低频高能超声血管成形术的基础与临床研究.pdf

第三军医大学博士学位论文低频高能超声血管成形术的基础与临床研究姓名：宋耀明申请学位级别：博士专业：内科学（心血管）指导教师：何作云2001.5.1低频高能超声血管成形术的基础与临床研究摘 要（超声血管成形术是近年来引起国内外学者关注的一种新的血运重建方 式，采用低频高能超声的机械振动、空化作用等效应裂解粥样硬化斑块、消融血栓、恢复闭塞血管的再通，而对正常血管壁各层结构几乎无损伤）/本研究的目的在于：.通过对低频高能超声作用后动物模型血管平滑6 细胞（VSMC）C-sis表达水平、血小板衍生生长因子（PDGF）、细胞增 生状态的评价，明确低频高能超声对平滑肌细胞增殖效应的影响；应 用低频高能超声消融体外全血细胞血栓及体内急性心肌梗塞死、陈旧性心 肌梗死患者，观察超声消融血栓的效果、安全性；体内超声消融冠脉重 度狭窄，研究低频高能超声对粥样硬化斑块消融的效果。（本研究实验兔分为正常对照组、试验对照组、球囊损伤组、超声消融 组。后二组分别在颈动脉损伤后48h、72h、96h、120h、lw、2w,取目 标段动脉约4c m,分成4份，长度各约1c m。制备后采用RT-PCR法测定 C-sis mRNA表达、3H-TdR掺入法测定SMC DNA合成含量、免疫组织化 学染色法计算PDGFB-阳性指数、PCNA阳性指数。观察球囊损伤、低 频高强度超声对平滑肌细胞增殖效应的影响。结果发现，超声消融组、正 常对照组与试验对照组VSMC的C-sis表达、PDGF-B mRNA含量、PCNA 染色及3H-TdR掺透量均无显著增加；而球囊损伤的兔VSMC各时相点均 有C-sis表达，其高峰期出现在球囊损伤1周，表达量增高了 6.5倍。48h 开始出现PDGF、PCNA阳性VSMC细胞，1周时相点达到峰值。72h开 始旅掺透值持续升高，至1周达高峰。采集正常人静脉血2ml制备为全血细胞凝块20例并行重量测定。应 用40KHz,18W/c n?脉冲式超声对全血细胞凝块消融。消融后取沉淀涂 片，显微镜下检查碎块大小，并与红细胞直径比较。结果发现，超声能量 VI释放15秒内血栓完全溶解，溶解速度为0.1380.018g/s。显微镜下检查 90%的碎片直径小于红细胞直径。应用低频高能超声通过导管技术对急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死 及其PTCA失败的患者进行消融，观察消融前后闭塞相关血管(IRA)TIMI 血流改变并利用SHIMADZU Digit e x a 2400计算机分析系统测量残余狭 窄程度，检测手术前后CKMB、心电图ST段及临床症状的改变，评价 低频高能超声血管成形术治疗心肌梗死的可行性。测定消融前后静脉血中 PT、APTT、t-PA、PAI的含量及观察超声消融中有无冠状动脉痉挛、撕 裂等影像学改变。结果发现，10例AMI患者中消融后9例1RA达到TIMI 血流3级，开通率为90%(9/10)o 10分钟后9例患者胸痛消失、ST段 下降250%,CK-MB峰值明显前移(5.61.2小时)。2例患者超声消融 后冠状动脉造影闭塞相关血管管腔大于非狭窄段，30分钟后造影残余狭 窄分别为24%、18%。8例OMI患者中，7例消融后IRA达TIMI血流3 级，开通率为87.5%(7/8),30分钟后造影闭塞相关血管TIMI仍为3 级。术后30分钟缺血性ST段下移明显好转(上移250%)。5例常规PTCA 失败患者经超声消融，IRA均达TIMI 3级，残余狭窄为64.6 12.64%。低频高能超声通过导管技术对冠脉重度狭窄进行消融，比较消融前 后冠脉狭窄程度的改变，分析手术前后常规心电图ST段改变，手术前后 运动试验测定诱发心绞痛所需时间、运动诱发ST段下降O.lmV所需时间、运动诱发ST段下降最大幅度的比较。结果发现，15支狭窄口75%的血管 消融后残余狭窄为43.03 15.49%,较术前降低42.03%(43.03 15.49%vs85.835.44%,p0.05),5 例消融后残余狭窄30%(33.33%,5/15)。术后心电图缺血性ST段压低较术前明显好转。术后运动诱发心绞 痛所需时间及运动诱发ST段下降O.lmV所需时间、运动诱发ST段下降 最大幅度与手术前比较均有显著差异(P 50%).IRA ac hie c he d TIMI blood f low grade III an d t he re sidual st e n osis we re 64.6 12.64%in 5 pat ie n t s in whom rout in e PTCA f aile d wit h LFHEU.LFHEU was also in t roduc e d via c at he t e rizat ion t o t re at pat ie n t s wit h se rious st e n osis of t he c oron ary art e ry.Comparison of st e n osis de gre e an d ST se gme n t in rout in e ECG be f ore an d af t e r t he t re at me n t was c on duc t e d.Pre-an d post-t re at me n t e xe rc ise t e st s we re pe rf orme d t o me asure t he t ime n e e de d f br in duc t ion of an gin a,t he t ime n e e de d f or in duc t ion of de c re ase in ST se gme n t f or 0.1 mV an d maximal ran ge of de c re ase in ST se gme n t.LFHEU was f oun d t o have dissolve d at he rosc le rot ic plaque s in 15 c ase s of c oron ary he art dise ase wit h st e n osis in on e blood ve sse l 75%.The re sidual st e n osis was 43.03 土 15.49%af t e r t he t re at me n t,re pre se n t in g a de c ie ase of 42.80%as c ompare d wit h t hat be f ore t he t re at me n t(43.03 15.49%vs85.83 5.44%,p0,05).In 5 out of t he se 15 pat ie n t s,t he re sidual st e n osis was le ss t han 30%an d,ST se gme n t in ECG was marke dly lif t e d up af t e r t he t re at me n t.The re we re re markable dif f e re n c e s be t we e n t he t ime n e e de d f br e xe rc ise-in duc e d an gin a,ivt he t ime f or e xe rc ise-in duc e d de c re ase in ST se gme n t f br 0.1 mV an d t he maximal ran ge of de c re ase in ST se gme n t be f ore an d t hose af t e r t he t re at me n t(P0.01).The re sult s of t his st udy sugge st t hat:1.LFHEU doe s n ot sign if ic an t ly af f e c t t he migrat ion an d prolif e rat ion of vasc ular smoot h musc le c e lls.2.LFHEU c an c omple t e ly dissolve f re sh an d organ ize d t hrombi f orme d in vitro an d t hose in pat ie n t s.Me an while,t he re are n o se rious c omplic at ion s in t he proc e ss of dissolvin g an d un f avorable e f f e c t s on blood c oagulat ion an d f ibrin olyt ic syst e ms.3.An gioplast y wit h LFHEU c an be use d as a n e w approac h f br t re at in g ac ut e myoc ardial in f arc t ion,re mot e myoc ardial in f arc t ion,ope n in g IRA as e arly as possible an d re st orin g TIMI blood f low t o grade III.4.LFHEU c an dissolve organ ize d t hrombi wit h high de n sit y t hat obst ruc t s t he blood ve sse l f or a lon g t ime t o c re at e c e rt ain c on dit ion of pot e n c y.In addit ion,it c an ope n t he blood ve sse ls in t hose pat ie n t s wit h PTCA f ailure an d add suc c e ssf ul rat e of t re at me n t wit h PTCA.5.Though LFHEU c an e f f e c t ive ly split at he rosc le rot ic plaque s an d in c re ase ve sse l dime n sion s,t he re is st ill c e rt ain de gre e of re sidual st e n osis af t e r t he t re at me n t wit h t he t e c hn ique.Whe n it is use d in c ombin at ion wit h balloon dilat at ion,it c an re duc e t he pre ssure n e e de d an d de c re ase oc c urrin g rat e an d se ve rit y of re st e n osis af t e r t he t re at me n t.6.LFHEU c an dilat e blood ve sse ls an d e n sure t he saf e t y of an gioplast y.Key words:ult rasoun ds,an gioplast y,ac ut e myoc ardial in f arc t ion,old myoc ardial in f arc t ion,re st e n osis,balloon dilat at ion;at he rosc le rot ic plaquev缩略词表（按英文字母排序）简写英文全称中文全称AMIAc ut e Myoc ardial in f arc t ion急性心肌梗塞APTTAc t ivat ion of part t hrombin oge n t ime活化部分凝血活酶时间bpbase pair碱基对c DNAComple me n t ary DNA互补DNADABDiamin obe n zidin e二氨基联苯胺DNADe oxyribon uc 1 e in ac id脱氧核糖核甘酸ECe n dot he lial c e ll内皮细胞B-ac t inB肌动蛋白IRAin f arc t re lat e d art e ry梗死相关血管mRNAMe ssage RNA信使核糖核甘酸OMIOld Myoc ardial in f arc t ion,陈旧性心肌梗塞PAIplasmin oge n ac t ivat or in hibit or纤溶酶原激活物抑制物PCNAProlif e rat ion c e ll n uc le ar an t ige n增殖细胞核抗原PDGFplat e le t-de rive d growt h f ac t or血小板衍生生长因子PTCAPe rc ut an e ous t ran slumin al c oron ary an gioplast y经皮冠状动脉腔内成形 术PTt hrombin oge n t ime凝血酶原时间RT-PCRRe ve rse t ran sc ript ion PCR逆转录PCRTIMIThromolysis in Myoc ardial in f arc t ion心肌梗塞溶栓试验t-PAt issue plasmin oge n ac t ivat or组织纤溶酶原激活物VSMCvasc ular smoot h musc le c e ll血管平滑肌细胞低频高能超声血管成形术的基础与临床研究，/.,刖 B冠心病的介入性治疗-经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)已成为 治疗冠心病的主要血运重建方式，其成功率可达95%O但在应用过程中也 发现PTCA有其自身难以克服的缺陷，如对球囊导管不能通过的闭塞、狭窄无效；对于偏心、钙化、成角或分枝口及分枝内的栓子成功率低；可并发内膜撕脱、斑块出血及随后的血栓形成、血管痉挛和再狭窄率较 高(30%-50%)等。现应用的激光、旋切等技术对PTCA的缺陷有不同程度 的补充改进，但由于作用的非选择性，对血管壁造成难以控制的损伤，而 导致血管痉挛，造成缺血、梗死及血栓再形成。研究证实血管壁结构受损，使C-sis表达水平增高，癌基因转录水平 的调控影响着血管成形术后再狭窄的发生率。目前PTCA术后即刻血管内 放射治疗可有效地抑制血管平滑肌细胞增殖，减少增殖细胞核抗原(PCNA)表达，改善血管重构，其作用机制可能正是这一环节。C-sis编码的主要 产物为PDGF-B,后者是血小板聚集和VSMC增殖的强烈诱导剂。C-sis表 达的PDGF-B可出现于血管内皮细胞、局部粘附的血小板。在正常情况 下，内皮细胞(EC)C-sis基因表达较少，管壁结构受损后，内皮细胞表 达C-sis成倍增加，合成和释放PDGF-8增多。PDGF-B可通过旁分泌和 自分泌机制促进内膜增生修复，促进动脉中膜SMC由收缩表型向合成表型 转换，并向血管内膜下迁移和增殖，从而导致血管再狭窄。*低频高能超声作用于主动脉、栓子和脂肪组织的研究表明，超声破坏 作用有组织弹性选择性，与组织弹性呈负相关。弹性越大，空化效应越不明显，而弹性与组织内的弹力纤维和胶原纤维含量有关。低频高能超声使 离体、在体动静脉血栓溶解，有效地减少斑块的大小，对粥样斑块和复合 斑块都能破坏。对血管壁无损伤，消融后产生的小碎片块能通过组织微循 环，不造成远端微小血管的栓塞。本研究通过1.低频高能超声对平滑肌 细胞增殖效应的影响；2.低频高能超声消融血栓的研究；3.低频高能超 声消融动脉粥样硬化斑块的研究，证明超声血管成形术的可行性、安全性、有效性。第一部分低频高能超声对平滑肌细胞增殖效应的影响动脉损伤程度与内膜增厚程度成正比已成为广大学者的共识。在 PTCA术后再狭窄的发生机制中，血管损伤使癌基因表达水平增高，癌基 因激活是血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的始动因素，可引起细胞因子、生 长因子等活性分子激活，诱导VSMC增殖及向血管内膜下迁移，导致血 管内膜增厚、管腔狭窄。动脉超声血管成形术是近年来引起国内外学者关 注的一种新的血运重建方式，通过低频高能超声的机械振动、空化作用等 效应裂解粥样硬化斑块、消融血栓、恢复闭塞血管的再通，而病理检查显 示正常血管壁各层结构几乎无损伤。本研究通过对低频高能超声作用后动 物模型血管SMCC-sis表达水平、血小板衍生生长因子（PDGF）、细胞增 生状态的评价，试图明确低频高能超声对血管平滑肌细胞增殖效应的影 响，为低频高能超声的安全应用提供理论基础。材料与方法一.试验材料（一）培养基1.RPMI Me dium 1640（Powde r）：购自美国 Lif e Te c hn ologie s Gibc obr!公司。2.新生小牛血清（FCS）：购自第三军医大学分子生物学实验室。3.PBMC培养用RPMH640培养基：将RPMI 1640粉剂溶于1000ml 去离子水，含100U/ml双抗（抗青霉素/链霉素）、10%新生小牛血清、2.38%He pe s,用7.5%NaOH调pH值至7.3,过滤器过滤灭菌，4或一20c保 存。（二）试剂1.总 RNA 提取试剂盒:Boe hrin ge r Man n he im 公司的 Tripure Isolat ionRe age n t Kit。32.RT-PCR 试剂盒：Prome ga 公司的 Re ve rse Tran sc ript ion syst e m03.PCR引物合成：由上海San gon生工生物工程公司合成。4.TaqDNA聚合酶及相应缓冲液：加拿大San gon公司。5.DNA 分子量标准：pUC19 DNA/Msp I(HPAII)Marke r,23 购自 MBI Fe rme n t as 公司6.5XTAE Buf f e r：0.5mMEDTA、20mM Tris-醋酸(pH8.0)1.211g Tris,0.093g EDTA,溶解于500ml去离子水中，用HAc将其pH值调至 8.0(HAc 用量约为 280 U D。7.增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色试剂盒：北京中山生物技 术有限公司。8.2%APES丙酮溶液：北京中山生物技术有限公司。9.Hist ost ain TM-PlusKit s免疫组化染色试剂盒：北京中山生物技术有 限公司。10.浓缩型DNA试剂盒：北京中山生物技术有限公司。IL PDGF-6单克隆抗体：北京中山生物技术有限公司。(三)主要仪器1.DNA 扩增仪：Ge n e Amp2400,美国 PE PRISM 公司。2.DNA/RNA/蛋白定量仪：Smart Spe c t ro 3000,美国 Bio-Rad 公司。3.台式高速冷冻离心机：WTGL-14L,中国科学院生物物理技术服 务公司。4.高速微量离心机：Mic roc e n t rif uge Forc e 7,美国 De n ve r In st rume n t 公司。5.离心沉淀机：LXJ-II型，上海医用分析仪器厂。6.旋涡混匀器：XW-80型，上海第一医学院仪器厂。7.电热恒温水温箱：上海医学恒温设备厂。8.净化工作台：中国蚌埠净化设备厂。9.电子天平：Ele c t ron ic Moist ure Ban lan c e，日本 Shimadzu Corporat ionKyot o公司。410.一70c冰箱：San yo Ult ro Low,日本 SANYO 公司。11.-20冰箱：San yo Me dic al Fre e ze r,日本 SANYO 公司。12.XSZ光学显微镜：重庆光学仪器厂。13.澳柯玛AM-E23型微波炉：中国澳柯玛公司。14.恒压恒流电泳仪：上海复星高科技（集团）有限公司。15.ZF-90型多功能暗箱式紫外投射仪：上海顾村电光仪器厂。16.自动纯水蒸储器：上海玻璃仪器厂。二.试验方法（-）.实验动物分组：健康家兔82只，雌雄不拘，体重2.0-3.0 Kgo随 机分为：1.正常对照组（n=5）：活杀直接取材。2.试验对照组（n=5）：颈总动脉插管，但不释放超声波，也不行扩张 球囊。术毕饲养48h后活杀取材。3.球囊损伤组（n=36）：颈总动脉经球囊损伤后6个时相点活杀取材:48h、72h、96h、120h、lw、2w,每个时相点均为 n=6。4.超声消融组（n=36）：颈总动脉超声消融处理后6个时相点活杀取 材：48h、72卜、96b、120h、lw、2w,每个时相点均为n=6。（二）.动物模型制作1.球囊颈总动脉损伤：经兔耳缘静脉乌拉坦常规麻醉动物，固定于兔台。左腹股沟脱毛，碘酒、酒精消毒。常规股动脉分离，动脉夹阻断血流，12号注射针头穿刺股动脉,由股动脉穿刺点插入3.5X20mm交换球囊0.5c m,在x线荧光屏监 视下，将0.36mm PTCA导丝经腹主动脉逆行送至颈动脉最远端，退出导丝，沿导丝送入PTCA球囊至颈总动脉，10个at m充盈球 囊，球囊充盈后反复拉动球囊（23c m）4-5次。撤出球囊，动脉穿刺部位压迫止血。缝合伤口，酒精纱布覆盖伤口。2.颈总动脉超声处理 动物麻醉、股动脉穿刺及PTCA导丝送入同球囊颈总动脉损伤。在x线荧光屏监视下，沿导丝送入超声消融探头至颈总动脉，启 动超声，将探头沿平行血管壁方向来回小幅度移动，每次超声消融 时间为30s,超声消融总时间6分钟。伤口处理同球囊损伤。(三).实验动物标本制备经兔耳缘静脉注射空气20ml,空气栓塞致死。然后在无菌条件下，取兔颈总动脉目标段约4c m,分成4份，长度各约1c m,按下述条件制备：1.RT-PCR：置于无菌 Eppe n dorf 管中。2.免疫组化染色:将标本固定于15%甲醛溶液中。3.H-TDR掺入试验:将标本置于含RPMI 1640培养液的Eppe n dorf 管中。4.组织病理切片：将标本置于10%福尔马林中，切片后常规HE染色，光镜下观察。(四).定量RT-PCR检测C-sis mRNA表达水平1.引物设计及PCR反应条件的优化利用引物设计与分析软件Prime r Pre mie r v5.0及DNASis V2.0设计可 特异性扩增C-sis原癌基因及内参照基因B-ac t in,同时优化引物PCR各 反应参数，使两对引物可适用于同一 PCR反应体系。(1)目的基因C-sis基因PCR扩增片段大小461bp,上下游引物序列 分别如下：上游引物 EXON4：5-CCTCATAGACCGCACCAAC-3 下游引物 EXON2：5-GGGGCA ATACAGCAA ATAC-3。(2)内参照B-ac t in基因PCR扩增片段大小870bp,上下游引物序列 分别如下：上游引物 B-ACTIN：5、GTC ACC AACTGGGACGAC AT-3。下游引物 B-ACTIN-2：5-GGACTCGTC ATACTCCTGCT-3。62.待扩增样品的制备将各组待扩增样品用无菌手术剪将血管周围结缔组织剥离，按50.lOOrn g血管组织/Eppe n dorf管的含量，将剥离好的血管组织置于一个新的 无菌Eppe n dorf管中，电子天平精确称重。3.总RNA提取按照总RNA提取试剂盒(TriPure TM isolat ion Re age n t)说明书提取血 管组织总RNA,具体步骤如下：(1)室温下，在每个Eppe n dorf管(50J00mg血管组织)中加入1ml Tri Pure Isolat ion Re age n t 试剂。用glassTe f lon玻棒将组织样品制备成匀浆。样品匀浆于室温下孵育5min,以使核蛋白复合物充分溶解。每只Eppe n dorf管中加入0.2 ml氯仿，小心盖好管盖，用力剧烈 振摇15se c后，于室温孵育2-15min。(5)4,12,000Xg 离心 15min 将无色上层液相转移至一只新的无菌Eppe n dorf管中。按照以下步骤从每个Eppe n dorf管无色液相中沉淀RNA：每只 Eppe n dorf管中加0.5ml异丙醇；盖上管盖后颠倒数次将其充分混匀；室 温孵育5-10min；4C,12,000乂8离心15111讯 弃掉上清液。(8)每只Eppe n dorf管中加入1ml 75%乙醇。(9)通过混旋作用洗涤75%乙醇中的RNA颗粒；4,7,500Xg离心 5min,弃掉上清液；通过空气干燥法从RNA颗粒中去除多余的乙醇；用 逆转录试剂盒所提供的无RNase水溶解RNA。对提取的总RNA进行纯度及浓度的鉴定。在进行RT-PCR之前，用吸样头混匀RNA溶液，然后在55-60C孵育10-15min,然后用于RT-PCR。4.RT+PCR扩增目的基因片段(1)制备第一链 c DNA：按照 RT-PCR 试剂盒(Re ve rs Tran sc ript ion Syst e m)说明书步骤，制备下述反应体系，制备逆转录反应管：7MgCl2 25mMReverse Transc ript ion 10 X BufferdNTP Mixt ure,lOmMRec ombinant RNasin Ribonuc lease Inhibit orAMV Revers Transc ript ase(High Cone.)(60 u L25WN I)Oligo(dT)I5 Primer(100ul,05ug/pl)总RNANuc lease-Free Wat er4.0 ul2.0 ul 2.0UI0.5 ul 0.8 ul 1.0u 1 X ngXulTOTAL20ul上述20ul反应体系反应条件为：42孵育15min-99加热5min-0-5 孵育 5min0(2)PCR扩增目的基因片段：按照RT-PCR试剂盒(Re ve rs Tran sc ript ion Syst e m)说明书步骤进行，反应体系如下：First-st and c DNA Reac t ionc DNA reac t ion dNTPsMgCl2 25mMReverse Transc ript ion lOXBufFerupst ream primer(EXON-1 或 B-ACTIN-1)downst ream primer(EXON-2 或 B-ACTIN-2)Taq DNA PolymeraseNuc lease-Free Wat erTOTAL _20 Ul4.0 Ul8.0 ul2.0 ul2.0 ul 2.5uXul 100 ul_PCR扩增，反应条件如下：95c预变性5min；94 45se c,55 45se c,72 50se c,共 32 个循环；72 7min,4 8。5.PCR产物定量取RT-PCR产物10ul在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，然后用Bio-Rad 1000 凝胶成像密度仪扫描，计算C-sis与B-ac t in吸收峰面积比(C-sis/B-ac t in)。(五).第标记胸腺喀咤核甘(3H-TdR)试验：VSMC采用常规贴块法培养，实验方法主要参照参考文献久 通过a ac t in免疫细胞化学鉴定培养的血管平滑肌细胞（版图八）。1.兔颈动脉置于Han ks液中，剥去外膜结缔组织，沿纵轴剪开血管壁，反复清洗，将其剪成ImmXlmm组织块，种植于培养瓶。2.37,5%CC）2 孵箱孵育 24h。3.加入1微居里3H-TDR。继续孵育24h。4.磷酸盐缓冲液（pH7.2）冲洗3次。5.吸干称重。6.高氯酸和双氧水各0.5ml,在80温箱中温育60min消化。7.200ul培养物消化液+20ml闪烁液，室温孵育2h.8.液闪记数仪测定吧-TdR放射活性。9.计算每mg组织中3H-TdR的掺入量。（六）.PDGF-8免疫组织化学染色按照操作试剂盒（Hist ost ain尸/“sBulkKit）说明书操作，具体步骤如 下：1.石蜡切片，常规脱蜡至水。2.3%耳。2室温孵育5-10min,以去除内源性过氧化物酶。3.滴加试剂A（封闭用正常血清工作液），室温孵育10J5min,倾去，勿洗。4.每一个切片加2滴（lOOul）或足够量的一抗（PDGF-B单克隆抗 体），4过液。5.PBS冲洗，3分钟X3次。6.每一个切片加2滴（lOOul）或足够量的试剂B（生物素化二抗工 作液）完全覆盖整个组织切片，37C孵育10T5min。7.PBS 冲洗，3min X3 次。8.每一个切片加2滴（lOOul）或足够量的试剂C（辣根酶标记链霉 卵白素工作液）完全覆盖整个组织切片，37c孵育10T5min。9.PBS 冲洗，3min X3 次。910.按照浓缩型DAB试剂盒说明书配制DNA底物混合工作液，具体步 骤为：在1ml双蒸水（pH约7.0）中滴加1滴（约50ul）试剂A（浓缩型 缓冲液），充分混匀，然后将试剂B和试剂C各1滴加入其中，再次充分 混匀，制备成DAB底物混合工作液。11.将DAB底物工作液滴加于切片上，镜下观察显色结果，待阳性部 位出现特异性显色而背景无着色时，自来水冲洗，终止显色。12.复染、脱水、封片。13.结果判断：在光学显微镜高倍镜下，随机选取5个高倍视野，定 量测定血管内膜和中膜SMC细胞中PDGF-B阳性细胞数和VSMC细胞 总数，以二者的百分比表示PDGF-B阳性指数。PDGF-B阳性细胞特征为 细胞浆有棕黄色沉淀物，背景无颜色。（七）.PCNA免疫组织化学染色按照试剂盒操作说明书进行，具体步骤为：1.载玻片预处理：玻片浸入2%APES丙酮溶液30秒，纯丙酮涮洗，晾干备用。2.石蜡切片脱蜡至无水。3.3%为02室温孵育5-10min,以去除内源性过氧化物酶。4.PBS 冲洗,2min X3 次。5.抗原修复：切处浸入0.01M枸檬酸缓冲液中，电炉上加热至95-98,并持续l（M5min。室温冷却2030min,PBS冲洗。6,滴加试剂2（封闭用正常兔血清），室温孵育10J5min,倾去，勿 洗。7.滴加试剂3于切片上，46过液。8.PBS 冲洗*2min X3 次。9.滴力口试齐IJ 4,37孵育1015min。10.PBS 冲洗，2min X3 次。H.滴加试剂5,37孵育1045min.12.PBS 冲洗，2min X3 次。1013.在1ml双蒸水（pH约7.0）中依次滴加1滴（约50uI）试剂6A、试剂6B、试剂6C,充分混匀，制备成DAB底物混合工作液。14.将DAB底物工作液滴加于切片上，镜下观察显色结果，待阳性部 位出现特异性显色而背景无着色时，自来水冲洗，终止显色。15.复染、脱水、封片。16.结果判断：在光学显微镜高倍镜随机选取高倍视野，定量测定血 管内膜和中膜细胞中PCNA阳性细胞数和细胞总数，以二者的百分比表 示PCNA阳性指数。PCNA阳性细胞为细胞核内沉淀棕黄色颗粒，背景 无颜色。（A）.统计学处理数据以均数土标准差表示，Mic rosoft Exc el统计程序行单因素方差 分析及t检验，以PV0.05及PV0.01分别表示统计学差异显著和极为显 著。结 果一、组织病理学观察结果1.球囊损伤组：光学显微镜下血管内缘连续性中断，可见锯齿样改 变，内皮细胞间隙性脱落，内弹力膜间断，中膜可见少许裂隙，平滑肌细 胞着色数量明显增多，但偶见裂隙。2.超声处理组：内皮结构完整，内皮下内弹力膜连续无间断，中膜 着色均匀，血管截面未见各层结构破坏。二、定量RT-PCR测定C-sis原癌基因mRNA表达水平1.引物的设计与优化引物设计与分析结果显示，两对引物具有较为一致的PCR反应参数。试验结果显示，利用同一 PCR反应体系，可特异性地扩增目的基因C-sis 及内参照基因B-ac t in。EXON-1/2及A-ACTIN-1/2两引物对Tm值范围 为53.1-57.4C,波动范围在3-4C之间；GC%含量47.4-57.9%；引发效率11仅B-ACTIN-1为93%,其余均为100%；二级结构分析表明，仅B-ACTIN-1有可能形成二极结构，但其AG值-9.1 kc al/mol（图1.2）。2.定量RT-PCR最适循环参数及模板量的确定晔闭根据已有的文献报道，在动脉血管经球囊损伤后1周，C-sis表达量 最高2失明。因此，本研究选择球囊损伤组1周后的兔颈动脉血管，按照 定量RT-PCR技术方法参考文献。“力，确定了可对C-sis mRNA表达水平 进行定量分析的逆转录总RNA最适模板量及PCR最佳循环数分别为 12lOOOng和32个循环。2.1 PCR最适循环数选择循环数的正确选择是PCR技术成功与否的重要条件。只有当循环数 在合适的范围时，PCR产物才与循环数之间有较好的线性关系，对产物 进行定量才有意义。因此，在不同循环数与C-sis及ac t in表达量关系 的研究中，分别将PCR循环数设定为26、28、30、32、34、36,扩增产 物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（图1）,同时对各电泳条带扫描定量。实验 结果显示，C-sis与ac t in具有相似的RT-PCR扩增动力学，在循环数V 32时，PCR产物与循环数之间呈线性关系。因此，本研究最终选择的PCR 循环数为32。,U 52 Ul 2N 26图3.不同循环数对PCR产物的影响图注：电泳条带从左至右PCR循环数依次为（36、34、32、30、26、28）.电 泳条带扫描定量结果显示，当循环数34时，PCR产物与循环数之间呈线性关系。2.2 最适模板量的选择与循环数一样，模板量只有在一定范围内PCR产物与基因的表达量 才成正比，定量才有意义。分别取250、500、750、1000、1250 ng总RNA 进行RT-PCR,PCR产物各取10ul进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（图2）,并 扫描定量。实验结果表明，C-sis原癌基因mRNA与B-ac lin mRNA具有 相似的扩增动力学，在模板量VlOOOng时，PCR产物与模板量之间呈正 比。因此，最终选择的模板量为lOOOng总RNA。13HHMi 41 MM)2M图4.不同模板量对PCR产物的影响图注：电泳条带从左至右PCR模板量依次为（1250、1000、750、500,250ng）.电泳条带扫描定量结果显示，在模板量1000ng时，PCR产物与模板量之间呈正比。3.样品C-sis原癌基因mRNA表达水平检测结果根据己确定的定量RT-PCR最适循环参数及最适模板量，以lOOOng 总RNA模板量，32次循环数，分别从各试验组（正常对照组、试验对照 组、球囊损伤组、超声消融组）中进行RT-PCR,检测C-sis mRNA表 达水平，各试验组RT-PCR扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如图3.实验结果显示，球囊损伤组各反应时相点中，48h电泳条带亮度最弱，随 后，电泳条带亮度持续增强，在1周时亮度最强，而2周时电泳条带亮度 有所下降，但其亮度仍明显强于48h条带（图5）.电泳结果均为461bp 大小的单一条带，与设计一致。超声消融组、试验对照组分别有2例在1 周时可见亮度很弱的电泳条带，其余时相点均未见C-sis表达（图6）。各 实验动物组中，均成功扩增到大小为870bp的单一 B-ac t in扩增条带（图 5-6）.将RT-PCR扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳条带用Bio-Rad 1000凝胶 成像密度仪扫描各条带亮度。C-sis mRNA表达水平的确定，以C-sis光密 度与B-ac iin光密度的比值（C-sis/P-ac t in）表示（表】）实验结果 表明，C-sis原癌基因定量检测结果与目测电泳条带亮度一致，其表达水 平自球囊