幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究_杨丹丹.pdf

第 36 卷第 6 期2022 年12 月长治医学院学报JOUNALOFCHANGZHIMEDICAICOLLEGEVol36No6Dec2022基金项目:山西省卫生健康委员会科研项目(2018121;2019138);山西省“1331 工程”协同创新中心提质增效建设项目(20215221);长治医学院科技创新团队项目(CX202001)作者单位:1 长治医学院第一临床学院(046000);2 长治医学院公共卫生与预防医学系作者简介:杨丹丹，女，在读硕士，研究方向:肠道菌群与肿瘤研究;通信作者:郑金平，男，教授，博士研究生导师，研究方向:环境与肿瘤、神经退行性病变研究，E-mail:zhengjp 。幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究杨丹丹1黄兴强1贾琳倩1朱东强1吴紫莹1郑金平2摘要目的:分析幽门螺杆菌(Hp)感染对健康人群肠道菌群的影响，探讨幽门螺杆菌感染对健康人群的潜在危害。方法:选取山西省长治市某医院健康体检人群中 Hp 检测呈阳性和阴性的人各 25 例为研究对象，收集个人基本信息表，留取粪便标本，采用微生物 16SrDNA 扩增子技术测定粪便肠道菌群。结果:Hp 感染阳性组与阴性组肠道菌群的 Alpha 多样性及 Beta 多样性均存在统计学差异(P0.05);在门水平上 Hp 感染阳性组疣微菌门及脱铁杆菌门丰度较阴性组减少，在属水平上 Hp 感染阳性组的粪杆菌较阴性组减少，差异均有统计学意义(P0.05);2 组之间共富集有 14 个显著差异的代谢通路，主要与丁酸盐的生成、糖代谢以及钴啉酸 a，c二酰胺生物合成代谢等途径有关;变形菌及 S24_7 菌群的 OC 曲线下面积分别为 76.9%、74.7%。结论:Hp 感染会改变健康人群肠道菌群的构成及多样性，使肠道菌群发生紊乱，增加某些疾病发生的风险;变形菌及 S24_7 菌属具有区分有无 Hp 感染的生物标志的潜力。关键词幽门螺杆菌;肠道菌群;16SrDNA中图分类号117文献标识码A文章编号10060588(2022)0640608Effect of Helicobacter Pylori Infection on Intestinal Flora in Healthy PopulationsYANG Dandan，HUANG Xingqiang，JIA Linqian，ZHU Dongqiang，WU Ziying，ZHENG JinpingThe First Clinical College of Changzhi Medical CollegeAbstractObjective:To analyze the effect of Helicobacter pylori(Hp)infection on intestinal flora and the potential diseaserisk in healthy individuals Methods:25 cases of Hp positive or negative were selected from a health check-up population in a hospi-tal in Changzhi，Shanxi Province respectively Personal basic information and stool samples were collected，and microbial 16SrDNAamplicon technology was used to determine fecal flora esults:There are significant differences in Alpha diversity and Beta diversi-ty of intestinal flora between Hp positive and negative groups(P0.05)At the phylum level，the abundance of verrucomicrobiaand deferribacteres was lower in the positive Hp infection group compared to the negative group The genus faecalibacterium was low-er in the positive Hp infection group compared to the negative group，and the differences were statistically significant(P0.05)Between the two groups，14 substantially different metabolic pathways were enriched，primarily related to butyrate synthesis，glu-cose metabolism，and cobalamin a，c-diamide biosynthetic metabolism The areas under the OC of Alphaproteobacteria and S24_7flora are 76.9%and 74.7%respectively Conclusion:Hp infection alters the makeup and diversity of the intestinal flora in healthypeople，which may cause intestinal flora disorder and increase the risk of some diseases Alphaproteobacteria and S24_7 have thepotential to be a biomarker to distinguish Hp infection positive from negativeKey wordshelicobacter pylori;intestinal flora;16SrDNA幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性菌，1994 年被世界卫生组织列为类致癌物12。Hp 通常是在儿童时期获得的，若不进行相关治疗有可能会终生携带。在 Hp 感染的人群中，大多数人表现为无症状感染，有 1%3%的人发展为胃癌3。有研究在动物模型中发现 Hp604第 6 期杨丹丹等幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究感染与肠道菌群之间存在联系45。Hp 感染不仅影响胃微生物群落结构，可能还具有全身效应，可改变远端肠道的微生物区系6。但 Hp 感染是否会通过影响健康人群肠道菌群的变化而增加致病的风险尚不清楚。本文通过对 Hp 感染和未感染的健康体检人群肠道菌群进行 16SrDNA 测序和分析，探讨 Hp 感染对健康人群肠道菌群的影响及意义。1对象与方法1.1研究对象选取 2021 年 8 月至 2022 年 4 月在山西省长治市某医院体检的经13C 或14C 检测为 Hp 阳性和阴性的健康人为研究对象各 25 例。本研究经长治医学院伦理委员会批准，所有入选者的问卷调查、粪便采集均得到本人的知情同意。纳入标准:(1)年龄18 岁，2 组按照年龄(3 岁)为匹配条件进行配对;(2)无消化道不适症状及其他重大疾病史;(3)3 个月内未服用过任何抗生素;(4)能获得粪便标本及相关个人信息。1.2粪便样本采集采集符合条件的研究对象粪便 50100 mg 中段粪便于灭菌后的容器中，并置于80 冰箱内保存。1.3粪便 DNA 提取及 16SrDNA 测序采用 Nanodrop 对 DNA 定量，通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳对 DNA 提取质量进行检测。PC 的扩增采用 Pfu 高保真 DNA 聚合酶(全式金公司，北京)。对 PC 扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为 Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为 Microplate reader(BioTet，FLx800)。根据荧光定量结果及各样本的测序量需求，对每个样本按照相应比例混合。采用 ILLumina TruSeq NanoDNA LT Library Prep Kit(Illumina 公司，加利福尼亚)制备测序文库。高通量测序上机前通过 Agi-lent 之后，通过 Quant-iTTMPicoGreen dsDNA AssayKit 在 Promega QuantiFluor 荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应 2 nM 以上。将合格的每个上机测序文库(Index 序列不可重复)进行梯度稀释后，根据相应测序量按一定比例混合，并经 NaOH 变性为单链;在 Illumina MiSeq/NovaSeq平台上对群落 DNA 片段双端(Paired-end)测序。使用 语言脚本，统计所有样本包含的高质量序列的长度分布。应用 QIIME2(2019.4)软件进行物种分类学注释。1.4统计学方法用 Chao1 指数、Observed species 指数、Shannon指数、Simpson 指数、Faith s PD 指数、Pielou s even-ness 指数和Good s coverage 指数进行 Alpha 多样性分析，并绘制成箱线图，通过 Kruskal-Wallis 秩和检验指数验证差异的显著性。通过 Jaccard 距离，Bray-Curtis 距离，Unweighted uniFrac 距离和 PCoA及 Adonis 差异分析进行 Beta 多样性分析;通过LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)分析寻找标志物种，检验水准=0.05。建立随机森林模型寻找属水平下不同组别的标志物种，并使用OC 曲线进行诊断预测，使用 PICUSt2(Phyloge-netic investigation of communities by reconstruction ofunobserved states)分析预测肠道菌群的潜在功能。2结果2.1一般情况研究对象按照年龄(3 岁)为匹配条件，Hp阳性组平均年龄(57.165.80)岁，Hp 阴性组平均年龄(57.846.08)岁，均为山西省长治市的汉族人群。Hp 感染阳性和阴性组之间性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、体质量指数等差异均无统计学意义(P0.05)。见表 1。2.216SrDNA 测序结果对 50 例研究对象的粪便样品进行高通量测序，样本序列有效长度范围为 48 441 bp，平均413 bp。将去噪或去噪后得到的 OTU 代表序列与数据库进行比对和分析，根据物种分类学注释所示(图1A)，Hp 阳性组的 OTU 总数为 25 224，OTU 平均数为 1 009;Hp 阴性组的 OTU 总数为 28 709，OTU 平均数为 1 148。通过分类单元数的统计(图 1B)，Hp阳性组肠道菌群有 7 个门，12 个纲，16 个目，28 个科，41 个属，38 个种;Hp 阴性组有 8 个门，15 个纲，20 个目，35 个科，49 个属，41 个种。2.3肠道菌群的 Alpha 多样性分析2.3.1稀疏曲线随着测序深度的增加，稀疏曲线末端趋于平坦，继续增加测序深度已无法检测到大量尚未发现的新 OTU，表明测序数据合理，测序深度足以覆盖大多数细菌，测序结果可反映当前样本所包含的多样性。见图 2。704长治医学院学报2022 年第 36 卷表 1Hp 阳性组与 Hp 阴性组基本信息表 例(%)因素Hp 阴性组(n=25)Hp 阳性组(n=25)2P性别男13(52)18(72)2.1220.145女12(48)7(28)饮酒是9(36)13(52)1.2990.254否16(64)12(48)吸烟是9(36)12(48)0.7390.390否16(64)13(52)糖尿病是4(16)9(36)2.5990.107否21(84)16(64)高血压是10(40)11(44)0.0820.774否15(60)14(56)BMI/(kgm2)18.51(4)1(4)3.0210.22118.52414(56)8(32)2410(40)16(64)A:物种分类学注释，横坐标为各样本，纵坐标为注释结果中最高注释分类水平分别为属的 ASV/OTU 数;B:分类单元数统计，横坐标为各样本，纵坐标为最高分类水平为属水平，各自含有的分类单元数。图 116SrDNA 测序结果HN:Hp 阴性组，HP:Hp 阳性组图 2稀疏曲线2.3.2Alpha 多样性指数分析包括 Chao1 指数、Faith s PD 指数、Shannon 指数、Good s cover-age 指数、Simpson 指数、Pielou s evenness 指数及Observed species 指数。其中 Chao1 指数、Observed_species 指数测定群落丰富度，Pielou s evenness 指数测定群落均匀度，Shannon、Simpson 指数值测定群落的多样性，Faith_pd 指数测定群落遗传多样性，Goods coverage 指数评估测序对群落中物种覆盖度。结果显示，Hp 阴性组 Chao1 指数、Faith sPD 指数均高于 Hp 阳性组，表明 Hp 阴性组菌群丰富度、遗传多样性均高于 Hp 阳性组，差异有统计学意义(P=0.039、0.049)。Hp 阳性组 Goods cov-erage 指数高于 Hp 阴性组，表明 Hp 阳性组在物种覆盖度方面优于 Hp 阴性组，差异有统计学意义(P=0.012)。见图 3。2.4肠道菌群的 Beta 多样性分析通过对所有样本进行距离矩阵 PCoA 分析、NMDS 分析以及组间差异分析并绘制成图来进一步反映 2 组菌群的 Beta 多样性。在 PCoA 分析中(见图 4A)，Hp 阳性组与 Hp 阴性组的菌群样本，在 PCoA1 轴上的投影距离较远，但在 PCoA2 轴上的投影距离较近，表明 2 组菌群在第一维度上具有较大差异，但在第二维度上相似;其中第一轴解释了约 23.4%的样本间差异，而第二轴则解释了约804第 6 期杨丹丹等幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究11.8%的样本间差异。与 HP 阴性组相比，Hp 阳性组的群落表现得更分散及无序。NMDS 分析(图 4B)，通过样本之间直线距离的远近，衡量群落组成结构的差异，以及通过 Adonis 组间差异检验(图 4C)结果显示，Hp 阳性组与 Hp 阴性组肠道菌群 的 整 体 组 成 结 构 存 在 显 著 性 差 异(F=1.081 537，P=0.044)。Alpha 多样性指数:每个 panel 对应一种 alpha 多样性指数，在其顶端灰色区域标识。每个 panel 中横坐标为分组标签，纵坐标为相应 alpha多样性指数的值。箱线图中各符号含义:箱的上下端线，上下四分位数(Interquartile range，IQ);中位线，中位数;上下边缘，最大值和最小值(1.5 倍的 IQ 范围之内的极值);在上下边缘外部的点表示异常值。P:Kruskal-Wallis 检验。HN:Hp 阴性组，HP:Hp 阳性组。图 3Alpha 多样性分析A:PCoA 分析;B:基于 jaccard 距离的 NMDS 分析;C:组间差异分析;HN:Hp 阴性组;HP:Hp 阳性组图 4Beta 多样性分析2.5肠道菌群的物种差异分析2.5.1肠道菌群组间差异分析根据 OTU 结果绘制了韦恩图(图 5A)，结果显示 2 组之间共有的OUTs 为 3 480 个，Hp 感染组的肠道菌群 OTUs 为13 122 个，对照组的肠道菌群 OTUs 为 16 737 个。2 组肠道菌群在门水平(图 5B)上主要集中在 4 个门类:厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacte-roidetes)、放线菌门(Actinobacteria)以及变形菌门(Proteobacteria)，占 Hp 感 染 组 和 对 照 组 的99.80%和 99.57%。2 组肠道菌群在属水平的分布如图 5C 所示。对丰度前 20 位的门水平和属水平中差异有统计学意义的菌群行丰度图分析，图 6所示，在丰度前 20 位的门中，Hp 阳性组疣微菌门(Verrucomicrobia)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)丰度较 Hp 阴性组减少，差异有统计学意义(P0.05)。在属水平 Hp 阳性组的普拉梭菌属较 Hp阴性组减少，差异有统计学意义(P0.05)。2.5.2肠道菌群的 LEfSe 分析与 Hp 阴性组相比，Hp 阳性组具有显著差异的是迟缓埃格特菌(g-Eggerthella)。在 Hp 阴性组具有显著差异的物种有 14 种，主要集中在疣微菌门(Verrucomicrobia)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、疣微菌目(Verru-comicrobiales)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、变形菌纲(Alphaproteobacteria)、普拉梭菌属(Faecalibacterium)、光岗菌属(Mitsuokella)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、脱铁杆菌纲(Deferribacte-res)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌属(Akker-mansia)、丁酸弧菌(Butyricimonas)以及 f_S24_7等。见图 7A。904长治医学院学报2022 年第 36 卷2.6潜在的肠道菌群生物标志物对 Lefse 分析有差异的标志物种进行 OC 曲线分析，评估肠道微生物群标志物种的诊断效果。结果表明 S24_7 及变形菌曲线下面积分别为74.7%(图 7B)、76.9%(图 7C)。A:韦恩图。每个色块代表一个分组，色块间重叠区域指示相应组间所共有的 ASV/OTU，每个区块数字指示该区块所包含的 ASV/OTU 数目;B:物种分类学组成(门水平);C:物种分类学组成(属水平)。横坐标为该分组名称，纵坐标为特定分类水平下各分类单元相对丰度。图 5物种组成及差异分析HN:Hp 阴性组，HP:Hp 阳性组;Hp 与 HN 2 组肠道菌群丰富度发生差异的菌群，在门水平，丰度前20 位的差异菌群为疣微菌门、脱铁杆菌门;在属水平上，丰度前 20 位的差异菌群为普拉梭菌;*P0.05图 6物种丰富度A:LEfSe 分析。纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标则以条形图直观地展示各分类单元的 LDA 分析对数得分值。分类单元按照得分值大小进行排序，以此描述它们在样本分组中的特异性。长度越长表明该分类单元的差异越显著，条形图的颜色指示了该分类单元所对应的丰度最高的样本分组;B:S24_7 OC 曲线;C:Alphaproteobacteria OC 曲线。图 7标志物种预测2.7随机森林分析对物种丰度排名前 20 的物种(图 8A)进行关联网络(图 8B)分析，结果显示菌群之间存在相互关联，其中普拉梭菌、罗氏菌属(oseburia)、拟杆菌属(Bacteroides)、粪球菌属(Coprpcoccus)、多尔氏菌属(Dorea)、副杆菌属(Parabacteroides)位于网络的关键节点，对其它菌群有着重要影响，他们大多为丁酸盐产生菌。2.8肠道菌群功能的预测本研究在关联网络图的分析中发现关联菌群与丁酸盐生产菌有一定关系，因此，我们通过使用 PICUSt2 分析预测 Hp 阳性组和 Hp 阴性组之间肠道菌群的潜在功能，并使用 STAMP 软件进行代谢通路差异分析(见图 9)。在 Metacyu 通路中发现在 Hp 阳性组与 Hp 阴性组中有 14 个显著差异的代谢通路，包括蔗糖生物合成 I、蔗糖生014第 6 期杨丹丹等幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究物合成、葡萄糖降解(氧化)、GDP-D甘油和D甘露庚糖生物合成、乙酰丁酸梭菌产酸发酵的超级途径、丙酮酸发酵产生丁酸、钴啉酸a，c二酰胺生物合成、6脱氧L甘露糖降解、腺苷钴胺素生物合成、(-)丁二醇生物合成、去甲基萘醌6 生物合成的超级路径、淀粉降解、壳多糖衍生物降解以及烟酸降解等代谢通路。A:为随机森林分析。柱状图横坐标为物种对于分类器模型的重要性打分值，纵坐标为在属水平的分类单元名;热图展示了这些物种在各分组中的丰度分布。从上到下，物种对模型的重要性依次递减;可认为这些重要性靠前的物种是组间差异的标志物种;B:为关联网络。节点(node)代表样本中的菌群，节点大小与其丰度呈正比，以不同的颜色标识前 10 个节点最多的模块(module);节点间连线表示被连接两个节点之间存在相关性。图 8关联网络分析Metacyu 代谢通路图，左边柱状图代表某代谢通路的丰度，分别占 2 组样本中所有代谢通路的百分比。图 9代谢通路预测3讨论Hp 作为定植于人类胃黏膜的一种微生物，世界上大约有一半或更多的人感染 Hp7，大多数在其一生中表现为无症状。有人提出 Hp 感染通过调节胃酸分泌和免疫反应来间接影响胃肠道微环境，改变微生物组成8。人体肠道微生物群在维持人体健康，包括在营养吸收、能量代谢以及抵御病原体方面有着重要的作用911。有研究认为，Hp 分泌的毒力因子细胞毒素相关基因 A(CagA)可诱导肠道微生物失调12。本研究进一步通过对健康人群肠道菌群的分析，观察感染 Hp 对肠道菌群的影响及潜在的致病风险。Alpha 多样性分析结果显示，Hp 阴性组肠道菌群的丰富度、遗传多样性均高于 Hp 阳性组，差异有统计学意义。菌群的高多样性通常被认为是肠道微生物群健康的指标，而多样性下降则与较差的健康或不健康的习惯有关。在 Beta 多样性分析中，距离矩阵 PCoA 分析表明 2 组菌群在第一距离维度上存在显著差异，以及对 NMDS 进行 Adonis组间差异分析，表明 Hp 感染阳性组与 Hp 感染阴性组 2 组肠道菌群的整体组成结构存在显著性差异。PCoA 分析图显示，Hp 感染使肠道菌群的分布变得离散、无序。Alpha 多样性及 Beta 多样性的分析说明 Hp 感染会导致肠道菌群的丰富度以及组成结构发生显著改变。2 组肠道菌群在门水平上的差异主要集中在 4个门类:厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门。厚壁菌门与拟杆菌门的比例与疾病的易感性有关13，其中拟杆菌门被认为与炎症性肠病相关1415。通过对菌群的 Lefse 分析发现，Hp 组显著富集迟缓埃格特菌。迟缓埃格特菌属于放线杆菌门的一种，不仅与炎症的发生有关1617，还可以导致甘油三酯的升高、高密度脂蛋白的降低18，与高脂血症的发生存在紧密联系19。在 Hp 阳性组114长治医学院学报2022 年第 36 卷丰度显著降低的菌群有粪杆菌属、丁酸弧菌、疣微菌门、黏液阿克曼氏菌等。普拉梭菌属中的普拉梭菌以及丁酸弧菌都属于丁酸盐生产菌，丁酸是一种短链脂肪酸，具有抗炎、缓解肠道炎症以及维持肠道屏障完整性等作用20。其作用机制是丁酸盐通过结肠细胞上的单羧酸转运蛋白和溶质转运蛋白转运，充当组蛋白去乙酰化酶抑制剂并与特定的 G 蛋白偶联受体结合21，或调节肠道巨噬细胞的功能，下调内毒素诱导的促炎介质22。也有人提出，与丁酸盐生产菌有关的肠道菌群还可以调节骨代谢，增加成骨细胞数量，改善骨质疏松23。嗜黏蛋白阿克曼氏菌是疣微菌门下的一种，在降低肥胖症、2 型糖尿病、心血管疾病及其他代谢紊乱性疾病的发生有一定作用24。口服嗜黏蛋白阿克曼菌可改善小鼠代谢疾病的相关症状，嗜黏蛋白阿克曼菌有望成为治疗 2 型糖尿病和肥胖的候选药物25。通过关联网络分析发现，丁酸盐生产菌位于网络的关键节点，其他菌群多数通过影响丁酸盐生产菌来调节代谢。进一步对 metacyc 通路的分析，发现 Hp 阳性组抑制了丁酸盐产生、糖代谢以及钴啉酸 a，c二酰胺生成等代谢通路。Hp 感染阳性组的丁酸盐生产菌是显著下降的，这与代谢通路中 Hp 阳性组抑制丁酸盐生成是一致的。在一项对 782 名的拉丁裔人进行的研究表明，与 Hp阴性者相比，Hp 感染阳性组更易患上糖尿病26。Hp 可通过影响胃促生长素和瘦素等影响食欲的相关激素27，引起糖代谢紊乱有关，导致糖尿病的发生28。钴啉酸 a，c二酰胺，是合成维生素 B12 的前体。有研究表明，Hp 感染阳性患者的维生素B12(钴胺素)水平较低29，其机制可能是 Hp 感染通过破坏胃液分泌和酸化功能影响微量营养素、维生素的吸收。本研究结果提示，Hp 感染引起的肠道菌群紊乱可能增加肠道炎症、脂代谢和糖代谢紊乱及相关疾病的风险。对 Lefse 分析中差异明显的物种进一步进行(OC)曲线分析，评估肠道微生物群标志物种的诊断效果。结果显示变形菌和 S24_7 在一定程度上可以区分有无 Hp 感染，可成为感染的潜在生物标志菌。本研究分析了健康人群 Hp 感染引起肠道菌群的变化以及相关疾病潜在风险，发现 Hp 的感染可能与炎症的产生、抑制维生素的合成以及肥胖、糖尿病、心血管疾病、血脂异常等代谢性疾病的发生有一定关系，通过此研究，可为这些疾病的预防提供理论依据。参考文献 1FOX JG，WANG TC Inflammation，atrophy，and gastric cancer J J Clin Invest，2007，117(1):6069 2POLK DB，PEEK M J Helicobacter pylori:gastric cancerand beyond J Nat ev 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