草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化.pdf

黑龙江农业科学 ():H e i l o n g j i a n gA g r i c u l t u r a lS c i e n c e sh t t p:/h l j n y k x h a a s e p c nD O I:/j i s s n 王禹,牟蕴慧,侯睿宁,等草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化J黑龙江农业科学,():草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化王王禹禹,牟牟蕴蕴慧慧,侯侯睿睿宁宁,刘刘万万达达,谭谭巍巍,于于飞飞(黑龙江省农业科学院 园艺分院,黑龙江 哈尔滨 )摘要:草莓茎尖组织培养育苗技术通常采用诱导分化、增殖、生根种培养基进行培养,工序较为繁琐,为探索出一种既可用于草莓茎尖诱导分化,也可用于增殖、生根培养步骤的通用培养基,进一步简化操作工序,以草莓“红颜”mm的茎尖为试材,生长激素采用 B A、T D Z、NAA、I AA、I B A并分别设置个不同浓度,应用L()的正交试验,筛选出可用于茎尖诱导分化、增殖、生根培养的通用培养基为M S B A m gLT D Z m gLNAA m gL I AA m gL I B A m gL,诱导分化率为 ,增殖系数为,生根率为 .关键词:组织培养;育苗;正交试验;培养基优化收稿日期:基金项目:黑龙江省农业科学院院级科研项目(Y Y Y F ).第一作者:王禹(),女,硕士,助理研究员,从事植物组织培养研究.E m a i l:l i u w a n d a c o m.草莓(F r a g a r i aa n a n a s s aD u c h),蔷薇科(R o s a c e a e)、草莓属(F r a g a r i aL),多年生宿根性草本植物,果实味美、营养丰富,被称为“水果皇后”;栽培生产周期短、结果早、适应性强,是促进农民增收的经济作物 .草莓规模化繁育脱毒种苗的企业较少,生产上栽培的种苗主要采用田间自育的匍匐茎苗 ,连续多年的繁殖导致病毒病传播及积累,出现植株矮化、抗病和抗逆性变差、叶片褪绿、子苗繁殖系数降低、果实品质变劣及产量下降等问题,严重影响生产销售和收益 .解决这些问题的最经济有效的方法是利用草莓茎尖组织培养技术繁育种苗,不仅可培育出无病毒植株,还可加快繁殖速度.朱文勇等采用微尖脱毒后 c m的草莓茎尖为外植体研究得出,诱导分化培养基为M S B A m gL;增殖培养基为M S I B A m gL,生根培养基为M S.沈莉等 以个品种的草莓茎尖为外植体研究得出,诱导分化培养基为M S B A m gLGA m gL;增殖培养基为M S B A m gL GA m gL;生 根 培 养 基 为M SI B A m gL.顾建新等以热处理后mm的草莓茎尖为外植体研究得出,诱导分化培养基为M S B A m gLNAA m gL,增殖培养基为M S B A m gLI B A m gL,之后采用瓶外扦插生根法进行生根.草莓茎尖组织培养育苗技术通常采用诱导分化、增殖、生根种培养基培养,生产中需频繁配制及接种更换培养基,工序较为繁琐,导致影响其生产效益的切割损伤、接种污染等因素较多.因此本研究利用正交试验对培养基进行优化,以期探索出一种既可用于草莓茎尖诱导分化,也可用于增殖、生根培养的通用培养基,简化操作工序,使草莓组织培养育苗技术更加易于掌握,有利于技术的推广及应用,从而促进草莓脱毒种苗的规模化生产.材料与方法 材料供试草莓品种为“红颜”,具有生长势旺、产量高、口味佳等优点,适于设施促成栽培,是黑龙江省草莓生产的主要栽植品种之一.试验材料采自于黑龙江省农业科学院园艺分院.采集的试材为长c m无病虫害且生长健壮的匍匐茎茎尖.温室采集时间为月初至月中旬,田间采集时间为月末至月中旬,此时茎尖生长旺盛,接种后易产生增殖芽.试验药品购自于杭州临安木木生物公司及哈尔滨市香坊区锦续实验用品经销部.方法 培养基的制备及工具准备所有培养基均采用M S 植物激素琼脂gL 白糖 gL,p H ,在 MP a、下,湿热灭菌 m i n.无菌水、滤纸及接种工具,在 M P a,下,湿热灭菌 m i n.解剖镜放入超净工作台紫外灭菌 m i n.试验材料处理将采集的茎尖在流水状态下冲洗 m i n,放入超净工作台中,酒精消毒 s,无菌水冲洗次;H g C l消毒m i n,期王禹等:草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化无菌水冲洗次,每次m i n,之后置于无菌水中.在解剖镜下剥取 mm内茎尖,此形态茎尖脱除病毒病效果较好 .培养基中各生长激素的正交试验培养基中生长激素采用 B A、T D Z、NAA、I AA、I B A,B A设置,和 m gL,T D Z设置,和 m gL,NAA设置,和 m gL,I AA设置,和 m gL,I B A设置,和 m gL进行五因素因素五水平的L()正交试验 .具体配比处理组合编号和配比详见表.表L()正交试验处理激素浓度组合单位:m gL处理 B AT D ZN A AI A AI B A 每处理组合接种 瓶、每瓶接种个试验材料,次重复.每隔 d调查次,共调查次.茎尖诱导芽生长状态包括诱导出芽快慢、叶色、长势.丛生芽增殖芽生长状态包括芽增殖生长快慢、叶色、长势.组培苗生长状态包括组培苗生根快慢、叶色、长势.茎尖诱导率()诱导出芽茎尖数/接种茎尖数 丛生芽增殖系数增殖芽数/接种芽数组培苗生根率()生根组培苗数/接种组培苗数 培养条件培养温度 ,夜晚不低于,光照强度为 l x,光照时长 hd,相对空气湿度不高于.数据分析试验数据采用极差法和方差法进行分析,分析软件为E x c e l 和S P S S .结果与分析 各生长激素处理组合的参数统计茎尖培养过程中,接种后d茎尖变为黑色,d后茎尖逐渐转绿,开始诱导分化出芽.d时诱导分化发生较快的茎尖可形成小增殖团;有一些外植体虽然诱导出芽,但只伸长生长不产生小增殖团;一些诱导发生较慢的茎尖此时才出芽,叶片呈黄绿色,植株生长不良.在培养基上继续培养,增殖生长和伸长生长同时发生,形成较大增殖团同时苗也长高;有些培养基上小增殖团只继续增殖出芽,不进行伸长生长,导致生根较慢.继续培养至 d苗高大约c m时,组培苗基部开始分化出白色较粗壮的根,根部生长迅速,d可生长至 c m,此时苗也迅速生长.由表可知,处理(M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gL I B A m gL)的培养基表现最佳,诱导分化率为 ,增殖系数为,生根率为 .采用极差法筛选最佳培养基组合采用极差法对培养基中各激素处理组合的结果进行分析,从表诱导分化率来看,个因素对其影响大小顺序是 B AT D ZI A AN A AI B A,最佳培养基组合为M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gL.从增殖系数看,个因素对其影响大小顺序是T D Z B AI B AI AANAA,最 佳 培 养 基 组 合 为M S B A m gLT D Z m gLNAAm gL I A A m gL I B A m gL.从生根率来看,个因素对其 影响大小顺 序是 B A I B AT D Z N A A I A A,最佳培养基组合为M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gL.筛选出个最佳组合的培养基均未重复,与表中 个处理培养基组合均未重复,继续进行对比验证试验.黑龙江农业科学期表各生长激素处理组合对草莓茎尖诱导分化、增殖、生根的影响处理诱导分化率/芽生长状态增殖系数芽生长状态生根率/组培苗生长状态 诱导出芽慢,叶片黄绿色 增殖慢,叶片黄绿色 生根慢,叶片黄绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖慢,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖慢,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽慢,叶片绿色 无增殖芽 无根产生 诱导出芽快,叶片绿色 增殖慢,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖慢,叶片绿色 生根慢,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖慢,叶片绿色 生根慢,叶片绿色 诱导出芽慢,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽慢,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根慢,叶片绿色 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根慢,叶片绿色 诱导出芽慢,叶片黄绿色 无增殖芽 无根产生 诱导出芽慢,叶片黄绿色 增殖快,叶片黄绿色 生根慢,叶片黄色 诱导出芽慢,叶片黄绿色 增殖快,叶片黄绿色 生根快,叶片黄绿色 诱导出芽慢,叶片黄绿色 增殖快,叶片黄绿色 生根快,叶片黄绿色 不诱导出芽 无增殖芽 无根产生 诱导出芽慢,叶片黄色 无增殖芽 无根产生 诱导出芽慢,叶片黄色 无增殖芽 无根产生 不诱导出芽 无增殖芽 无根产生 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根慢,叶片绿色 不诱导出芽 无增殖芽 无根产生表各生长激素处理组合下草莓茎尖诱导分化率、增殖率、生根率极差分析极差项诱导分化率/增殖系数生根率/B AT D ZNAAI AAI B A B AT D ZNAAI AAI B A B AT D ZNAAI AAI B AK K K K K R 优选方案 m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL m gL 采用方差法筛选最佳培养基组合采用方差法对培养基中各激素处理组合的结果进行分析,表显示各分析项的处理总效应均未达到显著水平,不存在主体效应.各激素对诱导分化率、增殖系数影响均未达到显著水平,说明 B A、T D Z、N A A、I A A、I B A对诱导分化率、增殖系数不产生显著影响;种激素对诱导率影响大小顺序是 B AT D ZI A AN A AI B A,对增殖系数影响大小顺序是T D Z B AI B A I AANAA,均与极差结果分析一致.激素 B A、I B A对生根率的影响达到显著水平,T D Z、NAA、I AA对生根率的影响未达到显著水平,说明 B A、I B A对生根率产生显著影响,T D Z、NAA、I AA对 生 根 率 没 有 显 著 影 响;种激素对生根率影响大小顺序是I B A B AT D ZNAAI AA,与 极 差 分 析 结 果 不 一 致.因此只对生 根 率 中 各 浓 度 梯 度 进 行D u n c a n s检验.期王禹等:草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化表各生长激素处理组合下草莓茎尖诱导分化率、增殖率、生根率方差分析变异来源诱导分化率/增殖系数生根率/平方和均方FP平方和均方FP平方和均方FP修正模型 B A T D Z N A A I A A I B A 误差 总计 修正后总计 因素主次S B AST D ZSI A ASN A ASI B AST D ZS B ASI B ASI A ASN A ASI B AS B AST D ZSN A ASI AA注:表中表示在P 水平差异显著.由表可知,B A m gL 处理生根率与 和 m gL 处理差异不显著,显著高于 和 m gL,因此 B A可选用,和 m gL;I B A m gL 处理生根率与 m gL 差异不显著,显著高于,和 m gL,因此I B A可选用 和 m gL.T D Z、NAA、I A A各浓度处理对生根率影响均不显著,且对诱导率影响也不显著.因此T D Z、N A A、I A A选用生根率 平均值最高 的 浓 度 即 可,即T D Z m gL、N A A m gL、I A A m gL.培养基最佳组合为M S B A m gL T D Z m gL N A A m gL I A A m gL I B A m gL、M S B A m gL T D Z m gL N A A m gL I A A m gL I B A m gL、M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gL、M S B A m gLT D Z m gL N A A m gL I A A m gL I B A m gL(与表最优组合相同)、M S B A m gL T D Z m gL N A A m gL I A A m gL I B A m gL、M S B A m gL T D Z m gL N A A m gL I AA m gLI B A m gL,继续进行对比验证.表生根培养基中种激素个水平下的生根率D u n c a n s检验 B AT D ZNAAI AAI B A浓度/(m gL)生根率/浓度/(m gL)生根率/浓度/(m gL)生根率/浓度/(m gL)生根率/浓度/(m gL)生根率/a a a a b a a a a a a a a a a b a a a b b a a a b 各最佳培养基组合对比试验将正交试验、极差分析和方差分析得出的最佳组合培养基进行对比验证,每处理组合接种 瓶,每瓶接种个试验材料,试验重复次.由表可知,“红颜”在M S B A m gLT D Z m gL N A Am gL I A A m gLI B A m gL和M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gL I B A m gL培养基上增殖系数达到了 ,但植株生长不健壮、叶片呈黄绿色,且生根率和茎尖诱导分化率较低.在M S B A m gL T D Z m gL N A A m gL I A A m gL I B A m gL培养基上茎尖诱导分化率最高,达到了 ,且植株长势健壮,但生根率和增殖系数低于M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gL I B A m gL培养基.综合各因素,以M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gL培养效果最好,“红颜”茎尖诱导分化率为 ,增殖系数达到,生根率为 .黑龙江农业科学期表优异培养基接种 红颜 草莓茎尖诱导分化及组培苗生长状态差异分析优异培养基分化率/芽生长状态增殖系数芽生长状态生根率/组培苗生长状态M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gLI A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片黄绿色 生根快,叶片黄绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片黄绿色 增殖快,叶片绿色 生根快,叶片绿色M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gLI B A m gL 诱导出芽快,叶片黄绿色 增殖快,叶片黄绿色 生根快,叶片黄绿色 讨论生长素可影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势和生根等现象,组织培养中生长素被用于促进细胞的分裂和生长以及根的分化,发生作用时和外植体的种类和激素的种类、浓度以及相互间的配比有关 .试验结果显示 B A在 m gL范围内,随着浓度升高诱导分化率、增殖率、生根率均升高,当 B A浓度为 m gL时诱导分化率、增殖率、生根率开始下降,其他激素亦如此.由此得出培养基添加不同种类激素均促进诱导分化、增殖、生根的发生,并在一定范围内随着激素浓度升高诱导分化率、增殖率、生根率呈上升趋势;但激素浓度高则对诱导分化、增殖、生根的发生有抑制作用.每种激素在茎尖诱导分化、增殖、生根的不同生长时期影响主次不同,种激素对诱导率影响大 小顺序是 B AT D ZI AANAA I B A,对增殖系数影响大小顺序是T D Z B AI B AI AANAA.方差分析中对生根率影响大小顺序是 B AI B AT D ZN A AI A A,与极差分析 B A I B AT D ZN A A I A A结果不一致,推测I B A需与 B A互作才能促进根的发生,所以 B A、I B A的主次作用不明显.多级培养时每一种培养基有自己的作用,需要先诱导出分化出芽,然后再转接诱导增殖团,再进行伸长生长并诱导生根.通用培养基的不同之处是培养基既要诱导出芽,又要可以增殖,还要可以促进生根,因此要综合考虑茎尖诱导分化率、增殖系数、生根率及组培苗生长势等多项指标,以筛选出来最适合的培养基 .如“红颜”在M S B A m gLT D Z m gLNAAm gL I AA m gL I B A m gL培养基上增殖系数虽然达到了 ,但诱导率和生根率仅为 和 ;在M S B A m gL T D Z m gL NAA m gLI AA m gL I B A m gL培养基上增殖系数达到了 ,但植株生长不健壮、叶片呈黄绿色;在M S B A m gLT D Z m gLN A A m gL I A A m gL I B A m gL诱导分化率 ,增殖系数达到了,且植株生长健壮,但生根率较低,仅为 ,生根率是期王禹等:草莓茎尖组织培养育苗技术的培养基优化衡量组培苗能否移栽的关键.因此这些培养基均不能选用.最终筛选出的优化培养基为M S B A m gLT D Z m gLNAA m gL I A A m gL I B A m gL.又将此培养基应用于草莓品种“章姬”“安娜”等种苗繁育,结果表明草莓茎尖诱导分化率均达到 以上,增殖系数 以上,生根率 以上,且植株长势良好.由于茎尖在瓶内成苗需要约 d的时间,时间较长,可在 d或 d时更换次培养基,为外植体补充养分,使其更好地生长.该培养基可再继续进行优化,探讨如何缩短瓶内生长时间,使该技术操作更加简便,赵春莉等 应用响应面法优化软枣猕猴桃的培养基将培育时间从 d缩短至 d,实现了软枣猕猴桃一步成苗.结论培养基添加不同种类激素可促进诱导分化、增殖、生根的发生,但激素浓度过高则对诱导分化、增殖、生根有抑制作用,且各激素之间有互作作用.草莓“红颜”茎尖组织培养优化后的培养基为M S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gL,诱导分化率 ,增殖系数,生根率 ,茎尖诱导分化、增殖、生根培养可通用.参考文献:刘国霞,张全芳,杨雪,等八倍体草莓D NA指纹图谱的构建与初步遗传分析J中国农业大学学报,():张学明,陈玉波,姚环宇,等公主岭设施草莓品种引种试验J/O L东北农业科学:h t t p:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/S h t m l 苏代发,代庆忠,严聪文,等草莓根腐病及其生物防治研究进展J江苏农业科学,():李亮杰,楚宗丽,张惠妹,等河南省草莓生产现状调查、经济效益分析及发展建议J中国果树,():汤玲,贺欢,孔芬,等甘肃省草莓产业发展现状及建议J甘肃农业科技,():王琼,宗静,马欣北京市草莓种苗生产现状及对策J中国园艺文摘,():,沈莉,曹玉梅 个品种草莓茎尖组培脱毒苗技术研究J青海农林科技,():顾建新,李芳艳,王蓉,等草莓组培工厂化育苗大规模生产技术J新疆农业科学,(S):朱文勇,赵玉军,郭黄萍,等无毒草莓组织培养工厂化快速育苗技术研究J山西果树,():沈莉,曹玉梅 个品种草莓茎尖组培脱毒苗技术研究J青海农林科技,():邓渊两个草莓品种茎尖脱毒快繁体系的建立D呼和浩特:内蒙古农业大学,陈洁,张晓霖,陈燕草莓生物技术研究进展J江西农业,():杜尚广,余波木薯的组织培养与快繁体系建立J分子植物育种,():陶兴魁,高贵珍,张兴桃,等正交实验在蓝莓组培培养基筛选过程中的应用J安徽工程大学学报,():,白俊峰用正交实验探究不同激素浓度组合对地被菊花序轴组织培养的影响J生物学通报,():邓成军,张少华,巴音克西克,等正交实验在红枣组培快繁中的应用J新疆林业,():李彦连,张华丽,赵强,等芡实组培一步成苗技术研究J北方园艺,():梁晖辉铁皮石斛工厂化育苗技术体系优化研究D南京:南京农业大学,闫学彤,郑珂媛,王可佳,等八仙花一步成苗离体培养方法J植物生理学报,():李先良,李居宁,彭春雷,等荆半夏叶柄一步成苗组培快繁体系的优化J江苏农业科学,():赵春莉,姚思扬,王嫚,等应用响应面法优化软枣猕猴桃的一步成 苗 培 养 基 J江 苏 农 业 科 学,():O p t i m i z a t i o nf o rT i s s u eC u l t u r eC u l t i v a t e dS e e d l i n gT e c h n o l o g yo fS t r a w b e r r yS t e mT i pWA N GY u,MUY u n h u i,H O UR u i n i n g,L I U W a n d a,T A N W e i,Y UF e i(H o r t i c u l t u r a lB r a n c h,H e i l o n g j i a n gA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,H a r b i n ,C h i n a)A b s t r a c t:S t r a w b e r r ys t e mt i pt i s s u ec u l t u r ea n ds e e d l i n gc u l t i v a t i o nt e c h n i q u e su s u a l l yu s et h r e et y p e so fc u l t u r em e d i ao f i n d u c t i o nd i f f e r e n t i a t i o n,p r o l i f e r a t i o n,a n dr o o t i n g,a n dt h ep r o c e s s i sr e l a t i v e l yc o m p l i c a t e d I no r d e r t oe x p l o r eau n i v e r s a l c u l t u r em e d i u mt h a tc a nb eu s e df o rb o t hs t r a w b e r r ys t e mt i pi n d u c t i o nd i f f e r e n t i a t i o n,p r o l i f e r a t i o n,a n dr o o t i n gc u l t i v a t i o ns t e p s,a n d f u r t h e r s i m p l i f y t h eo p e r a t i o np r o c e s s,t h e mms t e mt i p so fs t r a w b e r r y R e dF a c e w e r eu s e da s t e s tm a t e r i a l,a n dg r o w t hh o r m o n e sw e r e u s e dw i t h B A,T D Z,N A A,I A Aa n d I B Aa t f i v ed i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s,a n d t h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t o fL()w a s a p p l i e d T h eg e n e r a l c u l t u r em e d i u mf o r i n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o n,p r o l i f e r a t i o n,a n dr o o t i n gc u l t u r eo f s t e mt i p sw a ss e l e c t e da sM S B A m gLT D Z m gLNAA m gLI AA m gLI B A m gLT h ei n d u c e dd i f f e r e n t i a t i o nr a t ew a s ,t h ev a l u ea d d e dc o e f f i c i e n tw a s ,a n dt h e r o o t i n gr a t ew a s K e y w o r d s:t i s s u ec u l t u r e;c u l t i v a t e ds e e d l i n g;o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t t;m e d i u mo p t i m i z a t i o n