1、-30-第3期2023年6月No.3June,2023GC-MS法测定溴地斯的明原料药中基因毒性杂质溴甲烷唐新茹1,2,丁倩倩1,2,金红兰1,黄晓光2,王 雪2,孙 雪2,杨 慧2(1.延边大学 药学院,吉林 延吉 136200;2.吉林省博大伟业药物研究有限公司,吉林 长春 130000)摘 要:采用气相色谱-质谱联用技术测定溴地斯的明原料药中溴甲烷的残留量,应用HP-1ms(30 m0.25 mm1.0 m)毛细管柱分离样品,设置起始柱温为40、载气为氦气、柱流量为1.0 mL/min,质谱检测方式为选择性离子检测(SIM),目标离子的m/z为94。结果表明,在此色谱条件下,溴甲烷与溴乙
2、烷及相邻杂质峰之间能较好分离,且空白溶剂、溴地斯的明不干扰检测;溴甲烷的线性关系在10.00100.00 ng/mL区域内表现良好(r=0.999);平均回收率为98.53%(相对标准偏差RSD=1.26%,n=9);检测限和定量限分别是1.50、3.00 ng/mL。由此可得结论,该测定方法专属性较好、灵敏度高,能用于溴地斯的明中溴甲烷的检测。关键词:溴地斯的明;溴甲烷;气相色谱-质谱联用法;基因毒性杂质溴地斯的明(Distigmine Bromide)的分子式为C22H32Br2N4O4,相对分子质量为576.32。溴地斯的明片中溴地斯的明的质量分数不低于95.00%且不超过标示量的105
3、.00%1。溴地斯的明是一种人工合成的可逆性胆碱酯酶抑制剂,属于氨基甲酸酯类,由Schmid于1950年首次合成。其化学结构由两个吡啶斯的明分子组成,由环氧亚甲基结构连接。在一些亚洲和欧洲国家,包括日本和德国,其主要临床适应症是重症肌无力2-3。然而,其在日本也被用于治疗青光眼和膀胱活动不足,特别是用于治疗下尿路功能障碍以及手术、脊髓损伤和糖尿病引起的神经源性膀胱活动不足,还可以有效治疗药物和前列腺增大所致的尿液排泄功能障碍4。溴甲烷(Bromomethane)又名甲基溴,是一种有机化合物,味甜,无色,可用在土壤中熏蒸杀虫5-6。其主要损伤人体的呼吸道,中毒患者的临床表现为头痛恶心、四肢无力、
4、头晕及走路不稳、言语不清及酒醉感,严重者会出现高热、意识模糊、癫痫甚至多种器官损伤7。溴甲烷的沸点是4.0,气体的穿透力很强,因为不易燃易爆,所以可用作灭火剂、冷冻剂及甲基化剂等5;基因毒性杂质能直接破坏DNA并引起突变、重组,能间接引起染色体断裂最终致癌变及致突变性的物质8-9;安全阈值很低,低浓度即可导致癌变。随着法律法规的逐渐完善,对基因毒性杂质的检测要求越来越严格,充分合理的基因毒性杂质研究决定了产品是否可以上市,这对企业的监管要求也更高10。因此,建立一种能对溴地斯的明中的溴甲烷残留量进行准确检测的方法是必要的。根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conf
5、erence on Harmonization,ICH)11M7指南确定溴甲烷的限度,因为未查询到溴甲烷的TD50数值,所以采用日安全剂量1.5 g进行计算。溴地斯的明的最大日剂量为20 mg,遗传毒性杂质溴甲烷的限度约为7510-6。鉴于对溴甲烷的严格控制要求,确定溴甲烷的限度为110-6。比较常见的原料药中基因毒性杂质检测方法有高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和气相色谱(Gaschromatography,GC)等,但溴地斯的明中的溴甲烷限度较低,常规的单一仪器检测方法灵敏度和专属性达不到要求。因此,本研究建立了气相色谱
6、-质谱联用法(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)对溴甲烷进行测定,且该检测方法经过方法学验证能准确、可靠地检测溴甲烷的含量,为溴地斯的明中其他基因毒性杂质的检测提供参考12-14。1 仪器与试剂1.1 试验仪器气相色谱-质谱联用仪(7010B-8890,Agilent公司);毛细管色谱柱(HP-1ms);电子天平(BT-125D型,Sartorius公司)。1.2 试验试剂乙醇(色谱纯,Eter nal公司);溴甲烷(批号:218061559,AccuStandard公司);溴乙烷(687432,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);
7、溴地斯的明(批号:220706、220712、220713,吉林省博大伟业制药有限公司)。作者简介:唐新茹(1998),女,吉林德惠人,硕士研究生;研究方向:药物分析。通信作者:金红兰(1987),女,吉林延吉人,副教授,博士研究生;研究方向:中药药理。现代盐化工Modern Salt and Chemical Industry-31-第3期2023年6月No.3June,20232 方法与结果2.1 GC-MS条件2.1.1 色谱条件采用规格为30 m 0.25 mm1.0 m的HP-1ms毛细管柱,载气为氦气,柱流量为 1 mL/min;进样口温度为200;顶空平衡温度为50,平衡时间为2
8、0 min;初始柱温为 40,维持3 min;以25/min升至290,维持5 min。2.1.2 质谱条件采用电离源EI,离子源温度为230,传输线温度为290,四级杆温度为150,电离电压为70 eV,碰撞器为氮气,溶剂延迟1 min,采集模式为选择性离子检测(Selected Ion Monitor,SIM),溴甲烷的采集离子为97,溴乙烷的采集离子为108。2.2 溶液配制2.2.1 对照品溶液的制备精确称取适量溴乙烷加乙醇稀释,制成每1.00 mL中约含溴乙烷1 mg的溶液,再精确量取适量溴乙烷加水稀释,制成每1.00 mL中约含溴乙烷100 ng的溶液,作为内标溶液;精确量取适量溴
9、甲烷对照品溶液,用内标溶液稀释,配制成每1.00 mL中约含50 ng溴甲烷的溶液,精确量取2.00 mL作为对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备精确称取适量溴地斯的明,加溴乙烷定位溶液溶解,再用溴乙烷定位溶液稀释至适当浓度,精确量取2.00 mL置于顶空瓶中作为供试品定位溶液。2.2.3 混标溶液的制备精确称取适量溴地斯的明,加溴乙烷定位溶液溶解并稀释至适当浓度,精确加入适量溴甲烷对照品,摇匀,精确量取2.00 mL作为混标溶液。2.3 方法学考察2.3.1 专属性考察分别精确量取配制好的供试品溶液2.00 mL、溴甲烷对照品溶液2.00 mL、溴乙烷对照品溶液2.00 mL、混标溶液2
10、.00 mL置于顶空瓶中,进样结果如图15所示。结果表明,在此色谱条件下,溴甲烷与溴乙烷及相邻杂质峰之间能较好地分离,且空白溶剂、溴地斯的明不干扰检测。2.3.2 检测限和定量限试验精确量取适量溴甲烷对照品溶液及溴乙图1空白溶剂水的GC-MS色谱图图2溴甲烷对照品溶液的GC-MS色谱图图3溴乙烷对照品溶液的GC-MS色谱图图4混标溶液的GC-MS色谱图图5供试品溶液的GC-MS色谱图现代盐化工 专论与综述-32-第3期2023年6月No.3June,2023表1溴甲烷回收率试验结果编号加入量/ng原有量/ng测得量/ng回收率/%平均回收率/%RSD/%50.00%-1125.00027.86
11、0152.70399.8798.531.2650.00%-2125.00027.868149.46097.2750.00%-3125.00027.896152.37799.58100.00%-1250.00027.899272.86197.98100.00%-2250.00027.926268.58996.27100.00%-3250.00027.869272.46197.84150.00%-1375.00027.838400.01599.25150.00%-2375.00027.906400.37799.33150.00%-3375.00027.937400.52199.36烷并称定,用水稀
12、释至不同浓度,按规定色谱条件进样,主成分信噪比约为10 1及3 1时的进样质量浓度分别为定量限及检测限。测定结果表明,溴甲烷的检测限为1.50 ng/mL、定量限为3.00 ng/mL,溴乙烷的检测限为5.04 ng/mL、定量限为10.08 ng/mL。2.3.3 线性关系考察精确量取适量溴甲烷对照品溶液,以内标溶液稀释成每1.00 mL中约含溴甲烷500 ng的溶液,作为线性储备液。精确量取线性储备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用内标溶液稀释并定容。分别精确量取上述溶液各2.00 mL置于顶空瓶中,密封,50 预热20 min,
13、顶空进样,记录结果。以质量浓度为横坐标,以溴甲烷与溴乙烷峰面积的比值为纵坐标,结果线性回归方程为:Y=0.023X0.098,相关系数r=0.999。所得结果表明当进样量为2.00 mL时,在10.00100.00 ng/mL范围内,质量浓度与峰面积比值呈良好的线性关系。2.3.4 精密度试验首先,精确量取适量溴甲烷对照品溶液,以内标溶液稀释成每1.00 mL中约含50 ng溴甲烷的溶液,作为精密度试验溶液。其次,精确量取2.00 mL置于顶空瓶中,按照设定的色谱条件连续测定6次,测得溴甲烷相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)为3.94%,溴乙烷RSD
14、为8.98%,峰面积比值RSD为6.03%,仪器精密度良好(n=6)。2.3.5 重复性试验取溴地斯的明约100 mg,精确称定,置于顶空瓶中,精确加入内标液2.00 mL,振摇使其溶解,密封,作为供试品溶液;另按精密度试验方法配制对照品溶液;顶空平衡温度为50,平衡时间为20 min,分别取对照品溶液和供试品溶液顶空进样测定,记录色谱图,连续测定6次,按内标法计算溴甲烷残留量。结果显示,6次测定溴甲烷的检出量RSD为5.86%,重复性良好。2.3.6 回收率试验精确称取供试品约250 mg置于5.00 mL容量瓶中,用内标液稀释“线性试验”项下的线性储备液0.25、0.50、0.75 mL各
15、3份,并定容,振摇使其溶解,作为低、中、高3种质量浓度的溶液(分别为限量质量浓度的50.00%、100.00%、150.00%)。另按上述方法制备对照品溶液,各精确量取2.00 mL,置于顶空瓶中,密封,50 预热 20 min,顶空进样测定,计算回收率。测定结果如表1所示。该结果表明,9份样品溴甲烷平均回收率为98.53%,RSD为1.26%,回收率符合要求。2.3.7 中间精密度试验按照重复性测定方法,由另一试验人员另取6份供试品溶液进行测定,合并计算12次测定结果。结果表明,12次测定溴甲烷的检出量RSD为5.30%,中间精密度良好。2.3.8 耐用性试验在柱流速和温度发生微小变化时,分
16、别精确量取对照品溶液和供试品溶液各2.00 mL,置于顶空瓶中,密封,50 预热20 min,顶空进样,记录色谱图,观察色谱条件发生的微小变化,溴甲烷的检出量在0.12%0.15%,影响不大,故耐用性良好。2.3.9 样品测定取3批溴地斯的明(220706/220712/220713)配成供试品溶液,按规定的色谱条件进样,3批样品中溴甲烷的质量分数分别为0.000 005%、0.000 004%、0.000 007%,表明3批样品中溴甲烷的残留量均符合标准。3 讨论3.1 监测离子的选择精确称取适量溴甲烷对照品溶液及溴乙烷,顶空进样并分析。采用SCAN全扫描模式在50150 amu质量扫描范围
17、内对溴甲烷、溴乙烷进行测定,所得质谱如图6、图7所示,定性分析确定溴甲烷的定量离子(m/z)为94,溴乙烷的定量离子(m/z)为108。现代盐化工 专论与综述-33-第3期2023年6月No.3June,20233.2 各参数条件的筛选毛细管柱的选择很重要,不同毛细管柱(VF-624ms、VF-WAXms)对溴甲烷的影响很大,会出现响应值低和空白溶剂存在干扰的情况。HP-1ms毛细管柱检测出的峰形较好,空白溶剂不干扰检测,专属性强,故采用此毛细管柱。在其他色谱条件的摸索过程中,首先采用的是不分流进样,发现色谱峰的响应值不符合要求,峰形不完整。若采用分流进样,当分流比为15 1时,溴甲烷和溴乙烷
18、能分离出来,且响应值正常,故采用分流进样。参考文献1 OBARA K,TANAKA Y.Effects of distigmine on the mechanical activity of urinary bladder smooth muscleJ.Biological&Pharmaceutical Bulletin,2019(7):1064-1068.图6溴甲烷的质谱图图7溴乙烷的质谱图2 OBARA K,CHINO D,TANAKA Y.Distigmine bromide produces sustained potentiation of guinea-pig urinary bl
19、adder motility by inhibiting cholinesterase activityJ.Biological&Pharmaceutical Bulletin,2017(6):807-814.3 OBARA K,CHINO D,TANAKA Y.Long-lasting inhibitory effects of distigmine on recombinant human acetylcholinesterase activityJ.Biological&Pharmaceutical Bulletin,2017(10):1739-1746.4 OBARA K,TANAKA
20、 Y.Sustainable effects of distigmine bromide on urinary bladder contractile functionJ.Pharmacology,2020(3/4):135-144.5 李斌,王锡臻.急性溴甲烷中毒性脑病的MRI诊断价值J.名医,2021(21):32-33.6 BALAGOPAL K,MUTHUSAMY K,ALEXANDER M,et al.Methyl bromide poisoning presenting as acute ataxiaJ.Neurol India,2011(5):768-769.7 UNCINI A
21、,BASCIANI M,DI MUZIO A,et al.Methyl bromide myoclonus:an electrophysiological s t u d y J.Ac t a Ne u r olog ic a Scandinavica,1990(2):159-164.8 王萍,徐彩虹,陈仙,等.原料药中基因毒性杂质控制的研究进展J.中国现代应用药学,2015(1):119-126.9 汪生,杭太俊.药物中基因毒性杂质检测策略的研究J.中国新药杂志,2019(23):2840-2846.10 谢含仪,林云良,张瑞凌,等.基因毒性杂质分析方法和前处理技术的研究进展J.药物分析杂志
22、,2018(10):1668-1676.11 ICH.M7(R1):assessment and control of DNA reactive(mutagenic)impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic riskEB/OL.(2020-11-12)2023-06-20.https:/www.fda.gov/media/85885/download.12 朱长友,罗文.GC-MS法测定塞来昔布中硫酸酯类基因毒性杂质J.海峡药学,2022(10):26-30.13 张芮腾,青旺旺,廖星星,等.药物中基因毒性杂质检测方法研究进展J.中国医院药学杂志,2021(3):327-332.14 万君玥,陈华,尹婕.化学药品中杂质的基因毒性评估策略以及相关分析方法研究进展J.药物分析杂志,2022(4):557-571.现代盐化工 专论与综述