补骨脂素治疗骨关节炎网络药理学预测及实验验证.pdf

书书书基金项目：国家自然科学基金项目（）补骨脂素靶向瘦素 通路调控骨关节炎软骨 软骨下骨交互作用及机制研究作者简介：王蔚陆（），男，硕士研究生在读，研究方向：网络药理学，：通信作者：梁丁龙（），男，本科，副主任医师，研究方向：脊柱相关疾病，软组织疼痛及神经损伤的康复与治疗，：；马彦旭（），男，本科，主任医师，研究方向：腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、老年腰椎骨关节病的康复与治疗，：中药研究补骨脂素治疗骨关节炎网络药理学预测及实验验证王蔚陆陈建新朱姜梁丁龙马彦旭（北京中医药大学中医学院，北京，；北京中医药大学厦门医院，厦门，；首都医科大学附属北京中医学院，北京，）摘要目的：网络药理学预测结合实验验证探讨补骨脂素（）治疗骨关节炎（）的抗炎机制。方法：检索 等药物数据库获取 的靶点，检索 等疾病数据库得到 的疾病基因。将 靶点与 交集的关键靶点提交至 平台，构建蛋白质 蛋白质相互作用（）网络，应用 插件对核心靶点进行通路分析，使用 工具进行生物富集分析。下载含补骨脂素化合物的草药和骨科疾病，补骨脂素的传统中医证候、现代医学症状和综合征以及骨关节炎疾病相关的传统中医证候、现代医学症状和综合征，将其取交集，绘制补骨脂素治疗骨关节炎化合物草药 症状体征图。构建疾病软骨 滑膜细胞共培养体系，将其随机分为补骨脂素低浓度组（）、补骨脂素中浓度组（）、补骨脂素高浓度组（）以及空白对照组（），采用定量 的方法，观测不同浓度下模型细胞 表达水平，验证预测结果。结果：得到 靶点 个，疾病基因位点 个，治疗 的靶点 个。网络共涉及 个节点，条边。生物富集分析结果显示化合物主要作用于含胶原蛋白的细胞外基质，能够改善关节炎性微环境中关节滑液 软骨交互作用、调节骨代谢，在白细胞介素 （）通路、破骨细胞分化通路等富集程度较高。数据库有含 的药物 条，相关的骨伤科疾病 条。和 的传统中医证候、现代医学症状和综合征取交集，得到 条传统中医证候和 条综合征，绘制出 个节点，条边的化合物 草药 症状体征图。实验结果显示，与空白对照组比较，补骨脂素低浓度组核因子 和 扩增倍数升高（均 ）；补骨脂素中浓度组肿瘤坏死因子、核因子 和 均下降（均 ）；补骨脂素高浓度组无显著差异。结论：通过检索文献和实验，对基因蛋白质相互作用进行整合和实验验证，在抑制 炎症反应，改善软骨与滑膜细胞交互作用上发挥了积极作用。关键词补骨脂素；骨关节炎；网络药理学；实验验证 ，（，；，；，）：（）（）：（），（），（，）（）（）：，世界中医药 年 月第 卷第 期 ，（），（）（）；（），（）；：；中图分类号：文献标识码：骨关节炎（，）是一种不由衰老引起，多受关节软骨生化改变与生物力学应力影响的退行性关节疾病。中医有“骨痹、膝痹、膝眼风”的相关记载。“骨痹”最早源于 黄帝内经素问长刺节论篇 ，现代中医对其病因病机有了更全面的认识，认为素体年迈、骨节亏虚、筋骨失养，外加风寒湿邪侵袭，终致气血不通，脉络痹阻 。补骨脂又名破故纸、胡韭子 。蔷薇目，豆科植物成熟果实，出自 雷公炮炙论。补骨脂素是补骨脂的主要成分，属于香豆素类化合物，能有效调控细胞因子，尤其是白细胞介素 （，）通路所介导的滑膜 软骨交互作用。由于 在紫外线灯的照射下可产生光毒反应，有光致敏史的患者、儿童及孕妇应慎用。本文结合李梢教授提出的药理学的研究方法和评价标准 ，以受体或靶点为药物活性的治疗关键，探讨化合物作用受体机制及特性表达。材料与方法 材料 细胞人原代 滑膜成纤维细胞（货号：，培养体系：原代细胞基础培养基 ，避光保存；原代细胞培养添加剂 ，避光保存；终浓度 胎牛血清 ，避光保存；青霉素 链霉素双抗混合液（，），避光保存），人原代 软骨细胞（货号：，培养体系：原代细胞基础培养基 ，避光保存；原代细胞培养添加剂 ，避光保存；终浓度 胎牛血清 ，避光保存；，避光保存），以上细胞购自上海瑾原生物科技有限公司，培养瓶放置在孵育箱中，细胞培养基于碳酸氢盐的缓冲体系，设置 气体环境，维持 ，温度。药物药物：补骨脂素（成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，批号：）。试剂与仪器 （，批号：）；（，批号：）；实时荧光定量 试剂盒（康为世纪，批号：）。凝胶电泳仪（，型号：）；凝胶成像仪（，型号：）；荧光定量 仪（，型号：）；小室（北京索莱宝生物科技，批号：）。方法 模型制备当原代培养细胞达到 以上融合时进行消化传代，将传至第 代的滑膜细胞（个 ）和软骨细胞（个 ），分别种于 小室的上室和下室，制备滑膜细胞和软骨细胞共培养体系，共培养 。分组与干预方法将软骨细胞 滑膜细胞体系随机分为补骨脂素低浓度组（）、补骨脂素中 浓 度 组（）、补 骨 脂 素 高 浓 度 组（）以及空白对照组（），共 组，干预 ，每组留取 小室下室软骨细胞的个样本进行指标检测。检测指标与方法依据网络药理学预测结果，选取 、肿瘤坏死因子 （，）和核因子 作为药物干预细胞共培养体系的观测对象，采用实时荧光定量 观察不同浓度补骨脂素对模型细胞中网络药理学预测相关信号通路关键分子 水平表达量的影响。网络药理学分析 补骨脂素靶点获取通过 （：）平台检索化合物靶点 ，中 ，药系统药理学数据库与分析平台（，：）以及文献补充化合物靶点信息，利用 （：）规范靶点名称。的基因获取分别向 （：）、在线人类孟德尔遗传数据库（，：）、（：）等数据库输入 ，获得疾病基因，参考 网络药理学评价方法指南 可靠性、规范性和合理性的定义，以相关性大小为依据筛选关键基因 。补骨脂素治疗疾病核心靶点蛋白质 蛋白质相互作用网络、生物富集分析和通路分析将 与 靶点取交集，得到化合物治疗疾病的位点。将关键靶点导入 （：）数据库，获取蛋白质 蛋白质相互作用（，）网络，使用 绘制模型，节点表示蛋白，线表示相互关系。节点越大，颜色越深越重要。线越粗，颜色越深，联系越紧密。使用 （：）平台，导入 个靶点，设置种属为人类，进行基因本体（，）富集分析，包含生物过程（，）、细胞组分（，）及分子功能（，），根据富集系数（）大小进行排序，保留排名靠前的结果；使用 插件 进行京都基因与基因组百科全书（，）通路分析，系数选中等，绘制 图。病症结合研究补骨脂素治疗作用首先下载补骨脂素化合物（）相关的草药（）、疾病（）、中医证候（，）、现代医学症状（，）和综合征（）板块；其中 内容较多，使用“炎、痛、骨、关节、脊、椎”为关键词筛选 相关疾病。然后下载 疾病相关的 、和 板块。最后将 和 二者对应的 、和 板块条目取交集，建构 和 之间的联系。确定核心 和 后，下载其对应的草药 ，用 软件绘制化合物 草药 症状体征图（）。黄 色 圆 形 节 点 表 示 ，粉色菱形节点表示 患者的 ，橘黄菱形节点表示 患者 ，中草药用蓝方形节点表示，其中深蓝方形节点代表核心中药。统计学方法采用 统计软件进行数据统计，采用单因素方差分析进行组间差异比较，以 为差异有统计学意义。结果 补骨脂素治疗 的靶点选取药物方面，涉及 个 靶点，结合 及文献报道补充靶点，共计 个。疾病方面，获得靶点 个，最后将 个 靶点与 个 靶点取交集，得到 个 精准治疗 的靶点。共有靶点 网络建构 治疗 靶点的 网络共涉及 个节点，条边，独立节点 未纳入网络，剩余 个节点按节点间联系次数由高到低排序，依次为 、和 ，其中 和 与炎症相关，且关系紧密。见图 。图 补骨脂素治疗骨关节炎 网络 共有靶点生物富集与通路分析 治疗 靶点生物过程显示细胞生物过程于骨和软骨的分化发育（）有关，细胞成分主要作用于介导免疫炎症发生发展的髓系白细胞（），通过调控类固醇激素合成（）的分子功能发挥抗炎作用。见图 。插件 富集出 个通路，主要包括破骨细胞分化通路（软骨下骨组织的异常改变），通路，信号通路以及催乳素通路。见图 。世界中医药 年 月第 卷第 期图 补骨脂素治疗 靶点生物过程、细胞成分与分子功能结果图图 补骨脂素治疗 靶点的通路富集分析 病症结合分析 共有 种含 的药物。见表。条 相关的骨伤科疾病。见表表 常见含有补骨脂素化合物的中草药功效分类编号药名化痰药 大皂角 前胡 紫花前胡补阴药 百合 北沙参 女贞子补阳药 骨碎补 淫羊藿补虚药 补骨脂 海马补气药 明党参 蜂蜜辛温解表药 白芷 防风祛风湿散寒药 独活清热燥湿药 白鲜皮清热解毒药 板蓝根利水渗湿药 地耳草理气药 玳玳花解毒杀虫燥湿止痒药 蛇床子未分类 硫黄。对应 条 ，条 ，常见词汇 和 ，条 。（按部位分为髋、膝、脊柱）对应 条 ，条 ，常见词汇 ，条 。二者取交集后得到 条 和 条 。见表 。表 补骨脂素有关的骨伤科疾病疾病序号疾病名称值 值 骨质疏松症 少关节型幼年特发性关节炎 ，关节炎，类风湿 ，关节炎，实验 骨肿瘤 椎间盘退变 大骨节病 ，脊髓炎，横向 ，骨质疏松症，绝经后 脊髓损伤 脊髓缺血 脊髓发育不良 脊柱疾病 尺骨骨折 注：为错误发现率（，）表 补骨脂素对症治疗综合征和中医证候模块序号名称综合征 风寒挟湿中医证候 便干 反胃 五更泄泻 腰脊疼痛 腰膝冷痛 少阴伏风头痛化合物 草药 症状体征图包含 个节点，条边。结果显示“风”“寒”挟“湿”杂合而为痹（骨关节炎），其中核心药物有骨碎补、蛇床子、独活和补骨脂。见图 。，图 补骨脂素治疗 化合物 草药 症状体征图 细胞实验结果与空白对照组比较，补骨脂素低浓度组 和核因子 的扩增倍数有所升高（均 ）；补骨脂素中浓度组 和 有所下降（均 ）；补骨脂素高浓度组差异无统计学意义（）。见图 。讨论 病症与中草药化合物补骨脂素又叫补骨脂内酯、制斑素，属呋喃香豆素类，近年研究显示其在骨伤科疾病方面有潜在应用价值。病症结合领域，中医认为补骨脂素主治的 属于风寒挟湿的痹症。首先，针对疼痛走注不定为特征的行痹，中医认为与“风”有关。风为百病之长，寒湿等常依附风侵犯人体，其中以风寒、风湿最为常见。内因为卫阳不固，腠理空虚。而以肢体骨节疼痛酸困、痛处不移的着痹，中医多认为与“湿”有关。外湿内湿，同气相求，常相互引动，病位主要在肢体、经络、关节。病久不 愈，内侵筋骨血脉，复感于邪，累及心肾。针对疼痛较甚，痛有定处，筋骨挛痛的寒痹，中医认为寒则凝塞，不通则痛，主张温经散寒，由于风寒湿痹与炎症疼痛密切相关，现代理论研究提出了津液不归正化，痰湿内蕴的学说，借助西医免疫炎症的具体机制，阐述中医痰湿致病的理论，使“无形之痰”更为直观，中医治法强调温化以去除水湿痰饮。证候学研究更是印证了二者的紧密联系，理法方药环环相扣，浑然天成。另外中医药有着鲜明的辨证论治色彩，东西方文化在证候改观和病因祛除的认知上存在差异，从祛除致病因素的角度，做好鉴别诊断至关重要，而从缓解症状角度出发，不同疾病有时可以存在相似的表征，所以中医又有异病同治的原则 。疾病与基因本节我们重点介绍上游的 通路相关基因。首先，属于一种重要的炎症介质 ，参与多种炎症反应及自身免疫性疾病的病理过程，下游介导核因子 等通路，与炎症关系明确。其次，可诱导滑膜细胞、巨噬细胞、软骨和骨细胞分泌 等因子，可能与受体结合，由巨噬细胞分泌，通过去磷酸化损害关节炎患者的调节性 细胞（，）能力。上述因子导致关节炎的骤然发作，通过 维持 细胞（，）的数量，形成正反馈，维持慢性炎症状态，刺激多种趋化因子（）产生，其中包括 家族和 家族，、和 、与 。以上因子将淋巴细胞、巨噬细胞与粒细胞招募到滑膜加重其炎症，骨与软骨大量损伤会导致关节内难逆性变形，通过诱导可降解胞外基质金属蛋白酶（，）参与此过程。破骨细胞通过碳酸酐酶酸化，帮助骨基质溶解成为水、钙离子和其他物质。质子泵以高浓度梯度泵送图 补骨脂素干预共培养体系 扩增倍数（）注：与空白对照组比较，世界中医药 年 月第 卷第 期氢离子，特化的液泡 酶能够释放多种水解酶，比如 和组织蛋白酶，以消解基质，尤其是软骨下骨基质的有机成分。其中 由破骨细胞表达，与骨微环境有关，是破骨细胞迁移所必需的一种强大明胶酶。破骨细胞分化受到其护骨因子（，）抑制，它由成骨细胞产生并与核因子 受体活化因子配体（，）结合，阻止与 的作用。基于以上机制，既可增强炎症，又能刺激破骨细胞分化导致骨与软骨的异常改变，如破骨细胞数量减少、骨硬化及其吸收减少 。此外 与 等协同放大其炎症效应，其中与 配合形成正反馈环路，加重局部反应，关节炎患者血清和关节液中 显著升高，是炎症反应和免疫偏移的重要调节因子，可促进 等炎症介质的分泌，破坏软骨稳态，促进滑膜浸润，与关节炎严重程度成正比 。不仅反映全身炎症状态，同时调控关节内局部炎性微环境。二者间的交互传递极有可能刺激下游靶向核因子 通路，而作为促分裂原活化的蛋白激酶（，）信号级联，其过度激活可加剧关节软骨结构及功能障碍与软骨下骨重塑异常 。最后 可通过环氧合酶 （，）诱导前列腺素扩血管作用，促进炎症细胞进入病变部位，吞噬免疫复合物，释放溶酶体，包括胶原酶和中性蛋白酶，破坏胶原弹力纤维，使滑膜表面及关节软骨损伤 。还可以诱导 表达，促使破骨细胞分化，是 家族成员，基因敲除小鼠可表现出骨硬化以及破骨细胞缺失的表型，通过 激活核因子 ，近年开发的 抑制剂（地舒单抗）在预防骨质疏松，抑制关节炎性病变上也显示出了良好前景 。另外部分基因从不同角度干预病程，乙酰胆碱酯酶（，）通过快速水解释放到突触间隙中的乙酰胆碱终止神经肌肉接头处的信号转导，从而调节免疫炎症反应 。单胺氧化酶（，）优先氧化生物胺，其代谢（合成、储存、释放和灭活）异常是导致疼痛的主要原因。超氧化物歧化酶（，）可使组织免受活性氧中间体毒害，中氧化应激可致滑膜炎症和局部关节内病变 。最后我们尝试解释男女性别分布差异原因，高雌激素水平所致疾病的女性，及肥胖、药物等因素所致男性雌化的患者，临床症状更严重。通过对 患者临床特点及中医证型分布流行病学调查研究发现，无论何种中医证型，一般女性多于男性，提示雌激素在 病理进程中发挥作用 ，。不同性别患者在疼痛、滑膜炎症、骨赘形成、软骨退变以及软骨下骨硬化方面存在差异。澳大利亚一项研究显示女性患者软骨损失率更高，差异在 岁时显现，并随年龄增长越发明显 。动物研究表明雌性大鼠比雄性滑膜炎症、软骨破坏和软骨下骨质退化表现更严重，对刺激更敏感，滑膜周围巨噬细胞浸润更广泛，这是女性疼痛程度更高的原因 。与男性 软骨细胞相比，女性 细胞雌激素受体表达较高，相关白细胞介素 水平更高 。研究显示 与雌激素受体结合，具有植物类雌激素样作用，发挥抗炎作用，该效应可被雌激素受体抑制剂逆转 。但是考虑疾病在性别分布上的差异，参考类固醇激素代谢及负反馈调节，我们提出了 可能存在类雌激素样的作用，而非雌激素本身的假设，同时我们猜想 的类雌激素样作用，与雌激素本身存在明显不同，它可与雌激素竞争受体，同时加速了雌激素向糖皮质激素方向转化，发挥抗炎作用。实验研究也显示中等浓度补骨脂素的确有效降低 患者软骨 滑膜细胞共培养体系 和 的水平。疾病与通路骨细胞和破骨细胞的综合作用在维持 患者软骨下骨量方面发挥重要作用。从骨软骨交界处形成“骨 软骨 钙化软骨”的三明治结构可以发现骨质硬化、纤维化与疏松并存，提示骨代谢异常，双向软骨病理性钙化始于软骨表面纤维化区域，有研究发现补骨脂素可以增加骨密度，用于治疗骨质疏松和 软骨下骨组织流失，同时抑制软骨病理性钙化，以维持正常骨组织生理结构，体现了药物干预后机体的自我调节能力增强。通路富集还显示催乳素途径和利什曼病较显著，二者分别对应类风湿性关节炎和原虫性关节炎；脾肾阳虚的溃疡性结肠炎患者，常出现五更泄泻，四神丸是治疗本病的经典方剂，但是与 关系不紧密，并非研究重点。本节着重将其和 炎症通路关联进行分析。再吸收的骨表面可发现破骨细胞，它是一种大的多核细胞，可有几十个细胞核，特点为粗面内质网稀疏，高尔基体广泛，主要表达破骨细胞蛋白 。骨骼中的破骨细胞位于骨表面凹坑的豪息泼氏陷窝（）。破骨细胞胞质具有均匀泡沫样 ，外观，这利于液泡填充酸性磷酸酶溶酶体。骨吸收活跃部位，破骨细胞形成广泛折叠或起皱的专有边界，通过增加细胞膜表面积来分泌和吸收区室内容物，促进骨的去除。另外分泌酸和胶原酶，在分子水平上消解吸收水合蛋白与矿物质，破骨细胞影响骨基质再吸收、无机成分溶解及骨基质有机成分消化，能够将氢离子泵入亚破骨细胞室制造酸性微环境，增加矿物质溶解度，致使矿物质释放入破骨细胞胞质，最终转运至邻近毛细血管。矿物质去除后，胶原酶和明胶酶被分泌到亚破骨细胞隔室中，消化、降解、脱钙基质胶原蛋白与有机成分，其产物在褶皱边缘被破骨细胞吞噬。具有吞噬特性可以认定其属于单核吞噬细胞系统的一部分，激素与细胞因子可调控其活性。属于前炎症介质，调节炎症反应和免疫偏倚，含 个家族成员与 种受体 。来源于活化的肥大细胞和 细胞，通过血管浸润关节滑膜。软骨细胞及成纤维细胞样滑膜细胞表面均存在 受体 。研究表明 进程中 细胞直接对软骨和成纤维细胞膜抗原产生细胞免疫反应。关节炎患者的血清和滑液中 水平较对照组显著升高，其能够抑制软骨细胞合成蛋白多糖，促进 产生，与影像学呈现正相关，不仅如此，部分人群中基因 多 态 性 与 关 节 炎 发 展 的 易 感 性 相关 。作为前体，可通过核因子 通路引发炎症反应，通过与细胞表面的 受体特异性结合，激活激酶引起磷酸化 。与空白对照组比较，中等浓度补骨脂素可以使 患者软骨 滑膜细胞共培养体系中的 、显著下降，对于抑制 症进展具有重要意义，另外核因子 无显著变化，仍需扩大样本做进一步验证。总之，上述细胞实验结果和分析符合中等剂量补骨脂素治疗 的网络药理学预测结果，为进一步研究提供了有力依据。利益冲突声明：本研究不涉及利益冲突。参考文献 李敏，何庆勇 基于 黄帝内经“五体痹”理论探讨经方在痹病中的应用 中华中医药杂志，（）：叶超，陈婧，刘向春，等 不同证候膝骨关节炎患者证候程度评分与关节液炎性指标的典型相关分析 中国中医骨伤科杂志，（）：，林燕平，黄佳纯，陈桐莹，等 补骨脂对成骨细胞和破骨细胞增殖分化的影响研究进展 现代中西医结合杂志，（）：世界中医药学会联合会 网络药理学评价方法指南 世界中医药，（）：王子怡，王鑫，张岱岩，等 中医药网络药理学：指南 引领下的新时代发展 中国中药杂志，（）：，：，（）：王蔚陆，杨若聪，贾彩霞，等 交泰丸治疗失眠与口疮的网络药理学机制研究 甘肃医药，（）：李颖，宋峰，苏德其其格，等 紫外线调控动物皮肤生理状态的研究进展 黑龙江畜牧兽医，（）：，李莉 非 细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠的治疗作用及其机制研究 石家庄：河北医科大学，（）：韦冰，李学飞，吴连国 软骨下骨病变在骨关节炎发病进程中的作用 浙江中西医结合杂志，（）：，（）：张艳艳，刘伟，张超，等 基于胆碱能抗炎通路的类风湿关节炎治疗机制与中医药作用机制研究进展 山东中医杂志，（）：，周巧，刘健，忻凌，等 例骨关节炎患者超氧化物歧化酶的变化及关联规则挖掘研究 世界中西医结合杂志，（）：，王月琳 骨关节炎患者的临床特点及中医证型分布规律 济南：山东中医药大学，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：（下接第 页）世界中医药 年 月第 卷第 期 ，：，（）：，：，（）：，：，：孙宝莹，王雅楠，姚琳，等 存在糖调节受损的缺血性脑小血管病患者血清脂蛋白相关磷脂酶 与血管性认知障碍的相关性 中国医药，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：李燕利 从“聪明基因”途径探讨 肾上腺素受体激动剂对血管性痴呆大鼠认知功能的调节作用 宜昌：三峡大学，（）：，（）：刘晓燕，龙凤，赵玉，等 蒲公英中有效成分抗肿瘤作用机制的研究进展 中草药，（）：许娟秀，吴海根 藤黄酸通过增加 水平抑制卵巢癌细胞的增殖、炎症反应和转移标志物表达 中成药，（）：，：（收稿本文编辑：张晓辉）（上接第 页），：，（）：钱振昊 基于 及 通路探究青藤碱对骨关节炎的作用和机制 乌鲁木齐：新疆医科大学，：，（）：陈紫军，霍晓乾，任越，等 复方杜仲健骨颗粒治疗骨关节炎的抗炎潜在药效物质及作用机制研究 中国中药杂志，（）：李辉，谢兴文，赵永利，等 中药有效成分防治骨关节炎的作用机制研究进展 中草药，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿本文编辑：孙昊），