N、P掺杂r-氧化石墨烯修饰电极用于检测乳酸.pdf

第 42 卷第 4 期2 0 2 2 年 1 2 月Vol.42，No.4Dec.2022化学传感器CHEMICAL SENSORS基金项目：国家自然科学基金（21964022）*通信联系人,N、P 掺杂 r-氧化石墨烯修饰电极用于检测乳酸江湖滨1，陈俊潮2，李群芳2*(1.湖北省恩施市鹤峰县下坪乡民族中心学校，湖北恩施，445000)(2.湖北民族大学化学与环境工程学院，湖北恩施，445000)摘 要：以三聚氰胺作为氮源，植酸作为磷源，在 900下将氧化石墨烯碳化为还原氧化石墨烯，得到 N、P 掺杂材料 900-RNPG，利用 SEM、EDS 技术表征 N、P 原子被成功掺入材料，将该材料滴涂到裸玻碳电极 GCE 烘干，再滴涂乳酸脱氢酶和 NAD+，得到乳酸传感器 900-RNPG/GCE。通过电化学交流阻抗法EIS、循环伏安法CV、计时电流法it，研究了900-RNPG/GCE传感器对乳酸的电化学特性，在最优条件下，该传感器对乳酸在 100 mol/L-7 mmol/L 范围内有良好的线性范围，检出限为 33.4 mol/L（S/N=3），具有较高的响应电流值、较宽的线性范围、较低的检出限以及较强的抗干扰能力，可以有效应用于乳酸含量检测。关键词：氮磷掺杂；还原氧化石墨烯；乳酸；电化学传感器Detection of lactic acid based on N and P co-doped graphene electrobiosensorJiang Hu-bin1,Chen Jun-chao2，Li qun-fang2（1.Xiaping Center Middle School of Hefeng County,Enshi,445000，China）（2.School of Chemistry and Environmental Engineering,Hubei Minzu University,Enshi,445000，China）Abstract:N and P co-doped graphen（900-RNPG）with excellent electrochemical properties weresynthesized by melamine as nitrogen source and phytic acid was used as phosphorus source,and GO reduced to graphene oxide at 900 .SEM and EDS techniques were used to characterize that N and P atoms were successfully doped into the nanomaterials.the nanomaterials and LDH and NAD+were dropped ontothe surface of GCE to obtain a lactic acid biosensor 900-RNPG/GCE.Electrochemical impedance spectroscopy(EIS),cyclic voltammetry(CV)and chronoamperometry(it)were used to study the electrochemical performance of the lactate sensor.At its best,the linear range of the sensor for lactic acid is 100 mol/L to 7 mmol/L,with a detection limit of 33.4 mol/L.It has a high response current value,a wide linear range,a low detection limit,and strong anti-interference ability,which can be effectively applied to the detection of lactic acid content.Key words:Nitrogen and phosphorus co-doped;reduced oxidized graphene;lactic acid;electrochemical sensors乳酸作为一种小分子代谢物，是细胞在缺氧或无氧的条件下，丙酮酸被乳酸脱氢酶作用所产生的无氧代谢产物。在体育运动方面，平静状态下的人体血液中的乳酸浓度为 0.5-1.5 mmol/L，但在剧烈运动后可以升至 25 mmol/L1。若能在高乳酸浓度的情况下正常训练，说明有着较强的无氧耐力，所以在运动期间血液中的乳酸含量被用作训练状态和体能检测的重要指标。正常人体中的乳酸以 320 mmol/h 的速度被快速清除，如果乳酸无法被及时代谢掉，累计浓度过高则会导致乳酸酸性中毒2；在临床诊断方面，一些疾病会伴随着乳酸浓度升高的症状出现，例42 卷50化 学 传 感 器如败血症、肝脏代谢、慢性病、肠梗阻等等3，同时乳酸浓度对癌细胞的转移和扩散也具有指示作用，不仅如此，在危重病人身上测得的许多关键数据，包括乳酸，已经被用于评估疾病的严重程度、预测发病率和死亡率、预估医疗费用等，并最终指示具体治疗方案和检测治疗的有效性；在食品工业方面，如发酵的乳制品、酒、腌制品等都会在无氧发酵的过程中产生乳酸，基于这一事实，乳酸浓度通常用作厌氧菌发酵的有效指标，作为衡量食品新鲜度和质量的重要标准4。已经报道的乳酸浓度测定常用的分析方法有比色法、荧光测定法5、化学发光法6、高效液相色谱法7、毛细管电泳法8等等，虽然上述这些分析方法为乳酸浓度测定已取得众多成果，但电化学生物传感器具有制备简单、实时直接、无需样品前处理、测试时间短、高灵敏度、高特异性、经济、环境友好等优点，为乳酸快速准确检测提供了新的可能。石墨烯是一种典型的二维无机纳米材料，由碳原子间共平面 sp2 杂化紧密堆叠而成9，得益于其独特的空间结构，石墨烯材料具有优越的电化学性能，如比表面积大、导电性强、载流子迁移率高、电荷转移电阻小等优点，因此石墨烯可作为一种理想的电极修饰材料用以加强电极性能，然而石墨烯也存在着局限性：无法大量制备，尺寸不可控、分散稳定性差、易聚集等特点，为了改良这些不足，提高石墨烯材料的性能，可以通过杂原子掺杂来实现石墨烯的功能化10。本实验采用 Hummers 法11氧化石墨粉得到氧化石墨烯 GO，再以三聚氰胺作为氮源，植酸作为磷源12，将 N、P 元素掺杂进氧化石墨烯 GO，并通过 900 高温还原得到功能化的掺杂材料 900-RNPG，并修饰上乳酸脱氢酶和NAD+得到 900-RNPG 乳酸传感器13。其中 N、P 原子与碳化材料间形成的活性中心，增强了生物识别元件的吸附和活化，更有利于电荷转移，加强了乳酸传感器的电化学性能。1 实验部分1.1 试剂与仪器KYKY-2800 扫描电子显微镜（北京中科科仪技术发展有限公司）；CHI660E 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；SK3-3-12-4 管式炉（杭州卓驰仪器有限公司）；三聚氰胺，30%过氧化氢(H2O2)，植酸，乳酸脱氢酶(LDH,300 U/mg)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，乳酸(LA)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，邻苯二甲酸(Phthalic acid)、尿酸(A)、葡萄糖等购于国药集团化学试剂有限公司。氧化石墨烯的制备参考最传统的 Hummers 方法制得，PBS 缓冲液的配制由 0.01 mol/L 的 K2HPO4溶液和 0.01 mol/L 的 NaH2PO4溶液混合而成，铁氰化钾溶液由 0.05 mol/L 的 Fe(CN)63-/4-溶 液 与 0.05 mol/L的 KCl 溶液混合而成。所有试剂均为分析纯，实验用水均为 18.2 Mcm 的超纯水。1.2 氮磷掺杂复合材料 900-RNPG 的制备称取 0.1 g GO 作为碳源与 50 ml 纯水混合后超声震荡 1 h，制得 GO 分散液。0.1 g 三聚氰胺作为氮源，升温至 40 磁力搅拌 1 h，再向体系中加入 1 ml 植酸作为磷源，保持 40 磁力搅拌 5 h 后，升温至 90 继续搅拌 6 h，降至室温后去除上清液保留沉淀，置于 40 真空干燥后得黑色稠状物，为目标材料前驱体 NPGO。将前驱体材料置于管式炉中，在氮气氛围下以 5 /min 的升温速率升至 900 碳化 2 h，待管式炉自然冷却至室温后取出材料，将碳化材料用玛瑙研钵研磨即得复合材料 900-RNPG。1.3 电化学乳酸传感器的制备酶液的配制：精确称量 1 mg 乳酸脱氢酶与1 mgNAD+一起溶解于 1 ml pH7.4PBS 溶液中，得 1 mg/ml 酶液，采用上述方法同时配制 2 mg/ml 与 3 mg/ml 酶液用于后续考察不同酶浓度对传感器响应电流值的影响，酶液置于冰箱低温冷藏。滴涂材料的配制：精确称量 1 mg 900-RNPG 加于 1 ml DMF 溶液中，超声振荡 1 h 使材料均匀分散，得 1 mg/ml 材料，采用上述方法同时配置 2 mg/ml 与 3 mg/ml 材料用于后续考察不同材料浓度对传感器响应电流值的影响。乳酸传感器的制备：首先将玻碳电极 GCE在 0.3 m 与 0.05 m 的三氧化二铝粉末中分别打磨 3 min，再在纯水与乙醇中交替超声 6 次，江湖滨等：N、P 掺杂 r-氧化石墨烯修饰电极用于检测乳酸 514 期10-15 s/次，红外灯下烘干后得到表面洁净的玻碳电极。之后滴涂 900-RNPG 材料分散液 5 L于电极表面，滴涂完毕的电极于红外灯下烤干后再滴涂 5 L 酶液，置于冰箱内低温冷藏 5 h，待溶剂自然挥发后，乳酸脱氢酶与 NAD+将稳定附着在材料表面，即得乳酸传感器，标记为900-RNPG/GCE。1.4 电化学检测本 实 验 采 用 标 准 的 三 电 极 体 系，用CHI660E 进行测试，900-RNPG/GCE 涂层作为工作电极，铂丝电极作为对电极，甘汞电极作为参比电极。采用循环伏安法 CV 和电化学阻抗法 EIS 在 0.05 mol/L 的铁氰化钾溶液中对工作电极进行电化学性能考察，CV 电位区间是-0.4 V0.6 V，扫描速度为 0.1 V/s；EIS 的频率范围是 1.010-11.0105 Hz；利用 CV 考察滴涂所需的酶浓度和材料浓度 CV 电位区间是-1.5V1 V，扫描速度为 0.1 V/s；采用记时电流法 it 对乳酸进行定量分析时检测电压是 0.13V。2 实验结果与分析2.1900-RNPG 的表征利用扫描电镜 SEM 在 15.0 kV 下对 GO 和900-RNPG 进行形貌和微观结构表征，测试结果如图 1 所示，图 1(A)、(B)分别为 GO 和 900-RNPG 经 50 k 放大后的 SEM 图像，可以看出两种材料间有明显差别，GO 较为平整，表面呈堆叠状分散，这种结构可能会有较弱的导电性，而 900-RNPG 中有着大量明显的孔径通道和材料塌陷，这归因于作为氮源的三聚氰胺和作为磷源的植酸与含氧官能团三者通过分子间氢键和-键的共轭作用螯合在一起，而后在高温碳化的过程中受热分解，所生成的气体将从堆叠的石墨层间释放出来，达到剥离石墨层、活化造孔、掺入杂原子、降低含氧量的效果。对900-RNPG材料进行EDS元素分析表征，其结果如图 1(C)所示，其中 C、O、N、P 元素均匀分散在材料表面，说明 N、P 元素成功掺杂到 900-RNPG 材料中。图 1 (A)GO 的 SEM 图像(B)900-RNPG 的 SEM 图像(C)900-RNPG 的 mapping 谱图 Fig.1 (A)SEM image of GO and 900-RNPG(B)mapping spectrum of 900-RNPG(C)2.2 氮磷掺杂材料的电化学性能测试在 0.05 mol/L 的铁氰化钾溶液中利用循环伏安法 CV 和电化学交流阻抗法 EIS 分别对 GO和 900-RNPG 进行电化学性能测试，CV 测试结果如图 2（A）所示，两种材料修饰电极相比于裸玻碳电极都有着更大的氧化还原电流，且900-RNPG/GCE 的峰电流响应要大于 GO/GCE，进一步说明了掺杂原子的引入对界面电子的传输具有促进作用。EIS 测试结果如图 2（B）所示，主导高频42 卷52化 学 传 感 器区的主要是电荷转移，而主导低频区的主要是物质转移，其中高频区的半圆半径大小直接反映了电极表面电子传递的电阻大小，由图可以看出裸玻碳电极 GCE 响应出的阻抗最大，而GO/GCE 与 900-RNPG/GCE 的阻抗值皆要比裸玻碳电极 GCE 小，且 900-RNPG/GCE 的阻抗小于 GO/GCE 的阻抗，说明材料修饰电极相比于裸玻碳电极有着更好的电子传导能力，N、P 原子的掺入加强了 GO 材料的导电性能。综上所述，900-RNPG/GCE 由于氮、磷原子的掺入，电子传输效率得到提升，具有更好的电化学性能。图 2 不同材料修饰电极在铁氰化钾溶液中的 CV 曲线（A）和 EIS 曲线（B）Fig.2 CV curve(A)and EIS curve(B)of electrodes modified with different materials in potassium ferricyanide solution 2.3 材料浓度的优化所滴涂的材料浓度是传感器信号响应大小的重要参数，分别取 1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml 的 900-RNPG 分散液制备 900-RNPG/GCE，控制材料浓度作为唯一变量并采用循环伏安法CV 在 2 mmol/l 的乳酸待测液中定性分析不同材料浓度的响应电流值大小以获得最优材料浓度，结果如图 3 所示，未滴涂材料的裸玻碳电极 GCE 对乳酸待测液无明显峰电流响应，滴涂1mg/ml 浓度材料的修饰电极对乳酸有了较小的电流响应，当材料浓度增大至 2 mg/ml、3 mg/ml时，氧化还原峰响应电流值有了明显的增大，且 2 mg/ml 的响应电流值大于 3 mg/ml，说明峰电流响应值的大小并不与材料浓度成正比关系，过高浓度的材料聚集在电极表面反而会增大电阻，影响电流传导。综上所述，选取 2 mg/ml 的900-RNPG 材料作为传感器制备的最优浓度。图 3 不同浓度材料修饰电极在乳酸待测液中的 CV 曲线Fig.3 CV curve of electrode modified by different concentrations of modified nanomaterials in lactic acid solution江湖滨等：N、P 掺杂 r-氧化石墨烯修饰电极用于检测乳酸 534 期2.4 酶浓度的优化在上述材料浓度优化的基础上，修饰材料选择 2 mg/ml，再分别取 1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml 的乳酸脱氢酶和 NAD+的混合酶液制备900-RNPG/GCE，控制酶浓度作为唯一变量并采用循环伏安法 CV 在 2 mmol/L 的乳酸待测液中定性分析不同酶浓度的响应电流值大小以获得最优酶浓度，测试结果如图 4 所示，未修饰任何材料和酶的裸玻碳电极 GCE 对乳酸待测液无明显电流响应，当修饰酶浓度为 1 mg/ml 时，900-RNPG/GCE 对乳酸待测液有较小的电流响应，当修饰酶浓度增大为 2 mg/ml、3 mg/ml 时，氧化峰电流值有明显的增大，还原峰电流值无明显变化，说明酶浓度的提高对体系有着促进氧化反应的效果，且 2 mg/ml 的响应电流值大于3 mg/ml，说明峰电流响应值的大小并不与修饰酶浓度成正比关系，过高浓度的酶团聚在电极表面会影响电子的传输，对响应电流反而起到阻碍的作用。综上所述，选取 2 mg/ml 的酶液作为传感器制备的最优浓度。图 4 不同酶液浓度修饰电极在乳酸待测液中的 CV 曲线Fig.4 CV curve of modified electrode with different enzyme concentration in lactic acid solution2.5 线性范围和检出限在滴涂 2 mg/ml 的 900-RNPG 材料与 2 mg/ml 酶液以及乳酸待测液 pH=7.4 的最优条件下制备乳酸传感器，采用计时电流法 it 对梯度浓度的乳酸待测液进行定量分析，所有乳酸溶液均用 PBS 溶液配制。配制 1 mol/L 的乳酸母液待用，首先在 PBS空白液中测试背景电流，再移取定量的乳酸母液加入至 PBS 空白液中得到目标浓度的乳酸待测液，在持续搅拌状态下对乳酸进行定量测试，连续重复上述操作，每间隔 50 s 向乳酸待测液中加入乳酸母液，从 PBS 空白液（0 mol/L）开始，乳酸浓度逐渐增大，得到：0 mol/L-7 mmol/L 的乳酸待测液，随着体系内乳酸浓度不断增大，计时电流法随时间呈现出递增的阶梯状并趋向于稳定，如图 5A 所示，体现出了乳酸浓度与电流值的线性关系，将其拟合绘制成线性曲线得到图 5B，在 100 mol/L-7.0 mmol/L 间有良好的线性关系，线性拟合方程为 I=3.26310-5C+0.03，R2=0.9974，检出限为 33.4 mol/L(S/N=3)。与其他文献所报道的乳酸传感器相比较（见表 1），此次实验所制备的 900-RNPG/GCE 乳酸传感器具有较宽的检测范围和较低的检出限，具有一定的实际应用价值。42 卷54化 学 传 感 器图 5 传感器在不同浓度乳酸待测液中的 i-t 曲线（A）和线性曲线（B）Fig.5 I-t curve(A)and linear curve(B)of the sensor to lactic acid表 1 其他文献报道的乳酸传感器检测性能对比Tab.1 Comparison of performance of various LA biosensors乳酸传感器线性范围（mmol/L)检出限(mol/L)参考文献GPNS/GCE0.2-1.28.015碳糊电极0.5-15.060.013Ti/Pd/Pt/GCE0-1.050.016PB/Ag/AgCl0.1-1.010.017e-RGO/GCE0.5-25.0100.018900-RNPG/GCE0.1-7.033.4本次实验2.6 稳定性及抗干扰能力在最优条件下制备乳酸电极，同批次制备5 只电极，对 2 mmol/L 乳酸检测得相对标准偏差为 5.40%，不同批次制备得 5 只电极的相对标准偏差为 7.34%。置于冰箱内冷藏存放 10 天后再次采用相同的条件测试，结果响应电流值初始测定的 85%，这可能是由于电极上固定的酶过长时间的放置而导致酶的生物活性下降造成。在多数检测环境下，乳酸作为人体常见的小分子生物质难以单独出现，而是常常伴随着葡萄糖、尿酸、抗坏血酸等大量的共存物质出现，所以考察 900-RNPG/GCE 乳酸传感器的抗干扰性是十分有必要的。采用计时电流法在 2 mmol/L 的乳酸待测液中进行测试，待响应电流稳定后，依次加入 10 倍浓度的葡萄糖、尿酸、抗坏血酸等干扰物质，结果干扰物对传感器的信号干扰小于5%，说明了乳酸传感器具有特异性检测，抗干扰效果良好等特点，这是因为乳酸传感器上的乳酸脱氢酶与 NAD+对乳酸有着良好的生物选择性，能够避免其他物质的干扰。结论本实验以三聚氰胺作为氮源，植酸作为磷源，在 900下高温碳化还原氧化石墨烯，得到N、P 掺杂材料 900-RNPG，利用 SEM、EDS 技术表征 N、P 原子被成功掺入材料，最后和乳酸脱氢酶、NAD+一同修饰到电极表面得到 900-RNPG/GCE 乳酸传感器，采用电化学交流阻抗法 EIS 和循环伏安法 CV 在铁氰化钾溶液中对掺杂材料进行电化学性能测试，表明 N、P 杂原子的引入能够增强材料的导电性能。本实验所制备的 900-RNPG/GCE 乳酸传感器对乳酸的检测具有良好的电化学性能、检测范围、检出限、抗干扰能力，具备一定的实际应用价值。参考文献1 Goodwin M L,Harris J E,Hernndez A,et al.Blood lactate measurements and analysis during exercise:a guide for cliniciansJ.Journal of diabetes science and 江湖滨等：N、P 掺杂 r-氧化石墨烯修饰电极用于检测乳酸 554 期technology,2007,1(4):558-569.2 Uribarri J,Oh M S,Carroll H J.D-lactic acidosis:a review of clinical presentation,biochemical features,and pathophysiologic mechanismsJ.Medicine-Baltimore,1998,77(2):73-82.3 Pundir C S,Narwal V,Batra 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