酶活性的金纳米簇（AuNCs）构建了多功能蛋白酶纳米传感器，它能够响应疾病微环境产生的比色信号，从而监测疾病状态。在结直肠癌小鼠模型中，研究人员发现肿瘤小鼠的比色信号是健康小鼠的 14 倍，由此可以直观地观测 AuNCs 催化 3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）引起的显色反应，从而确定组织癌变情况。因此，开发兼具光热和类酶性能的高性能贵金属基纳米治疗剂迫在眉睫。基于此，本文制备了一种新型负载钯纳米团簇的 F127 有机氧化硅胶束（PdFOMs）用于类 POD 酶成像引导的光热治疗：首先使用 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）对 Pluronic 嵌段共聚物 F127 胶束结构进行固定以提高胶束结构的稳定性；随后借助巯基与钯物种的结合能力，采用原位限域生长策略负载钯纳米团簇，最终得到 PdFOMs。研究表明，PdFOMs 不仅具有类 POD 酶活性，还展示出优秀的光热转换能力。细胞实验验证了 PdFOMs 具有良好的生物安全性。因此，该体系有望借助类 POD酶活性催化 TMB 显色能力和光热治疗性能，为癌症诊疗提供一种高效安全的精准治疗策略。1实验部分 1.1 原料和试剂F127：分析纯，Sigma-Aldrich；3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）：分析纯，Sigma-Aldrich；氨水：分析纯，General-Reagent；无水乙醇：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；二氯四氨钯一水合物（Pd(NH3)4Cl2H2O）：纯度 Pd39.2%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼氢化钠（NaBH4）：纯度 96%，上海润捷化学试剂有限公司；双氧水（H2O2）：w=30%，上海国药化学制剂有限公司；TMB：纯度 98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸：分析纯，上海凌峰化学试剂 有 限 公 司；5,5-二 甲 基-1-吡 咯 啉-N-氧 化 物（DMPO）：纯度 97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640 培养基：Sigma-Aldrich；DMEM 培养基：Sigma-Aldrich。1.2 测试仪器与表征透射电子显微镜（TEM）：日本电子株式会社，JEM-2100F 型，工 作 电 压 200kV；动 态 光 散 射 仪（DLS）：英国马尔文公司，MalvernZEN3700 型，室温下测定材料的水合动力学直径和 Zeta 电位；X 射线衍射仪（XRD）：德国布鲁克公司，D8Focus 型，工作电压 40kV，工作电流 40mA，扫描速度 8（）/min；紫外-可见光（UV-vis）分光光度计：日本岛津公司，UV-3600 型，室温下检测材料的紫外-可见光吸收光谱；电感耦合等离子体光谱仪（ICP-OES）：美国安捷伦公司，752ES 型；酶标仪：美国美谷分子仪器有限公司，SpectraMaxM2 型；半导体激光器：上海熙隆光电科技有限公司，FC-808-2000-MM 型；共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）：NikonA1R 共聚焦显微镜。1.3 F127 胶束（FMs）的制备称取 600mg 的 F127 固体粉末，溶于 10mL 去离子水，60 水浴锅中以 400r/min 的转速搅拌 2h使其完全溶解，最终得到 FMs。1.4 F127 有机氧化硅胶束（FOMs）的制备在 40 水浴锅中，400r/min 的转速条件下，向上述实验得到的 FMs 胶束溶液中加入 200LNH3H2O，随后缓慢滴加 400LMPTMS，反应 24h。然后将反应溶液转移至透析袋（MWCO14000），在去离子水中透析 24h，每隔 3h 更换一次去离子水，从而去除溶液中残留未反应的 NH3H2O 和 MPTMS，最终得到FOMs。1.5 PdFOMs 的制备取 1.5mL 上述制备的 FOMs 溶液，加入 2.5mL超纯水，在400r/min 转速下加入2mLPd(NH3)4Cl2H2O溶液（20mmol/L），然后缓慢加入4mL、浓度为10mmol/L的 NaBH4冰水溶液，室温下搅拌 24h 后，转移至透析袋中，在去离子水中透析 24h，每隔 3h 更换一次去离子水，以除去未反应的 NaBH4与 Pd(NH3)4Cl2H2O。为了研究不同 Pd(NH3)4Cl2H2O 加料量对于 Pd 负载量和负载效率的影响，控制总体系和 FOMs的量不变，改变 Pd(NH3)4Cl2H2O 溶液的浓度（5、10、15、25 mmol/L）和 NaBH4溶 液 的 浓 度（2.5、5.0、7.5、12.5mmol/L），得到一系列 PdFOMs，并进行表征。1.6 PdFOMs 的负载量和负载效率取 1mLPdFOMs 溶液进行真空冷冻干燥至脱水，称重后计算其固含量 Ws（质量浓度）：第4期赵子伟，等：负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能499Ws=(m0m1)/V(1)其中：m0和 m1分别为冻干前和冻干后的样品质量，mg；V 为冻干溶液体积，此处为 1mL。采用 ICP-OES 测得 PdFOMs 的 Pd 元素含量，根据式（2）和式（3）分别计算负载量（C）和负载效率（E）。C=WPd/Ws100%(2)E=WPdVTotal/mPd100%(3)其中：WPd为 PdFOMs 溶液中 Pd 元素质量浓度，VTotal为 PdFOMs 溶液总体积，mPd为 Pd 的总质量。1.7 PdFOMs 的稳定性测试将 PdFOMs 溶液分散于两种不同介质（pH 为7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）、含 10%胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养基）中，在恒温振荡器（37）中存放 7d，每 24h 测定一次这两种介质中 PdFOMs 的平均水合动力学粒径，从而探究 PdFOMs 在不同环境下的稳定性。1.8 PdFOMs 的类 POD 酶活性测试在 H2O2存在下，利用 PdFOMs 催化 TMB 发生显色反应，然后采用紫外-可见分光光度计测定TMB 氧化物（TMBox）在 652nm 处的特征吸收。具体操作为：在 pH=4.5 的醋酸-醋酸钠（HAc-NaAc）缓冲液（10mmol/L）中依次加入 PdFOMs（Pd 质量浓度 10mg/L）、TMB（0.68mmol/L，溶于二甲基亚砜（DMSO）和 H2O2（1mmol/L），10min 后测定反应溶液在 652nm 处的紫外吸收。1.9 类 POD 酶的米氏动力学测定在 pH=4.5 的 HAc-NaAc 缓冲液（10mmol/L）中依次加入 PdFOMs（Pd 质量浓度 5mg/L）、TMB（0.68mmol/L，溶于 DMSO）和不同浓度的 H2O2，然后使用紫外-可见光分光光度计测定反应溶液的吸光度，绘制类 POD 酶活性的紫外吸收曲线。以 H2O2浓度 c(H2O2)为横坐标，起始反应速率（v0）为纵坐标，绘制米氏动力学曲线（式（4），并由式（5）得到米氏动力学的双倒数曲线，进一步求得酶的最大反应速率（vmax）和米氏常数（Km）。v0=vmaxc(H2O2)/(Km+c(H2O2)(4)v10=Kmv1maxc(H2O2)1+v1max(5)1.10 PdFOMs 的光热性能表征为评价 PdFOMs 的光热性能，用 808nm 近红外激光器照射 PdFOMs 溶液 5min，用红外热成像相机实时记录溶液升温过程。首先，固定激光功率密度为 1.0W/cm2不变，改变 PdFOMs 的质量浓度（以 Pd 元素的质量浓度 100、50、25、12.5、0mg/L 定量，为便于叙述，分别表示为 100、50、25、12.5、0mg/LPd），测定溶液的升温曲线，以探究质量浓度对其光热性能的影响。其次，固定 PdFOMs 质量浓度不变（100mg/LPd），改变激光功率密度（1.50、1.00、0.75、0.50、0.25W/cm2），测定溶液的升温曲线，以探究功率对光热性能的影响。为研究 PdFOMs 的光热稳定性，使用 808nm近红外激光器在1.0W/cm2的功率密度下对PdFOMs溶液（100mg/LPd）照射 5min，然后待其自然冷却至室温，再次照射 5min，再次冷却，重复 5 个循环，用红外热成像相机完整记录材料溶液的升降温过程。为计算 PdFOMs 的光热转换效率，使用 808nm近红外激光器在1.0W/cm2的功率密度下照射PdFOMs溶液（100mg/LPd），持续 15min，直至材料不再升温，关闭激光器，使其自然冷却至室温，用红外热成像相机完整记录材料的升降温过程。1.11 光热转换效率计算光热转换效率（）的计算见式（6）：=hS(TmaxTsurr)Qdis/I(110A808)(6)其中：h 为传热系数，S 为容器表面积，Tmax为最高温度，Tsurr为环境温度，Qdis为石英皿吸收激光后散发的能量，I 为激光功率密度，A808为 PdFOMs 在 808nm处的吸光度。hS 根据式（7）计算得到：hS=mdcd/s(7)其中：md为样品质量；cd为纯水的比热容；s表示由冷却曲线得到的时间常数，s的计算方法见式（8）和式（9），T 为样品溶液实时温度，t 为时间。=(T Tsurr)/(TmaxTsurr)(8)t=sln(9)1.12 细胞实验1.12.1细胞培养培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞和人体肝癌细胞系 SMMC-7721 细胞来进行体外细胞实验。分别使用含有 10%FBS 的 DMEM 培养基来培育RAW264.7 细胞和含有10%FBS 的RPMI-1640 培养基来培育 SMMC-7721 细胞。所有细胞系均在 37 含 5%（体积分数）CO2气氛的恒温细胞培养箱中培育。1.12.2细胞摄取实验使用 CLSM 来观察 PdFOMs在SMMC-7721 细胞层面的摄取情况。借助PdFOMs表面的巯基接枝马来酰亚胺-聚乙二醇-罗丹明（MAL-PEG-Rhodamine），得到负载罗丹明的PdFOMs（RhBPdFOMs）。其中罗丹明在 561nm 激发光的激发下，能够产生 595nm波长的发射，从而赋予PdFOMs 荧光信号。首先，将 SMMC-7721 细胞以0.5105的细胞密度接种在 CLSM 专用共聚焦皿中，500华东理工大学学报（自然科学版）第49卷孵育 24h 后向体系中加入 RhBPdFOMs，分别共培养 1、4、12、24h。共培养结束后，用 PBS 洗涤3 次，加入 1mL、4%（质量分数）的多聚甲醛溶液固定 10min，然后再用 PBS 洗涤 3 次，之后使用荧光染料 4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色 10min。结束染色后再用 PBS 洗涤 3 次以去除多余的荧光染料，最后添加 1mLPBS 至共聚焦皿，使用 CLSM 对细胞进行观察。1.12.3体外细胞毒性评价将 SMMC-7721 细胞和RAW264.7 细胞以每孔 1104个细胞的细胞密度接种于 96 孔板中，培育 24h，然后与不同质量浓度的PdFOMs（100、50、25、12.5、6.3、0mg/LPd）共培养 24h，之后用 PBS 洗涤 2 次，换用 CCK-8 试剂盒（上海酶联生物）在 37 条件下继续培养 2h，然后用酶标仪测定其在 450nm 处的吸光度，计算得到细胞相对存活率。此外，为了验证 PdFOMs 在细胞水平上的光热毒性，将 SMMC-7721 细胞以每孔 1104个细胞的细胞密度接种于 96 孔板中，培育 24h，然后与不同浓度的 PdFOMs（100、50、25、12.5、6.3、0mg/LPd）共培养 4h，随后用 808nm近红外激光器照射每个细胞孔 5min（功率密度 1.0W/cm2），之后继续培养 20h。再用 PBS 洗涤 2 次，换用 CCK-8 试剂盒在 37 条件下继续培养 2h，然后用酶标仪测定其在 450nm 处的吸光度，根据式（10）计算得到细胞相对存活率（R）。R=(A/Acontrol)100%(10)其中：A 为样品处理后细胞的吸光度，Acontrol为对照组的吸光度。对照组细胞存活率定义为 100%。1.13 统计学表征数据的显著性分析根据非配对 t 检验进行分析：*P0.05，*P0.01，*P0.001。使用软件为GraphPadPrism。2结果与讨论 2.1 PdFOMs 的合成与表征如图 1 所示，首先利用 F127 聚合物的自组装特性在去离子水中形成 FMs，再借助含有巯基的硅烷偶联剂 MPTMS 在碱性条件下发生的水解缩聚反应实现对 FMs 的固定，得到 FOMs，进一步将Pd(NH3)4Cl2H2O 和 FOMs 混合，利用巯基基团与钯物种的配位作用，最终制备 PdFOMs。由于亲水性聚氧乙烯（PEO）链段以及有机氧化硅骨架结构的稳定作用，制备的 PdFOMs展示出均一的粒径分布和良好的单分散性。通过改变 Pd(NH3)4Cl2H2O 的浓度（分别为 1、2、3、4、5mmol/L）制备了 5 组具有不同 Pd 质量浓度的 PdFOMs，分别命名为 PdFOMs-1、PdFOMs-2、PdFOMs-3、PdFOMs-4、PdFOMs-5。图 2（a）所示的 DLS 结果表明，随着 Pd(NH3)4Cl2H2O 浓度的升高，PdFOMs 的分布粒径从 9nm 升高到 16nm。同时，PdFOMs 的 Zeta 电位也升高（图 2（b），这可能是由于 FOMs表面的巯基被更多的 Pd 消耗所导致。此外，负载 Pd 后的 FOMs仍保持一定的负电性，有利于其在生理环境下的循环稳定性。H2OF127OrganosilicaPd nanoclusters图1PdFOMs 的制备示意图Fig.1SchematicillustrationofPdFOMs为了探究 Pd(NH3)4Cl2H2O 的最佳浓度，使用ICP-OES 测得 5 组 PdFOMs 的 Pd 质量浓度，并由式（2）和式（3）计算得到 Pd 的负载量和负载效率。如图 2（c）所示，当 Pd(NH3)4Cl2H2O 的浓度为 4mmol/L时，Pd 的负载量和负载效率达到最佳，分别为 7.8%和 91.6%。因此，选取 PdFOMs-4 体系用于后续实验研究。如图 3 所示，PdFOMs 有着良好的单分散性和均一性，粒径为 10nm 左右。与 DLS 测得粒径（14nm）相比，TEM 照片显示的粒径较小，这是因为胶束在水相中伸展的 PEO 链段对比衬度低，难以在电镜图片中显示出来23。此外，在杂化胶束表面或周围可以明显看到黑色的小颗粒，推测可能是负载的团聚程度较高的 Pd 团簇。为了探究 Pd 在 PdFOMs 中的存在形式，采用红外光谱对 PdFOMs 和 FOMs 进行表征。如图 4（a）第4期赵子伟，等：负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能501所示，2555cm1处的特征峰对应于巯基（SH）的伸缩振动峰。相比于 FOMs，PdFOMs 的巯基伸缩振动峰减弱甚至消失，证明 Pd 与巯基发生了相互作用。拉曼光谱分析进一步证实了 Pd 的引入消耗了FOMs 表面的巯基（图 4（b）。通过对 PdFOMs和 FOMs 进行 XRD 分析探究 Pd 的引入对 FOMs 结构的影响。如图 4（c）所示，PdFOMs 与 FOMs 的特征峰和峰形并无明显变化，表明 Pd 的引入未对 FOMs结构产生影响。值得注意的是，在 PdFOMs的XRD 谱图中发现较为宽化且微弱的 Pd 结晶峰，可以推测，PdFOMs 中的 Pd 是以结晶程度较差的纳米团簇形式存在于 FOMs 结构中。2.2 PdFOMs 的稳定性纳米材料在复杂生理环境下的稳定性是决定其能否用于生物医学领域的重要因素之一。使用PBS 和 RPMI-1640两 种 不 同 的 生 理 介 质 来 探 究PdFOMs 的生物稳定性。如图 5 所示，孵育 7d 后，PdFOMs 在 PBS（pH=7.4）和 RPMI-1640 培养基中的水合动力学粒径并未出现明显变化，表明 PdFOMs在体外模拟生理环境下具有良好的生物稳定性24。2.3 PdFOMs 的类 POD 酶性质POD 酶能够在 H2O2存在的条件下氧化 TMB 发生显色反应，产物 TMBox 在 652nm 处具有显著的特征吸收峰。为了验证 PdFOMs 是否具有类 POD 酶活性，将 PdFOMs（10mg/LPd）、TMB（0.68mmol/L，溶于DMSO）和H2O2（1mmol/L）依次共混在HAc/NaAC缓冲液（10mmol/L，pH=4.5）中，肉眼观察到反应溶液迅速变蓝，10min 后分别测定 TMB、TMB+H2O2、FOMs+TMB+H2O2和 PdFOMs+TMB+H2O2这 4 组样品溶液的紫外-可见光吸收曲线，如图 6（a）所示。1101001 000Diameter/nmPdFOMs-1PdFOMs-1PdFOMs-2PdFOMs-3PdFOMs-4PdFOMs-5PdFOMs-1PdFOMs-2PdFOMs-3PdFOMs-4PdFOMs-5PdFOMs-2PdFOMs-3PdFOMs-4PdFOMs-502468101212.09.99.67.65.414Zeta potential/mV100806040200E/%C/%87654321(a)(b)(c)图2不同 Pd(NH3)4Cl2H2O 浓度制备的 PdFOMs 的动力学直径（a）和 Zeta 电位（b）;Pd 负载效率和负载量（c）Fig.2Hydrodynamicdiameters(a),Zetapotentials(b)andPdloadingefficienciesandloadingcapacities(c)ofPdFOMspreparedwithdifferentconcentrationsofPd(NH3)4Cl2H2O50 nm图3PdFOMs 的透射电镜照片Fig.3TEMimageofPdFOMs3 5002 5001 500500Wave number/cm12 555 cm1FOMsPdFOMsFOMsPdFOMs3 0002 5002 0001 5001 000500Raman shift/cm12 555 cm1FOMsPdFOMs60708050403020102/()(a)(b)(c)Pd PDF#46-1043(111)(200)(220)图4FOMs 和 PdFOMs 的红外光谱图（a）和拉曼光谱图（b）；FOMs、PdFOMs 和标准 JCPDS 卡片（序号 46-1043）的XRD 谱图（c）Fig.4FT-IRspectra(a)andRamanspectra(b)ofFOMsandPdFOMs;XRDpatternsofFOMsandPdFOMswiththestandardJCPDSfile(No.46-1043)(c)502华东理工大学学报（自然科学版）第49卷与 TMB+H2O2相比，PdFOMs 的加入使得体系在652nm 处出现了强烈的特征吸收峰，证实了PdFOMs具有显著的类 POD 酶活性，而 FOMs的加入并不能引发同样程度的显色反应，表明 PdFOMs 的类 POD酶活性源于负载的 Pd 纳米团簇。此外，使用 DMPO作为羟基自由基（OH）捕获剂，通过电子自旋共振（ESR）测定发现，PdFOMs 类 POD 酶催化过程中并未产生OH（图 6（b）。这说明 PdFOMs 的类 POD酶活性不是源于类芬顿反应，而是其介导的电子转移过程25-27。PdFOMs 作为电子转运体，使电子从底物转移到 PdFOMs，继而再转移到 H2O2，最终导致了底物 TMB 的氧化和 H2O2的分解28-29。Km是用于评估酶和底物亲和力的一个重要参数，Km越低，表示酶和底物亲和力越高。通过测定PdFOMs 的米氏动力学曲线得到类 POD 酶活性的双倒数曲线（图 6（c），进一步得到 PdFOMs 的 Km为113.91mmol/L，最大反应速率vmax为4.76mol/(Ls)。其类 POD 酶的 Km值虽然比天然酶 HRP 高30，但是低于已报道的类POD 纳米酶（例如，PdAuNRs 的Km为340mmol/L31，18nmPd 立方体的Km为700mmol/L32），因此 PdFOMs 有着出色的类 POD 酶活性。2.4 PdFOMs 的光热性能首先使用紫外-可见光分光光度计测定 FOMs和 PdFOMs 的吸收曲线。如图 7（a）所示，相比于FOMs，PdFOMs在 808nm 附近有明显的吸收，表明其可在近红外光激发下产生光热效应。进一步使用808nm 激光器照射 PdFOMs 溶液探究材料浓度和激光功率密度对 PdFOMs 光热效应的影响，分别如图 7（b）和 7（c）所示。与纯水相比，PdFOMs 溶液在 808nm 激光（1.0W/cm2）照射后会出现明显升温，其中 100mg/LPd 时的 PdFOMs 在激光照射 300s后温度从 18.1升高至 52.9；激光功率密度越大，相同条件下温升越高，表明 PdFOMs的光热升温与材料质量浓度和激光功率密度呈正相关。此外，光热稳定性也是评价光热材料性能的一个重要指标，具有良好光热稳定性的纳米材料能够在体内实现高效的光热治疗。在 808nm 激光（1.0W/cm2）照射下，连续 5 次升降温，其光热性能未出现下降（图 7（d），表明 PdFOMs 具有良好的光热稳定性。光热转换效率表示光热材料将吸收的光能转换2015105Hydrodynamic diameter/nm1012345678Time/dPBSRPMI-1640图5PdFOMs 在 PBS（pH=7.4）和 RPMI-1640 培养基中 7d 内的水合动力学粒径变化情况Fig.5HydrodynamicdiametersofPdFOMsinPBS(pH=7.4)andRPMI-1640mediumin7d3.53.02.52.01.51.00.50500550600650700750800Wavelength/nmAbsorbance/(a.u.)TMBTMB+H2O2FOMs+TMB+H2O2PdFOMs+TMB+H2O2H2O2PdFOMs+H2O2PdFOMsTMBTMB+H2O2FOMs+TMB+H2O2PdFOMs+TMB+H2O23 4003 4503 5003 5503 6003 650Magnetic field/(Am1)(a)(b)(c)PdFOMsV1/(108 mol1Ls)c(H2O2)1/(mmol1L)0.250.200.150.100.0500.20.40.60.81.0y=0.235 8x0.002 1R2=0.999 7图6类 POD 酶活性的紫外吸收曲线，以及反应体系的颜色变化（a）；H2O2，PdFOMs 和 PdFOMs+H2O2的 ESR 谱图（b）；类 POD 酶活性的米氏动力学双倒数拟合曲线（c）Fig.6UV-vis absorbance spectra showing POD-like activity,andcolorchangeofreactionsolution(a);ESRspectraofH2O2,PdFOMsandPdFOMs+H2O2(b);Michaelis-Menten kinetics double reciprocal plot of POD-likeactivity(c)第4期赵子伟，等：负载钯簇的氧化硅基杂化胶束的制备及性能503为热能的能力，是评价材料光热性能的另一个重要指标。通过记录PdFOMs（Pb）=100mg/L）在808nm激光（1.0W/cm2）照射下的完整的升温降温曲线（图 8），由式（7）计算得到 PdFOMs 的光热转换效率为65.76%，高于目前已报道的其他 Pd 基纳米光热材料，包 括 Dap-PdNFs 的 光 热 转 换 效 率 为 38%33，PdNSs 的光热转换效率为 52%34。2.5 PdFOMs 的细胞吞噬使用 SMMC-7721 细胞进行 PdFOMs 的细胞吞噬实验研究。由于 PdFOMs 本身不具备荧光性能，所以首先利用材料表面残余的巯基通过加成化学反应嫁接MAL-PEG-Rhodamine 分子赋予PdFOMs荧光信号。其中罗丹明分子在 561nm 激发光的激发下，能够产生波长 595nm 的发射。随后，将罗丹明B（RhB）标记的 PdFOMs 与 SMMC-7721 细胞分别共培养 1、4、12、24h，并在 CLSM 下观察，如图 9 所示。蓝色荧光表示 SMMC-7721 细胞，红色荧光表示RhBPdFOMs，随着时间的延长，细胞内出现的红色荧光信号逐渐增强，表明更多的颗粒被胞吞进入SMMC-7721 细胞中。2.6 PdFOMs 的细胞毒性为了验证 PdFOMs 在细胞层面的生物安全性1.52.01.00.50AbsorbanceFOMsPdFOMs500600700800900 1 000 1 100 1 200Wave length/nm555045403530252015Temperature/Temperature/050100150200250300Time/sTime/sTemperature/Time/s012.52550100706050403020050100150200250300605040302001 000 2 000 3 000 4 000 5 000 6 0000.250.500.751.001.50(a)(b)(c)(d)(Pd)/(mgL1):I/(Wcm2):图7FOMs 和 PdFOMs 的紫外-可见光吸收曲线（a）；808nm 激光照射下不同 Pd 质量浓度（b）和不同激光功率密度（c）下PdFOMs 的光热升温曲线；PdFOMs（100mg/LPd）的光热稳定性（d）Fig.7UV-visspectraofFOMsandPdFOMs(a);TemperatureelevationcurvesofPdFOMswithvaryingmassconcentrationsofPd(b)orvaryinglaserpowerdensities(c)upon808nmlaserirradiation;PhotothermalstabilityofPdFOMs(100mg/LPd)(d)Temperature/70605040302005001 0001 5002 000Time/s(a)1 2001 0008006004002000Time/s00.51.01.52.02.53.03.5ln(b)y=365.01x30.33R2=0.99图8使用 808nm 激光（1.0W/cm2）照射 PdFOMs（100mg/LPd）15min 后再自然冷却的温度变化（a）；从冷却阶段（15min后）得到的线性时间拟合数据（b）Fig.8TemperaturechangeofPdFOMs(100mg/LPd)uponirradiationfor15minbeforethe808nmlaser(1.0W/cm2)wasturned-off(a);Lineartimedataobtainedfromacoolingstage(after15min)(b)504华东理工大学学报（自然科学版）第49卷和光热毒性，选用 RAW264.7 细胞和 SMMC-7721 细胞作为细胞模型。将上述细胞和 PdFOMs（100mg/LPd）共培养 24h 后，使用 CCK-8 试剂盒检测细胞存活率，结果如图 10（a）所示。两种细胞的存活率均在80%以上，表明 PdFOMs 在细胞水平上具有良好的细胞相容性35。进一步选用 SMMC-7721细胞验证PdFOMs 的光热毒性，如图 10（b）所示。在 808nm激光（1.0W/cm2）照射 5min 后，细胞的存活率随PdFOMs 质量浓度的增加而降低，表明 PdFOMs的光热毒性与材料质量浓度呈正相关。尤其是当50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 mBright fieldDAPIRhodamine BMerge1 h4 h12 h24 h图9SMMC-7721 细胞和马来酰亚胺-聚乙二醇-罗丹明标记的 PdFOMs 共培养 1、4、12、24h 后的激光共聚焦图像Fig.9CLSMimagesofSMMC-7721cellsincubatedwithMAL-PEG-Rhodamine-loadedPdFOMsfor1,4,12,24h120100806040200Cell viability/%Control6.312.52550100(Pd)/(mgL1)(Pd)/(mgL1)RAW264.7;SMMC-7721(a)140120100806040200Cell viability/%06.312.52550100Control;PTT(b)*P0.05,*P0.01,*P1 m)imaging andphotothermal cancer therapy with carbon nanotubesJ.NanoResearch,2010,3(11):779-793.7YANGK,FENGLZ,SHIXZ,et al.Nano-grapheneinbiomedicine:Theranostic applicationsJ.Chemical Soci-etyReviews,2013,42(2):530-547.8YANGK,YANGGB,CHENL,et al.FeSnanoplatesasamultifunctional nano-theranostic for magnetic resonanceimaging guided photothermal therapyJ.Biomaterials,2015,38(1):1-9.9TIANQW,JIANGFR,ZOURJ,et al.HydrophilicCu9S5nanocrystals:Aphotothermalagentwitha25.7%heatcon-versionefficiencyforphotothermalablationofcancercellsin vivoJ.ACSNano,2011,5(12):9761-9771.10TIANQW,TANGMH,SUNYG,et al.Hydrophilicflower-like CuS superstructures as an efficient 980 nmlaser-driven ph