ROS%28O_%282%29%5E%28-%29%29信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(9):1 3 2 5-1 3 3 5A c t a A g r i c u l t u r a e B o r e a l i-o c c i d e n t a l i s S i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 1h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 1 R O S(O-2)信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理收稿日期:2 0 2 2-0 5-0 4 修回日期:2 0 2 2-0 6-0 7基金项目:庆阳市创新基地和人才计划(QY 2 0 2 1 B-F 0 0 3);陇东学院博士基金(9 0 1 1 1 0 0 5 0 3 1 1);教育部产学合作协同育人项目(2 0 2 1 0 2 0 2 2 0 8 0);陇东学院创新创业项目(2 0 2 2 1 1 3 6,2 0 2 2 1 1 4 4);国家自然科学基金(3 1 9 6 0 4 4 1)。第一作者:祁伟亮,男,博士,副教授,研究方向为作物遗传育种。E-m a i l:6 1 9 6 0 5 2 8 4q q.c o m 祁伟亮1,2,3,孟建军1,2,3,张 成1,2,3,刘自成1,2,3,施万喜1,2,3,杨 虓1,2,3,乔 岩1,2,3,杨财容4,乔义林1,李金玲1,陈思伟1,姚来来1,赖守孝1,张 鹏1,刘文辉1,王 婧1,袁兰兰1(1.陇东学院 农林科技学院,甘肃庆阳 7 4 5 0 0 0;2.陇东旱地作物种质改良及产业化协同创新中心,甘肃庆阳 7 4 5 0 0 0;3.甘肃省旱地冬小麦种质创新与应用工程研究中心,甘肃庆阳 7 4 5 0 0 0;4.成都师范学院 化学与生命科学学院,特色园艺生物资源开发与利用四川省高校重点实验室,成都 6 1 1 1 3 0)摘 要 以冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 为材料,采用荧光原位杂交(F I S H)技术以p S c 1 1 9.2和p T a 5 3 5为探针,明确4份冬小麦均属于六倍体材料(AA B B D D,2 n=4 2)。同时对冬小麦进行正常处理(2 5)、冷胁迫(4)和D P I+冷胁迫(4)处理并创新结合N B T法进行R O S定位。研究发现冬小麦在正常发芽过程中根尖顶端组织细胞和根毛区域检测到少量的R O S(O-2),推测少量的R O S(O-2)在冬小麦种子发芽及根系形成过程起到重要的调控作用。而在冷胁迫(4)处理环境下,陇育5号和 陇育5-2(品系)的长势显著优于 陇育8号 和 陇育1 0号,且冬小麦根系组织细胞区域发生R O S“大爆发”,其中在根尖顶端组织区域R O S信号最多,而在伸长组织区域R O S信号逐渐减少,推测R O S信号可能是一种动态传递的信号分子。同时还发现冬小麦维管束组织区域R O S信号积累较多,这也进一步暗示维管束组织可能是R O S信号产生和传导的主要通道。在D P I+冷胁迫(4)处理后,冬小麦根系组织细胞中的R O S信号明显减少,且以根伸长区和维管束组织细胞R O S消失最为明显,进一步说明NA D P H酶是冬小麦在冷胁迫后R O S信号产生的主要来源途径。关键词 冬小麦;活性氧;信号传导;冷胁迫 普通小麦(T r i t i c u m a e s t i v u m L.,2 n=6;x=4 2,AA B B D D)属于禾本科(G r a m i n e a e)小麦族(T r i t i c e a e)小麦属(T r i t i c u m L.)植物,是世界上重要的粮食作物之一1。因全球气候变暖,局部地区极易发生大面积、持久性或短时间内的极端天气(如冬季极端严寒),这对小麦的生长发育、产量和品质造成严重影响2。因此强抗寒冬小麦品种选育及抗寒机理研究成为育种工作者的重要任务。据报道,冷胁迫会诱导小麦体内产生较多的活性氧(r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S)3。以往研究认为R O S的产生对细胞有很强的毒害作用,但随着对R O S信号机理的深入研究,发现R O S在调控种子发芽、根毛、幼苗生长和植物逆境胁迫响应等方面起着至关重要的作用4。R a j a等5认为,植物体内产生的R O S会以波的形式向远端组织移动(距离起始点58 c m)并激活邻近和远端细胞的耐受机制。K r a n n e r等6以豌豆种子为材料,发现种子在吸涨的初始阶段会产生少量R O S(O-2),且发芽阶段胚根的生长与R O S(O-2)显著积累相关,以上研究说明R O S(O-2)是种子吸胀和发芽过程中的早期事件7。L i u等8发现若马铃薯块茎细胞中的R O S(O-2)水平被抑制时,会导致块茎发芽延迟等现象,这进一步说明少量的R O S(O-2)在植物生长发育过程中扮演者重要的角色。大量研究认植物体内产生的R O S与NA D P H氧化酶等有着直接联系9-1 0,对于该观点 研 究 者 采 用 二 苯 基 氯 化 碘 盐(D P I)作 为N D A P H酶的专一抑制剂,处理拟南芥1 1、冬油菜1 2和水 稻1 3等 植 物,研 究 发 现D P I处 理 后NA D P H酶的活性降低且R O S积累也显著减少,这也进一步说明NA D P H酶在R O S产生过程中起到重要作用。目前,针对在小麦冷胁迫环境下的R O S产生和抗氧化酶机制做了大量研究,但就冬小麦正常环境下及冷胁迫处理后R O S(O-2)在细胞中的信号产生及传导机理的研究相对较少。因此本研究以冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 为材料,创新结合N B T法从细胞角度进行R O S(O-2)的细胞定位,旨在阐明R O S(O-2)在冬小麦中的产生、信号传递规律等一系列重要问题,这对冬小麦抗寒育种及抗寒信号传导研究具有重要意义。1 材料与方法1.1 试验材料材料有品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2,源于陇东学院小麦研究所。1.2 试验方法1.2.1 冬小麦遗传背景分析 为进一步明确冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2 的遗传背景,染色体制片按照Q i等1 4的方法进行。首先将制备好的片子进行荧光原位杂交(F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n,F I S H)分析,选用探针p S c 1 1 9.2(绿色)和p T a 5 3 5(红色)检测冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2 的A、B、D染色体组。探针p S c 1 1 9.2主要区分小麦B基因组,探针p T a 5 3 5主要识别小麦A、B、D基因组1 5。探针p S c 1 1 9.2和p T a 5 3 5由上海英骏生物技术有限公司合成,杂交程序参照F u等1 6和Q i等1 4的方法配置1 0 L杂交液体系:p S c 1 1 9.2(0.3 L)+p T a 5 3 5(0.3 L)+9.4 L(2 S S C和 1T E)缓冲液瞬时离心混合。每张载玻片上滴加1 0 L探针工作液,置于3 7 恒温水浴锅中杂交2 h,杂交完后用2S S C溶液清洗,晾干后向每张载玻片上滴加1 0 L D A P I复染液,黑暗环境下放置1 0 m i n后,然后用荧光显微镜(O l y m-p u s B X-5 1)采集照片。1.2.2 R O S信号组织检测 挑选籽粒饱满的冬小麦种子,清洗干净、吸干、低温(4)春化1 2 h,以打破种子休眠。将冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2 分别进行正常处理(2 5)、D P I+正常处理(2 5)、冷胁迫 (4)和D P I+冷胁迫(4)抑制处理。正常处理(2 5)和D P I+正常处理(2 5):将冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及 品 系 陇 育5-2 在 正 常 处 理(2 5)和 D P I+正常处理(2 5)条件下培养2 d,培养条件为昼夜温度(2 5),光/暗周期(1 4 h/1 0 h),光照度(6 0 0 0 l x)。因D P I+正常处理(2 5)后种子未发芽,对正常处理(2 5)1 d和2 d的材料进行R O S组织染色,染色方法参照 K u m a r等1 7的方法,首先将氯化硝基四氮唑蓝(N B T)1%溶液倒入培养瓶,淹没种子并避光侵染8 h。其后将材料浸泡在无水乙醇中。最后用甘油浸制并固定试验材料并在正置荧光显微镜(B A 4 1 0 E)下拍照。D P I(3 1 7.9 2 m o l/L)称取1 0 m g二苯基氯化碘盐,以少许二甲亚砜溶解,用5 0 mm o l/L磷酸缓冲液(p H 7.8)定容至1 0 0 m L。冷胁迫(4)处理和D P I+冷胁迫(4)抑制处理:为了明确冷胁迫处理后,冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2 在冷胁迫(4)环境下的发芽率、根系和芽的生长情况及R O S信号在冬小麦组织细胞中的产生规律。首先将冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇 育1 0号 及 品 系 陇 育5-2 在 冷 胁 迫 (4)条 件 下 培 养7 d,培 养 条 件 为 昼 夜 温 度 (4),光/暗周期(1 4 h/1 0 h),光照度(6 0 0 0 l x)。然后分别对培养7 d的材料进行发芽率、根长和芽长测定,发芽率=种子发芽数/供试种子数1 0 0%。再根据发芽情况,选择冷胁迫环境下长势较好的 陇育5号 陇育8号 及品系 陇育5-2,进行冷胁迫(4)处理和D P I+冷胁迫(4)抑制处理(处理2 4 h)。再分别对处理后的材料进行N B T染色和无水乙醇脱色后制作装片,通过显微镜进行细胞观察,以定性检测R O S(O-2)在细胞中的变化规律。2 结果与分析2.1 冬小麦遗传背景及种子发芽情况分析为进一步明确冬小麦品种 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 及品系 陇育5-2 的遗传背景,以p S c 1 1 9.2和p T a 5 3 5为探针进行遗传背景分析,结果表明:陇育5号(图1-a)、陇育5-2(图1-b)、陇育8号(图1-c)和 陇育1 0号(图1-d)等材料均属于六倍体材料(2 n=4 2),染色体组成6231西 北 农 业 学 报3 2卷为AA B B D D基因组。在正常(2 5)环境下 陇育5号 陇育5-2 陇育8号 和 陇育1 0号 的发芽率无显著差异(P0.0 5)且发芽率均在9 5%以上,这说明供试材料的种子生长活力较好。在4 冷胁迫环境下培养7 d后,陇育5号 陇育5-2 陇育8号 和 陇 育1 0号 种 子 的 发 芽 率 分 别 为9 1.7 1%、9 0.6 3%、7 2.4 5%和6 2.7 8%(表1),且 冷 胁 迫 (4)环境下品系 陇育5-2 和 陇育5号 的长势显著好于 陇育8号 和 陇育1 0号(图2),其中 陇育5号 的芽长为2.1 5 c m,显著长于品系 陇育5-2,但品系 陇育5-2 的根长为3.8 1 c m,显著长于 陇育5号(表1),这说明 陇育5-2 和 陇育5号 在冷胁迫环境下的适应能力存在差异性。以p S c 1 1 9.2(绿色)和p T a 5 3 5(红色)为探针对 陇育5号(a)、陇育5-2(b)、陇育8号(c)和 陇育1 0号(d)进行鉴定p S c 1 1 9.2(g r e e n)a n d p T a 5 3 5(r e d)w e r e u s e d a s p r o b e s f o r c y t o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f L o n g y u 5(a),L o n g y u 5-2(b),L o n g y u 8(c)a n d L o n g y u 1 0(d)图1 基于F I S H技术对参试品种的细胞学鉴定F i g.1 C y t o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f t e s t e d c u l t i v a r s b a s e d o n F I S H t e c h n i q u e表1 冷(4)胁迫处理后冬小麦发芽率及生长情况T a b l e 1 G e r m i n a t i o n r a t e a n d g r o w t h o f w i n t e r w h e a t u n d e r c o l d(4)s t r e s s品种V a r i e t y发芽率/%G e r m i n a t i o n r a t e正常处理N o r m a l t r e a t m e n t4 冷胁迫C o l d s t r e s s(4)芽长/c m L e n g t h o f b u d正常处理N o r m a l t r e a t m e n t4 冷胁迫C o l d s t r e s s(4)根长/c m L e n g t h o f r o o t正常处理N o r m a l t r e a t m e n t4 冷胁迫C o l d s t r e s s(4)陇育5号 L o n g y u 59 5.6 01.7 8 a b 9 1.7 12.3 4 a8.5 61.2 3 a2.1 50.3 6 a1 2.5 61.7 5 a3.1 60.2 4 b陇育5-2 L o n g y u 5-29 6.7 81.2 3 a9 0.6 32.0 5 a8.2 40.9 8 a b1.4 30.1 6 b1 1.9 81.6 9 b3.8 10.1 2 a陇育8号 L o n g y u 89 5.7 11.0 9 a b 7 2.4 52.5 6 b7.9 81.5 9 a b 0.5 60.0 8 c 1 1.6 51.8 7 b2.4 70.3 6 c 陇育1 0号 L o n g y u 1 09 5.7 31.5 6 a b 6 2.7 81.8 9 c7.4 32.1 2 a b0.2 30.0 6 d1 1.7 81.1 3 b0.3 40.0 8 d注:数据为平均值标准差,不同字母表示差异显著(P0.0 5)。N o t e:S t a t i s t i c a l d a t a e x p r e s s e d a s m e a n S D,d i f f e r e n t l e t t e r s w i t h i n t h e s a m e c o l u m n i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P0.0 5).2.2 正常环境下R O S(O-2)在冬小麦组织细胞中的分布规律有报道称,R O S的产生是种子发芽的早期事件,本研究发现 陇育5号(图3-a)、陇育5-2(图3-d)、陇育8号(图3-g)和 陇育1 0号(图3-j)在正常环境下培养1d 时,种子均长出胚72319期祁伟亮等:R O S(O-2)信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理 冬小麦 陇育5号(a)、陇育5-2(b)、陇育8号(c)和 陇育1 0号(d)T h e w i n t e r w h e a t o f L o n g y u 5(a),L o n g y u 5-2(b),L o n g y u 8(c)a n d L o n g y u 1 0(d)图2 冷胁迫(4)处理7 d后各参试材料的生长情况F i g.2 G r o w t h o f e a c h t e s t e d m a t e r i a l a f t e r 7 d a y s o f c o l d s t r e s s(4)芽且在胚顶端检测到R O S(O-2)信号。培养2 d时 陇育5号(图3-b)、陇育5-2(图3-e)、陇育8号(图3-h)和 陇育1 0号(图3-k)均长出根系,且R O S(O-2)主要分布在根的顶端分生组织区域。同时对N B T染色后的根系进行显微结构观察,结果表明冬小麦 陇育5号(图4-a,4-b)、陇育5-2(图4-d,4-e)、陇育8号(图4-f,4-g)和 陇育1 0号(图4-i,4-k)的根尖顶端积累的R O S(O-2)最多,且在根毛区域(图4-c,4-e,4-h,4-l)也检测到少量的R O S(O-2)。有报道称,外施D P I会抑制NA D P H酶的活性并减少R O S的积累,进而影响种子发芽和根系的生长1 8,本研究结果表明在D P I+正常处理(2 5)冬小麦 陇育5号(图3-c)、陇育5-2(图3-f)、陇育8号(图3-i)和 陇育1 0号(图3-l)2 d后,种子发芽情况 显 著 受 到 抑 制。综 上 研 究 进 一 步 说 明R O S(O-2)的产生是冬小麦种子发芽的早期事件。2.2 冷胁迫环境下,R O S(O-2)在冬小麦组织细胞中的分布规律大量研究表明,NA D P H酶是R O S产生的主要来源途径之一。为了证实该观点,本研究分别对 陇育5号 陇育5-2 和 陇育8号 进行冷胁迫(4)和D P I+冷胁迫(4),并通过N B T染色进行R O S(O-2)定性试验。结果表明冷胁迫 (4)处理后,冬小麦 陇育5号(图5-a,5-g)、陇育5-2(图5-b,5-h)和 陇育8号(图5-c,5-i)的根系组织细胞积累了大量的R O S(O-2)。根系R O S(O-2)的产生规律为:根尖顶端组织区域R O S(O-2)信号最多,而在伸长组织区域R O S(O-2)信号逐渐减少,该研究结果说明R O S信号可能是一种动态传递的信号分子。本研究也发现 陇育5号 陇育5-2 陇育8号 的维管束组织区域R O S(O-2)信号积累较多,推测在冷胁迫环境下冬小麦维管束组织可能是R O S信号产生和传递的主要通道。而在D P I+冷胁迫(4)处理后,冬小麦 陇育5号(图5-d,5-j)、陇育5-2(图5-e,5-k)和 陇育8号(图5-f,5-l)的根系组织细胞中的R O S(O-2)信号明显减少,且以根伸长区和维管束组织细胞R O S(O-2)消失最为明显,这也进一步说明NA D P H酶是冬小麦在冷胁迫后R O S信号产生的主要来源途径。显微镜观察结果表明:冷胁迫(4)处理冬小麦 陇 育5号(图6-a6-e)、陇 育5-2 (图6-f 6-j)和 陇育8号(图6-k6-o)后,R O S(O-2)的 积 累 规 律 为 根 尖 顶 端 组 织 细 胞R O S(O-2)积累较多,根毛组织细胞中也检测到大量的8231西 北 农 业 学 报3 2卷 冬小麦 陇育5号(a,b,c)、陇育5-2(d,e,f)、陇育8号(g,h,i)和 陇育1 0号(j,k,l)在正常环境下(2 5)培养1 d(a,d,g,j)和2 d(b,e,h,k)时,并采用N B T对冬小麦进行染色,蓝色聚合物沉淀代表R O S(O-2)在植株体内的富集程度。在正常环境下 (2 5)D P I处理冬小麦 陇育5号(c)、品系 陇育5-2(f)、陇育8号(i)和 陇育1 0号(l)2 dW i n t e r w h e a t L o n g y u 5(a,b,c),L o n g y u 5-2(d,e,f),L o n g y u 8(g,h,i)a n d L o n g y u 1 0(j,k,l)w e r e c u l t u r e d f o r 1 d a y(a,d,g,j)a n d 2 d a y s(b,e,h,k)u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s(2 5).D i s t r i b u t i o n o f R O S(O-2)i n t h e w h e a t w e r e s t a i n e d w i t h n i t r o b l u e t e t-r a z o l i u m,w h i c h i s w i d e l y u s e d a s a n i n d i c a t o r o f R O S(O-2)l e v e l s.U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s(2 5),w i n t e r w h e a t L o n g y u 5(c),l i n e L o n g y u 5-2(f),L o n g y u 8(i)a n d L o n g y u 1 0(l)2 d w e r e t r e a t e d b y D P I图3 正常环境下R O S(O-2)在冬小麦组织细胞中的分布F i g.3 D i s t r i b u t i o n o f R O S(O-2)i n w i n t e r w h e a t t i s s u e s a n d c e l l s u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s冬小麦 陇育5号(a,b,c)、陇育5-2(d,e)、陇育8号(f,g,h)和 陇育1 0号(i,k,l)T h e w i n t e r w h e a t o f L o n g y u 5(a,b,c),L o n g y u 5-2(d,e),L o n g y u 8(f,g,h)a n d L o n g y u 1 0(i,k,l)图4 正常温度(2 5)处理后用显微镜观察R O S(O-2)在冬小麦根系组织细胞中的分布F i g.4 A f t e r n o r m a l c o n d i t i o n s(2 5),d i s t r i b u t i o n o f R O S(O-2)i n r o o t t i s s u e s o f w i n t e r w h e a t w e r e o b s e r v e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p e92319期祁伟亮等:R O S(O-2)信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理 对冷(4)胁迫处理(a,b,c,g,h,i)和冷(4)胁迫+D P I处理(d,e,f,j,k,l)后的冬小麦幼苗进行N B T染色,陇育5号(a,d,g,j)、陇育5-2(b,e,h,k)、陇育8号(c,f,i,l)U n d e r c o l d(4)s t r e s s(a,b,c,g,h,i)a n d c o l d(4)s t r e s s+D P I t r e a t m e n t(d,e,f,j,k,l),t h e w i n t e r w h e a t L o n g y u 5(a,d,g,j),L o n g y u 5-2(b,e,h,k),L o n g y u 8(c,f,i,l)p l a n t w e r e s t a i n e d w i t h n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m 图5 冷(4)胁迫处理和冷(4)胁迫+D P I处理后R O S(O-2)在冬小麦根系组织细胞中的分布F i g.5 D i s t r i b u t i o n o f R O S(O-2)i n w i n t e r w h e a t t i s s u e s a n d c e l l s u n d e r c o l d s t r e s s a n d c o l d s t r e s s+D P I t r e a t m e n t 对冷(4)胁迫处理(a-o)和冷(4)胁迫+D P I处理(A-O)后的冬小麦 陇育5号(a,b,c,d,e,A,B,C,D,E)、陇育5-2(f,g,h,i,j,F,G,H,I)、陇育8号(k,l,m,n,o,K,L,M,N,O)幼苗进行N B T染色 U n d e r c o l d(4)s t r e s s(a-o)a n d c o l d(4)s t r e s s+D P I t r e a t m e n t(A-O),t h e w i n t e r w h e a t L o n g y u 5(a,b,c,d,e,A,B,C,D,E),L o n g y u 5-2(f,g,h,i,j,F,G,H,I),L o n g y u 8(k,l,m,n,o,K,L,M,N,O)p l a n t w e r e s t a i n e d w i t h n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m图6 通过电子显微镜观察冷(4)胁迫处理和冷(4)胁迫+D P I处理后R O S(O-2)在冬小麦根系组织细胞中的分布F i g.6 D i s t r i b u t i o n o f R O S(O-2)i n r o o t t i s s u e s a n d c e l l s o f w i n t e r w h e a t u n d e r c o l d(4)s t r e s s a n d c o l d(4)s t r e s s+D P I w a s o b s e r v e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p e 0331西 北 农 业 学 报3 2卷R O S(O-2)信号;维管束组织 细 胞 产 生 的R O S(O-2)信号显著多于皮层组织细胞,且在维管束组织的螺纹导管区域检也测到R O S(O-2)信号。在D P I+冷胁迫(4)处理冬小麦 陇育5号(图6-A6-E)、陇育5-2(图6-F6-I)和 陇育8号(图6-K6-O)后,研究发现根系组织细胞中的R O S(O-2)信号积累减少且质膜区域和根毛区域的R O S(O-2)信 号明显消失,这也进一步 说明NA D P H介导产生的R O S在冬小麦冷胁迫信号传导过程中扮演着重要的角色。3 讨 论冬小麦是甘肃主要粮食作物,面积和产量均居全省口粮作物之首,其中旱地小麦约占 7 5%。而陇东作为甘肃冬小麦的主产区,因冬季严寒干旱、春季降水少,春旱和小麦生育后期高温等环境因素影响,导致冬小麦的越冬率、产量及品质等造成严重影响。因此选育强抗寒抗旱冬小麦品种,是促进甘肃冬小麦增产的有效的技术途径。目前在甘肃陇东等北部晚熟冬麦区生产推广的 陇育5号1 9、陇育1 0号2 0和 陇育8号2 1等品种具有较强的抗寒、抗旱性和丰产性,其中 陇育5号 成为北部冬麦区旱地甘肃陇东和宁夏固原的第一大品种,2 0 1 7年被全国农技中心确定为“华北、西北地区耐旱节水品种”。本研究通过F I S H技术分析,结果表明 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 等材料均属于六倍体材料(2 n=4 2)。在4 冷胁迫环境下培养7 d后,陇育5-2 和 陇育5号 的发芽率和长势显著好于 陇育1 0号 陇育8号,这说明 陇育5-2 和 陇育5号 在冷胁迫环境下具有较好的适应性。3.1 R O S(O-2)信号在冬小麦种子发芽过程中扮演着重要的角色大量研究表明豌豆6、马铃薯7、甘蓝型油菜2 2等植物种子发芽过程中均会检测到少量的R O S(O-2)信号,这说明R O S是植物生长和发育所必需的。研究认为R O S(O-2)能够氧化胚蛋白并提高蛋白质的羧基化作用,进而解除种子的休眠,达到促进种子发芽的效果2 3-2 4。本研究结果表明:陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 在正常环境下培养1 d时,种子胚芽顶端组织细胞检测到R O S(O-2)信号,这进一步说明R O S的产生对冬小麦种子发芽起到积极的调控作用。据报道,根尖组织细胞是R O S的产生部位,而R O S在调控根组织细胞的增殖与分化过程中扮演着重要的作用2 5-2 7。有研究发现,在拟南芥根毛生长过程中,R O S含量增加对改变根细胞壁的刚性和促进顶端细胞生长起到重要的作用。D u n a n d等2 8对拟南芥根尖的R O S(O-2)进行N B T组织定位研究,发现距根尖组织细胞R O S(O-2)信号积累最多,在伸长区组织细胞中R O S(O-2)较弱。本研究结果表明:陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 在正常环境下培养2 d时,根顶端组织细胞和根毛细胞区域检测到R O S(O-2)信号,该研究进一步支撑了前人的观点:R O S在根和根毛的生长发育过程中起到重要的作用。3.2 N A D P H酶介导产生的R O S在冬小麦细胞内及细胞间的信号传导机制大量研究证明,植物在胁迫环境下会产生大量的R O S,而质膜NA D P H氧化酶被认为是产生O-2 的主要来源机制2 9。如在小麦盐胁迫1 8、番茄3 0、牛皮杜鹃3 1和甘蓝型油菜2 2,3 2冷胁迫试验中,研究发现植物组织细胞中R O S的大量积累与NA D P H酶存在密切关系,而D P I抑制(NA D-P H酶专一抑制剂)处理之后,R O S的产生明显减少,这进一步说明N D A P H酶介导产生的R O S在逆境胁迫环境中发挥着重要作用。本研究发现,冷胁迫(4)处理冬小麦 陇育5号 陇育8号 和品系 陇育5-2 后,根系组织细胞中R O S(O-2)信号的积累明显增加。但在D P I处理后冬小麦根系组织细胞中R O S(O-2)的积累显著减少,显微镜观察结果证明:冬小麦细胞组织质膜区域R O S(O-2)信号消失明显,该结果说明冬小麦在冷胁迫环境下NA D P H酶是产生R O S(O-2)的主要来源途径,这与前人的研究观点一致。前人通过拟南芥RHD 2突变体研究发现,突变体植株R O S(O-2)产生减少、根发育不良、根毛变短4,而绿豆幼苗和黄瓜苗3 3D P I抑制试验后,不定根形成受到影响,说明NA D P H酶介导产生的R O S在调控根毛生长过程中起到重要的调控作用。本研究发现,正常生长环境下冬小麦 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 的根毛组织细胞中均检测到R O S(O-2),而在D P I处理冬小麦种子2 d后,冬小麦 陇育5号 陇育8号 陇育1 0号 和品系 陇育5-2 发芽受到抑制,说明种子发芽过程中产生的R O S可能与NA D P H酶有着直接的联系。相比较正常13319期祁伟亮等:R O S(O-2)信号在冬小麦根系细胞中的产生及传导机理处理,冷胁迫处理后冬小麦 陇育5号 陇育8号 和品系 陇育5-2 根毛组织细胞中的R O S(O-2)信号积累较多,而D P I处理后冬小麦根毛组织细胞中的R O S(O-2)信号明显消失,该结果进一步证实F o r e m a n等1 1的观点,NA D P H酶产生的R O S是调控根毛生长发育的主要来源途径。M i t t l e r 等3 4也提出NA D P H酶是细胞间系统信号快速启动关键信号元件之一,如植物在受到外来信号刺激后,导致C a2+内流,而C a2+又会与NA D P H酶上N 端的 E F 臂上C a2+位点结合,诱导 NA D P H 氧化酶构象变化,进而产生较多R O S,形 成R O S波 又 将 信 号 传 递 至“友 邻 细胞”2 2。本研究已通过D P I+冷胁迫试验证明,冬小麦在冷胁迫环境后根系组织细胞中R O S的积累与NA D P H酶有着密切联系,冬小麦根系组织细胞中出现根系尖端多、远端组织细胞少的现象,进一步肯定了前人的研究观点:R O S信号传递是一个动态过程,最后实现细胞内不同细胞器以及细胞之间的信号传递3 4。综上说明NA D-P H氧化酶在冬小麦形成R O S波的过程中起到关键作用。最新研究表明,在维管束内还可以完成氧化还原反应信使的合成、信号放大和系统转运3 5,如小麦在缺氮3 6、杨树干旱胁迫3 7和甘蓝型油菜2 2冷胁迫处理后,在维管束组织细胞中会检测到R O S信号。本研究结果表明,冷胁迫导致冬小麦 陇育5号 陇育8号 和品系 陇育5-2的根维管束组织细胞中积累大量O-2,该证据进一步加强了G a u p e l s等3 5、X u a n等3 8和代宇佳等3 9的观点,维管束内可以完成氧化还原反应信使的合成、信号放大和系统转运,使植物能够快速响应S AA并适应环境,提高全植株的抗逆性4 0。祁伟亮等2 2通过R O S亚细胞定位实验,研究发现冷胁迫后甘蓝型油菜的梯形导管处检测到大量的O-2,本研究在冬小麦根维管束的螺纹导管区域也检测到R O S信号,这也暗示导管细胞是冬小麦的维管束组织进行R O S信号长距离运输的高速通道。参考文献 R e f e r e n c e:1 何中虎,夏先春,陈新民,等.中国小麦育种进展与展望J.作物学报,2 0 1 1,3 7(2):2 0 2-2 1 5.HE Z H H,X I A X CH,C HE N X M,e t a l.P r o g r e s s o f w h e a t b r e e d i n g i n C h i n a a n d t h e f u t u r e p e r s p e c t i v eJ.A c t a A g r i c u l t u r a l S i n i c a,2 0 1 1,3 7(2):2 0 2-2 1 5.2 T I AN J,J I A L,WAN G J,e t a l.T r e n d a n a l y s i s o f t e m p e r a-t u r e a n d p r e c i p i t a t i o n e x t r e m e s i n m a j o r g r a i n p r o d u c i n g a r-e a o f C h i n a:t r e n d s o f c l i m a t e e x t r e m e s i n m a j o r g r a i n p r o-d u c i n g a r e a o f C h i n aJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f C l i m a-t o l o g y,2 0 1 6,3 7(2):6 7 2-6 8 7.3 李卓夫,宋永超,陈 露,等.不同抗寒性小麦品种分蘖节低温抗氧化效应分析J.东北农业大学学报,2 0 1 7,4 8(7):1-9.L I Z H F,S ON G Y C H,C HE N L,e t a l.A n a l y s i s o f a n t i-o x-i d a n t e f f e c t s o f c r o w n s i n d i f f e r e n t f r e e z i n g t o l e r a n t w h e a t c u l t i v a r s u n d e r l o w t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t sJ.J o u r n a l o f N o r t h e a s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2 0 1 7,4 8(7):1-9.4 MA