不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用.pdf

Journal of Lanzhou University(Natural Sciences),2023,59(3)/June兰州大学学报（自然科学版），2 0 2 3，59(3）6 月不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用王娟娟，达晓伟，王馨，庞海龙2，贾凌云2，冯汉青1.21.西北师范大学生命科学学院，兰州7 30 0 7 02.西北师范大学新农村发展研究院，兰州7 30 0 7 0摘要：以BY-2烟草悬浮细胞为实验材料，探究在不同磷酸盐供应水平下细胞内ATP(iATP)、细胞外ATP(eATP)水平的变化以及NO在其中的调节作用.结果表明，随着磷酸盐供应水平的增加,iATP水平呈现上升趋势；伴随着iATP的上升，eATP也呈现相似的变化.与ATP的变化不同，随着磷酸盐供应水平的增加NO水平呈现下降趋势.在正常水平磷酸盐供应下，NO供应剂可增加iATP和eATP水平；NO合成抑制剂降低了iATP和eATP水平.在较低和较高水平的磷酸盐供应下，NO供应剂和合成抑制剂对于iATP和eATP水平的影响呈现与正常水平磷酸盐供应下不同的调节效应，表明磷酸盐供应水平能够影响iATP和eATP的水平；NO对细胞ATP水平具有调节作用，其调节效应与环境磷酸盐供应水平有关.关键词：磷酸盐；一氧化氮；胞外ATP；胞内ATP中图分类号：Q942文献标识码：A文章编号：0 4 55-2 0 59(2 0 2 3)0 3-0 34 6-0 5D0I:10.13885/j.issn.0455-2059.2023.03.008Changes in intracellular and extracellular ATP levels in plant cells underdifferent phosphate supply levels and regulation of nitric oxideWANG Juan-juan,DA Xiao-wei,WANG Xin,PANG Hai-long*,JIA Ling-yun2,FENG Han-qing.-21.College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China2.New Rural Development Research Institute,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,ChinaAbstract:BY-2 tobacco suspension cells were used as experimental materials to investigate the changesin the intracellular ATP(iATP)and extracellular ATP(eATP)levels under different levels of phosphatesupply and the regulatory role of nitric oxide in this process.The results showed that the level of iATP in-creased with the increasing level of phosphate supply,which was followed by an increase of eATP leveland decrease of the content of NO.Under a normal level of phosphate supply,the application of NO do-nor increased the levels of iATP and eATP,while the inhibitor of NO synthesis reduced that of iATP andeATP.Under the condition of either a lower or high level of phosphate supply,the effects of NO donorand inhibitor of NO synthesis on the iATP and eATP levels were different from those under a normal lev-el of phosphate supply.These studies suggested that differences in the levels of phosphate supply could收稿日期：2 0 2 2-0 3-2 8修回日期：2 0 2 2-0 5-11基金项目：国家自然科学基金项目(318 7 0 2 4 6);甘肃省重点研发计划项目(2 2 YF7NA119);甘肃省科技重大专项(2 2 ZD1NA001);甘肃省引导科技创新发展专项(2 0 19 ZX-05)；西北师范大学新农村发展研究院开放基金作者简介：冯汉青(19 7 8-)，男，河北保定人，教授，博士研究生导师，e-mail:，研究方向为植物生理学，通信联系人：347王娟娟，等：不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用affect the levels of iATP and eATP in plant cells.NO could play a role in regulating the changes in iATPand eATP levels,but the regulatory effect of NO in this process was related to the level of phosphatesupply.Key words:phosphate;nitric oxide;extracellular ATP;intracellular ATP磷是核酸、磷脂类等物质的构成基础，对植物的生长和发育具有重要作用 在自然环境中，磷主要以磷酸盐的形式存在 2 .对植物磷酸盐供应量的变化会引起植物体内核酸、蛋白质等物质合成量发生变化，同时植物的呼吸、光合作用等初级代谢也会由于磷酸盐供应量发生改变 3；植物一些次级代谢物如花色苷、苯丙素等物质的合成也受到磷酸盐供应量的影响三磷酸腺苷(adenosine-5-triphosphate,ATP)主要在细胞内合成.传统观念认为，ATP是生物体内的“能量货币”分子，驱动细胞内的能量依赖性反应 5.研究发现，动物、植物以及微生物细胞均可以将细胞内ATP(intracellular ATP,iATP)通过多种方式释放到细胞外基质中，使得细胞外也存在一定水平的ATP,即细胞外ATP(extracellularATP,eATP)和iATP不同，eATP是一种重要的信号分子.动物细胞中，eATP可以结合其质膜上的跨膜受体蛋白调节细胞生长及免疫等生理过程 8 ；植物细胞中，eATP对于植物细胞的活力、生长发育、抵抗逆境等均具有重要的调控作用一氧化氮是生物体内重要的信号分子 10 ,，在植物和动物的生长发育和代谢中起到重要的调节作用 在植物对磷酸盐供应变化的响应过程中，NO起到重要的调节作用.多种植物在磷元素缺乏的环境中NO水平会显著升高 12 .WANG等 13 发现，在磷供应不足时，白羽扇豆根在主根和侧根中NO积累量增多，NO的积累会促进簇状根的形成和柠檬酸盐渗出的增加，提升根对磷酸盐的吸收.玉米在磷元素缺乏下，NO能够增加酸性磷酸酶的活性并提高植物对磷酸盐的吸收能力14 .水稻在磷元素缺乏下细胞壁中磷的再分配受到NO的调控5,尽管磷是ATP构成的重要元素，但磷酸盐供应水平变化对植物ATP,尤其是植物eATP水平的影响鲜见报道.在磷酸盐供应水平变化下，NO是否具有调节iATP和eATP水平的作用也不得而知.本研究以烟草(Nicotianatabacum)悬浮细胞为材料，研究不同磷酸盐供应水平下iATP和eATP的变化,以及NO在其中的调控作用.1材料与方法1.1实验材料以烟草悬浮细胞(N.tabacum cv.BY-2)为材料，将细胞接种于添加了质量浓度3%蔗糖和0.2mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的MS(Murashige-Skoog)液体培养基中，在2 7、130 r/min黑暗条件下振荡培养.每隔1个生长周期(7 d),吸取10mL细胞培养物，加人到2 0 0 mL的新鲜MS液体培养基中完成传代培养.使用生长对数期(接种后第4 天)的烟草悬浮细胞为材料，以上步骤均在无菌条件下完成.1.2烟草悬浮细胞的处理配制标准MS培养基(其中磷酸二氢钾浓度为1.25mmol/L),设定其为1P培养基；并依此配制OP培养基(不含磷酸二氢钾的MS培养基)、0.2 5P培养基(磷酸二氢钾浓度为1P的0.2 5倍)、2 P培养基(磷酸二氢钾浓度为1P的2 倍).称2 g培养到第4 天的烟草悬浮细胞置于不同磷浓度的MS培养基中培养36 h,用于指标测定。选择OP、0.2 5P、1P、2 P的MS培养基培养的细胞,用0.1mmol/L的硝普纳(SNP,NO的供体)或0.15mmol/L的NO的合成抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)处理上述细胞,培养36 h后,用于指标测定，1.3iATP的测定吸取1mL细胞于离心管中，于4、50 0 0 r/min离心5min，吸取上清液于另一离心管中备用.将样品液与ATP检测液（含荧光素酶和荧光素，碧云天ATP检测试剂盒)按照1:1体积比进行混合16;使用化学发光仪检测化学发光强度，根据ATP标准曲线进行换算，1.4eATP的测定吸取1mL细胞于离心管中，于4、50 0 0 r/min离心5min，弃上清液，用ATP检测裂解液(碧云天ATP检测试剂盒)裂解细胞，加人2 0 0 L裂解液静置2 min后，在4、50 0 0 r/min离心5min，取上清液.在上清液(样品液)中按照1：1体积比加人348兰州大学学报(自然科学版)，2 0 2 3，59(3)ATP检测液，使用化学发光仪检测化学发光强度，根据ATP标准曲线进行换算.1.5NO含量的测定使用NO荧光探针DAF-FMDA(3-amino,4-aminoomethyl-2,7-difluorescein diacetate）检测NO含量17 .取1mL细胞于离心管中，4 0 0 0 r/min离心2 min，取一定体积的上清液加人5mol/L的DAF-FMDA.在2 5黑暗条件下孵育2 0 min.加人800L磷酸缓冲液，4 0 0 0 r/min离心2 min，弃上清液以除去未进人细胞的染料.在沉淀中加人10 0 L磷酸缓冲液，吹打混匀.采用徕卡激光共聚焦显微镜在4 9 5nm激发波长、515nm发射波长下检测荧光并成像.利用图像分析软件ImageJ(1.8.0)对细胞中单位面积NO荧光强度进行定量分析.1.6统计分析实验结果和NO量化图所得结果为至少3次独立实验的平均值，实验结果均用平均值土标准差表示，采用双总体t检验数据，在P0.05水平上差异显著。2结果与分析2.1iATP水平的变化随着磷酸盐供给水平的增加，iATP水平总体上呈现增加的趋势，在0 1P时，iATP水平明显上升.当磷酸盐浓度为2 P时，iATP水平与1P保持一致，无显著变化(表1).表1不同浓度磷酸二氢钾对烟草悬浮细胞iATP、e A T P水平及NO荧光强度的影响Table 1Effects of different concentrations of potassium dihydrogen phosphate oniATP,eATP levels and NO fluorescence of tobacco suspension cells磷酸二氢钾浓度iATP/(mol/L)eATP/(mol/L)NO荧光强度OP0.52150.0043c0.439290.00016d11.852 51.3161a0.25P0.76350.0172b0.447070.00038c8.00470.5334b1P0.85610.0032a0.449030.00074b6.60201.509 5b2P0.91670.0403a0.452340.000272.10830.4424ad表示不同处理间存在显著差异(P0.05).2.2eATP水平的变化不同浓度磷酸盐的供给导致细胞eATP水平的不同，在OP培养基中细胞eATP水平最低；较之OP培养基，0.2 5P培养基中细胞的eATP水平显著升高.随着培养基中磷酸盐含量的提高，eATP水平呈现进一步的上升趋势，但上升幅度有所减缓.2.3NO水平的变化随着培养基中磷酸盐浓度的不断升高，细胞中NO水平不断下降，在2 P细胞中达到最小值。NO荧光图见图1.2.4NO对iATP水平的影响对1P水平培养下的细胞分别施加SNP和L-NAME发现，较之对照（相同磷供应水平下没有进行SNP或L-NAME处理的细胞),SNP使得细胞iATP水平上升2 4%,L-NAME使得细胞iATP水平下降7.2%.在OP培养的细胞中，较之对照，SNP使得细胞iATP含量上升58%,L-NAME处理细胞后iATP水平无明显变化.在0.2 5P培养的细胞中，较之对照SNP和L-NAME分别使细胞iATP上升59%和2 4%.在2 P培养的细胞中，较之对照，SNPaOPb0.25PC1Pd2P图1DAF-FMDA探针染色NO荧光图Fig.1Fluorescence images of NO stained withDAF-FMDAprobe使得细胞iATP水平升高36%,L-NAME对细胞的iATP水平无显著影响（表2).2.51NO对eATP水平的影响较之对照，在IP水平下添加NO供体SNP使细胞eATP水平显著升高，L-NAME使细胞eATP349王娟娟，等：不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用表2NO对不同的培养细胞iATP、e A T P水平的影响Table2Effects of NOonthelevels ofiATPandeATPindifferentculturedcellsmol/L处理iATPeATP1P0.617 20.0075b0.439280.00001b1P+SNP0.81290.0018a0.443260.00120a1P+L-NAME0.57230.0037c0.431920.00110cOP0.45650.00580.425280.00002dOP+SNP1.07610.0086a0.431700.00082OP+L-NAME0.45470.0015c0.425190.00009d1P0.61720.0075c0.439280.00001b1P+SNP0.812.90.001 8b0.443260.00120a1P+L-NAME0.572 30.003 7d0.431920.00110c0.25P0.47210.00120.427440.00013d0.25P+SNP1.152 50.044 9a0.438 280.000 81b0.25P+L-NAME0.61680.03320.426520.00009d1P0.61720.00750.439280.00001b1P+SNP0.812.90.001 8b0.443260.00120aIP+L-NAME0.57230.003 6d0.431920.00110c1P0.617 20.0075b0.439280.00001d1P+SNP0.81290.0018a0.443260.00120cIP+L-NAME0.57230.00370.431920.001102P0.52260.0144c0.463740.00000a2P+SNP0.81570.0216a0.443200.00093c2P+L-NAME0.547 40.008 90.453 360.002 30bae表示不同处理间存在显著差异(P0.05).水平显著降低.在0 P和0.2 5P培养条件下，较之对照，SNP使细胞eATP显著上升；L-NAME对eATP水平无显著影响.在2 P培养条件下，较之对照，SNP和L-NAME均使细胞eATP水平显著下降；SNP对细胞eATP水平的影响较之L-NAME更加剧烈3讨论与结论随着磷酸盐供应量的上升，iATP和eATP水平均呈现上升趋势.磷是植物以无机磷酸盐的形式获得和吸收的基本元素，是组成ATP的重要元素，并在能量转移反应、信号转导过程和酶活性调节中发挥关键调节作用.在植物中，P可以通过光合磷酸化合成ATP的底物 18 因此磷酸盐供应量的上升对ATP水平的影响应当是由于磷酸盐增加了ATP合成的底物供应水平所致.目前，并没有在植物细胞膜上发现ATP合成酶，因此iATP被认为是eATP的唯一来源.推测随着磷酸盐供应量的上升，iATP合成水平上升，增加了iATP向细胞外的分泌，进而增加了eATP的水平.OP0.25P,iATP和eATP水平上升幅度较大；0.2 5P2P,二者水平上升幅度明显减缓，说明即使磷酸盐供应量在一定范围内发生变化，植物细胞能够对自身ATP的合成水平进行调控，使得其水平较为稳定.NO参与植物对低磷供应反应的证据已经在白羽扇豆中得到，在其他一些双子叶和单子叶植物物种中，缺磷会引发簇状根的发育，并伴随着低分子量物质的释放，包括有机酸和质子 19 .这些反应有助于植物通过密集的土壤磷挖掘来增加磷的获取.在低磷环境中，植物细胞NO水平的升高能够通过调节磷转运蛋白编码基因表达等方式促进植物对于磷的吸收和转运(12.2 0-2 11.随着磷酸盐供应量的上升，细胞NO水平呈现下降趋势.在植物研究中发现,NO合成酶(NOS)、硝酸还原酶和黄嘌呤氧化还原酶(XOR,同时存在黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶两种形式)在植物中分别以不同的氮源为底物合成NO.通过使用NOS的抑制剂发现，在缺磷下植物NO的产生可能和NOS活性上升有关；磷供应的缺乏能够上调黄嘌呤脱氢酶编码基因的表达 13.磷酸盐供应量的变化有可能通过影响NOS和XOR而改变烟草悬浮细胞中NO的含量.利用SNP和L-NAME发现，NO对细胞ATP水平的调节效应和磷酸盐的供应水平有关.在1P水平的磷酸盐供应下，NO具有增加eATP水平的作用；而在高水平的磷酸盐供应下(2 P),NO水平的增加或降低均会导致eATP水平下降.NO对于iATP和eATP也具有不同的调节效应：在2 P水平的磷酸盐供应下，SNP导致eATP水平下降，但引起了iATP水平的上升.认为可能是由于NO对于ATP的调控具有多种调节机制.NO能够调节植物对于磷酸盐的吸收，从而增加植物ATP合成所需的底物的供应水平.NO也被发现是线粒体电子传递链的抑制剂 2 ,能够通过阻断线粒体电子传递链而影响植物ATP的合成 2 3.因此，从理论上讲，NO同时具有增加ATP合成和抑制ATP合成的作用.在动物研究中发现，NO能够通过抑制apyrase的活性而影响eATP的水平 2 4 ,提示NO也可以通过apyrase直接影响eATP的水平，在不同的磷酸盐供应水平下，NO水平和植物对于ATP的需求均在发生变化，使得NO对于iATP和eATP上述的不同调控方式的权重也可能产生了相应的改变，从而呈现在不同磷供应状态下NO对ATP水平的影响有所不同。不同磷酸盐供应水平下iATP和eATP水平的变化受NO的调节，其调节作用与磷酸盐供应水平有关.（责任编辑：蔡红霞）350兰州大学学报（自然科学版)，2 0 2 3，59(3)致谢：感谢香港中文大学姜里文教授提供实验材料BY-2烟草悬浮细胞.参考文献1 CHAI H C,PASZKOWSKI U.Mechanisms and impactof symbiotic phosphate acquisitionJ.Cold Spring Har-bor Perspectives in Biology,2019,11(6):a034603.2 XU Z F,HUANG T,YIN X J,et al.Improvements in thepreparation of phosphate for oxygen isotope analysisfrom soils and sedimentsJ.Public Library of ScienceOne,2018,13(9):e0204203.3 CARSTENSEN A,HERDEAN A,SCHMIDT S B,et al.The impacts of phosphorus deficiency on the photosyn-thetic electron transport chainJ.Plant Physiology,2018,177(1):271-284.4 PLAXTON W C,TRAN H 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