沼液、化肥与秸秆配施对水稻产量和土壤细菌的调控影响_王礼伟.pdf

江西农业学报 2023，35（01）：8893ActaAgriculturaeJiangxiDOI:10.19386/ki.jxnyxb.2023.01.014沼液、化肥与秸秆配施对水稻产量和土壤细菌的调控影响王礼伟1,2，赵 晨1，周 刚1,2，尤 杰1，唐金陵1,2，王宏宝1*（1.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏 淮安 223001；2.农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014）摘 要:基于高通量测序平台Illumina Novaseq，分析了化肥组(CF)、秸秆还田结合化肥(S-CF)、秸秆还田结合沼液(S-BS)、沼液组(BS)等量氮素肥料处理和不施肥(CK)对土壤细菌群落结构及多样性的影响。结果表明：相较于CK，S-CF和S-BS处理的实际产量分别提高了16.40%、13.13%，试验组的主要优势菌门为变形菌门，其中-变形菌纲和-变形菌纲为优势亚群，藤黄单胞菌属为优势属；相较于CK，BS、CF和S-BS处理的变形菌门及所含藤黄单胞菌属相对丰度升高，S-CF和S-BS处理的绿弯菌门比其他处理更高；S-CF、S-BS处理的土壤细菌Chao1指数和Shannon指数较CK更高，而BS处理则显著降低(P0.05)，说明沼液和化肥配施秸秆有利于提高细菌群落多样性，农田管理应该避免长期施用单一种类肥料。综上所述，沼液、化肥与秸秆配施均能达到保持水稻产量的效果，秸秆还田有利于提高土壤细菌群落的相对丰度和多样性。关键词:沼液；秸秆；产量；群落结构；多样性 中图分类号：S154.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8581（2023）01-0088-06 Effects of Biogas Slurry,Chemical Fertilizer and Straw on Rice Yield and Soil Bacteria WANGLi-wei1,2,ZHAOChen1,ZHOUGang1,2,YOUJie1,TANGJin-ling1,2,WANGHong-bao1*（1.HuaiyinInstituteofAgriculturalSciencesofXuhuaiDistrictofJiangsuProvince,Huai an223001,China;2.KeyLaboratoryofCombiningFarmingandAnimalHusbandry,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Nanjing210014,China）Abstract:IlluminaNovaseqhigh-throughputsequencingtechnologywasusedtoanalyzetheeffectsoffertilizergroup(CF),strawreturningcombinedwithchemicalfertilizer(S-CF),strawreturningcombinedwithbiogasslurry(S-BS),biogasslurrygroup(BS)andnofertilizer(CK)onsoilbacterialcommunitystructureanddiversity.TheresultsshowedthattheactualyieldofS-CFandS-BSgroupwas16.40%and13.13%higherthanthatofCKgroup.ThedominantphylainthegroupswasProteobacteria,inwhich-Proteobacteriaand-Proteobacteriawerethedominantsubgroups,andLuteimonaswasthedominantgenus.ComparedwithCKgroup,therelativeabundanceofProteobacteriaanditscontainedLuteimonasincreasedinthegroupsofBS,CFandS-BS.ChloroflexiintheS-CFandS-BSgroupswashigherthanthatintheothers.ThesoilbacterialChao1andShannonindexesofS-CFandS-BSwerehigherthanthoseofCK,whileBSwassignificantlylower(P0.05).Thecombinationofbiogasslurryandchemicalfertilizerwithstrawcouldimprovethediversityofbacterialcommunity,andlongtermapplicationofsingletypefertilizershouldbeavoidedinfarmlandmanagement.Inconclusion,biogasslurryorchemicalfertilizercombinedwithstrawcouldalsomaintaintheyieldofricecomparedwithchemicalfertilizergroup.Atthesametime,thetreatmentofstrawreturningtofieldwasbeneficialtoincreasetherelativeabundanceanddiversityofsoilbacterialcommunity.Key words:Biogasslurry;Straw;Yield;Communitystructure;Diversity我国以占世界7%的耕地面积却投入了超过世界总量30%的化肥，而氮肥平均利用率仅为34.3%，与欧美国家的化肥利用水平相比差距较大1-2。沼液是畜禽粪便等经过厌氧发酵形成的产物，富含大量的氮、磷、钾、腐植酸等营养成分及微生物，是一种非常高效的有机肥料。近年来，在秸秆还田、沼液利用的研究主要集中于化学肥料的减量、沼液的代替施用和作物产量方面，而涉及土收稿日期：2022-10-15基金项目：淮安市农业科学研究院科研发展基金（HNY202108）；农业农村部种养结合重点实验室开发课题（202004）。作者简介：王礼伟（1989），男，江苏淮安人，助理研究员，硕士，研究方向为循环农业和生猪健康养殖。*通信作者：王宏宝。1 期王礼伟等：沼液、化肥与秸秆配施对水稻产量和土壤细菌的调控影响89壤微生物作用机理的研究鲜见。因此，在“减肥减药”背景下，开展秸秆还田、沼液代替化肥相关技术领域的研究，对探索土壤微生物参与氮磷循环、养分吸收和土壤矿化等过程，维持土壤生态系统健康稳定和提升土壤结构肥力等方面具有重要意义3。本研究通过等量氮素条件不同沼液、化肥与麦秸秆组合处理的试验，分析了施肥方式对水稻农艺性状、土壤微生物的影响，以期为农田生态系统的健康管理提供参考依据。1 材料与方法1.1 试验材料以水稻“淮香粳15”为试验材料，麦秸秆均来自江苏徐淮地区淮阴农科所科研基地，沼液取自江苏徐淮地区淮阴农科所循环农业实验室（表1）。秸秆不作任何操作。表1 耕层土壤及沼液的基本理化性质样品pH值有机质/(g/kg)全氮/(g/kg)氨氮/(g/kg)全磷/(g/kg)有效钾/(g/kg)田间持水量/%土壤质地耕层土壤7.830.4119.334.404.020.931.280.391.530.410.650.2423.474.74黄潮土沼液8.000.2436.513.140.840.490.600.141.420.281.680.34/1.2 试验设计于2021年6月20日进行定植处理，计算得出麦秸秆还田的单位面积重量约为7500kg/hm2，而试验得出全氮含量为6g/kg，折算后全氮45kg/hm2。当地水稻种植常规施化肥为15%15%15%的NPK酸性复合肥，施氮量为276.45kg/hm2，秸秆还田全氮占总施氮量的16.28%。试验共设置空白对照组和4个处理组，保持各处理组的施氮量总量一致：（1）对照组（秸秆不还田，不施沼液，不施化肥，CK）；（2）化肥组（100%化肥N，CF）；（3）秸秆还 田+化 肥 组（16.28%秸 秆N和83.72%化 肥N，S-CF）；（4）秸 秆 还 田+沼 液 组（16.28%秸 秆N和83.72%沼液N，S-BS）；（5）沼液组（100%沼液N，BS）。肥料运筹比例设置为基肥 分蘖肥=1 1，每个试验组重复6次。每个试验小区使用高40cm、长70cm、宽50cm的泡沫箱。其他管理方式根据水稻实际的生长需求进行管理。1.3 测定项目及方法1.3.1 水稻产量 在水稻成熟期，随机选取每个试验组平行小区连续5穴调查有效穗数。同样，每个试验组选择长势相近的植株统计有效穗、每穗粒数、千粒重。1.3.2 土壤总DNA提取 在水稻收割后立即进行土壤采样。取样方法采用五点取样法，各处理每个重复选取5个样点，去除样品中的杂物、混匀，过2mm筛。使用美国MoBio强力土壤DNA提取试剂盒提取总DNA，检测合格后放置于-80的冰箱中保存以备后续使用。1.3.3 特异性区域扩增测序 挑选细菌的16SrDNAV3V4区域进行多样性检测。DNA样本送至南京集思慧远生物科技有限公司，细菌16SrDNAV3V4区域扩增引物是338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3)、806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。PCR体系为总体系25L：加入DNA量10ng、10L2EasyTaqPCRSuperMix(TransgenBio，Inc)、正向和反向引物各1L，剩余补充ddH2O。反应参数为94预变性5min；94变性30s、55退火30s、72延伸1min，循环35次；72延伸8min。应用IlluminaNovaseqPE250进行高通量测序4-5。1.4 数据处理与分析采用SPSS19.0软件进行单因素方差(One-wayANOVA)和最小显著差数法(LSD)分析产量及多样性指数相关数据。物生物数据使用软件QIIME1.8.0进行优化处理，剔除碱基质量分值20、长度150bp的序列。使用Barcodes分析归类序列信息的聚类，设置OTU(Operationaltaxonomicunits)相似性为97%，形成不同物种基本操作分类单元。参照细菌的Silva数据库，分析每个OTU的物种分类信息。使用QIIME进行多样性分析。利用R语言包可视化统计样本在不同分类水平下的群落结构4-5。2 结果与分析2.1 不同施肥组水稻产量由表2可知，与CK相比，各个试验组的理论及实际产量均有所增加，以CF处理增加最多，理论产量和实际产量分别增加了19.3%、17.4%。CF、S-CF、S-BS处理间均无显著性差异，但与CK都存在显著性差异（P0.05）。2.2 土壤细菌OTUs分布Venn图能够反映样品之间共有和特有OTU数目，表现出样品之间OTU组成的相似程度。各处江 西 农 业 学 报35 卷90理土壤样品一共有8315个细菌OTU，共有OTU数量为4150个，占总数49.91%，这说明施肥对细菌OTU数量影响明显。CF处理特有OTU数量最多，而BS处理特有OTU数量最少（图1）。表2 不同施肥处理水稻产量处理有效穗/(万/hm2)每穗粒/个结实率/%千粒重/g理论产量/(kg/hm2)实际产量/(kg/hm2)CK28.8b121.2b91.2b27.3ab8675.6b8419.3bCF31.1a125.0a94.1a28.3a10345.9a9881.3aS-CF30.8a125.1a93.8a28.1a10159.2a9799.8aS-BS30.0ab127.2a92.1ab27.9a9805.6a9524.4aBS29.9ab125.4a91.6b27.8a9573.5ab9361.5ab注：同列数据不同小写字母表示在P0.05水平上差异显著。下同。图1 土壤细菌Venn图2.3 土壤细菌群落组成分析2.3.1 在门水平上的群落组成 由图2可知，每组均得到20个细菌种群（将相对丰度0.1%类群归类其他），其中5个细菌种群的占比较高（78.99%81.57%）：变形菌门(Proteobacteria)占38.19%46.46%，BS处理的相对丰度最高；拟杆菌门(Bacteroidetes)占9.69%14.16%，BS处理的相对丰度最高；绿弯菌门(Chloroflexi)占8.44%12.5%，但BS处理的相对丰度最低；其余2种细菌种群分别 为 酸 杆 菌 门(Acdiobacteria)和 放 线 菌 门(Acti-nobacteria)。相对丰度最大的变形菌门主要包括-变 形 菌 纲(Gammaproteobacteria，19.58%28.43%)、-变形菌纲(Alphaproteobacteria，12.05%15.38%)及-变形菌纲(Deltaproteobacteria，2.64%5.20%)。2.3.2 在属水平上的群落组成 在属分类的水平上（图3），6个相对丰度较高的属分别为藤黄单胞菌属(Luteimonas，0.89%5.91%）、拟杆菌属(Bac-teroides，1.52%4.86%)、赤杆菌属(Altererythrobact-er，0.69%2.52%)、厌氧蝇菌属(Anaerolinea，0.98%1.74%)、特吕珀菌属(Truepera，0.39%1.97%)、热单胞 菌 属(Thermomonas，0.39%1.84%)。丰 度 相 对较低且种类较多的稀有细菌类群是其中最主要菌群，最低为BS的67.91%。相对丰度/%图2 土壤样品门水平细菌群落分布情况相对丰度/%图3 土壤样品属水平细菌群落分布情况2.4 土壤细菌群落差异性分析由图4可知，CF与S-BS处理的距离相近，物种组成相似；CK与S-CF处理的距离相近，物种组1 期王礼伟等：沼液、化肥与秸秆配施对水稻产量和土壤细菌的调控影响91成相似；BS处理单独在一片区域；横坐标PCoA1可以解释60.11%，PCoA2可以解释19.18%，总共可以解释79.29%。图4 土壤样品细菌群落PCoA分析由图5可知，样本细菌群落结构主要分为2大类：第1类，CK、S-CF聚类在一个分支点，CF、S-BS聚类在一个分支点；第2类，BS处理。因此，S-CF处理的土壤细菌群落结构与CK相比无明显差异，CF、S-BS、BS处理的土壤细菌群落结构与CK相比，则具有不同的土壤细菌群落结构。2.5 土壤细菌群落多样性分析采用多样性指数来评估处理样本中微生物群落物种多样性和丰富度差异（表3），各个处理在97%一致性阈值下，土壤样品中细菌Observedspecies数为42705221。Chao1指数表明：S-BSS-CFCFCKBS，Shannon指 数 表 明：S-CFS-BSCFCKBS，Simpson指 数 表 明：BSCKCFS-BSS-CF（表3）。多样性分析结果表明，相比其他处理组，S-BS、S-CF处理土壤细菌群落多样性在整体上得到了提高。图5 土壤样品细菌群落UPGMA聚类树分析表3 不同施肥处理对土壤细菌多样性指数影响处理ObservedspeciesChao1ShannonSimpsonCK4808b5543.62b9.75b0.97aCF5221a5632.70b9.85b0.95aS-CF4965ab5657.75b9.98a0.92aS-BS4989ab5928.77a9.93ab0.93aBS4270c4927.82c9.09c0.99a3 讨论3.1 对水稻产量的影响秸秆经过还田处理后可以促进作物的生长和发育，相关研究结果表明：秸秆还田腐熟处理有利于水稻大穗形成，进而显著提高水稻的结实率和千粒重6。裴鹏刚等7发现，秸秆还田利用可以提高水稻的有效穗数指标。另外，沼液施用可以促进氮素向水稻籽粒转移，提高氮肥的利用效率，替代部分或完全取代化肥氮实现稳产或增产，并提高稻米蛋白质和矿质元素的含量8。但是，也有相关研究显示稻田中单独施用沼液反而不利于水稻生长，这是因为籽粒中的氮、磷积累量、磷效率、产量出现了不同程度降低9-10。本研究发现CF处理提升水稻产量的效果最为明显，其次为S-CF处理，均增加了有效穗、结实率，因此化肥仍是影响产量的重要因素，这与前人研究结论存在一致性11。S-BS处理虽然在理论及实际产量上低于S-CF处理，但无显著差异，也进一步说明沼液混施能够改善土壤结构、提高土壤肥力，基本上能达到传统化肥施用的效果12-13。然而，BS单独处理对水稻增产效果要明显低于其他施肥处理（CK除外），这可能与沼液中可能存在的As、Cr、Hg等重金属对作物生长、产江 西 农 业 学 报35 卷92量及土壤微生物环境产生不良影响有关14。3.2 对土壤细菌群落结构的影响与众多研究结论相似，土壤中绝大多数优势细菌种类基本相同，各处理组土壤中变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、放线菌门5大菌门的相对丰度占比较高15-16。变形菌门作为最优势细菌类群，不排除这与淮安地方土壤碱性特征有关，且施用沼液的pH值为8.0，进一步加大了土壤的弱碱性，周阳等17-19研究也同样表明了碱性土壤中变形菌门相对丰度最高。变形菌门中的-变形菌纲中含有丰富的与植物共生的固氮细菌，其对土壤中的氮、磷、硫和有机质循环利用均有促进作用，-变形菌纲具有突出的抗菌拮抗作用18,20。另外，-变形菌纲和-变形菌纲主要集中在根瘤菌目、鞘脂单胞菌目以及藤黄单胞菌目，在根瘤菌目中含有大量固氮作用和与植物共生的细菌，鞘脂单胞菌目中的菌属已经被证实能够分泌过氧化氢酶来提高植物的抗逆性21，藤黄单胞菌目中的菌属具有突出的拮抗作用22。在产量关联方面，CF处理中较高丰度的变形菌门，以及最高的理论和实际产量、Observedspecies数量，进一步说明单施化肥可促进水稻植株对氮素的有效利用进而提高产量。另外，CF、S-BS处理的土壤微生物群落结构变形菌门、拟杆菌门和绿弯菌门相对丰度相似，水稻产量无显著差异的特性也进一步解释丰富的群落结构和较高产量之间的正向关联。因此，BS处理中变形菌门虽然相对丰度最高，但是受到绿弯菌门、酸杆菌门相对丰度和群落多样性指标较低综合因素的影响，导致产量不足，说明菌群丰度和多样性可能都是影响产量的联合因素。在其他主要菌门方面，拟杆菌门的相对丰度仅次于变形菌门，本研究发现拟杆菌门的相对丰度越高，与作物产量变化及土壤细菌微生物多样性呈现相反的变化（CK除外），如BS处理的拟杆菌门相对丰对最高，但其理论和实际产量、生物多样性均为最低，S-CF处理反之，部分研究结果与周阳等17,23的试验结论一致。绿弯菌门已被证明可分解纤维素24，S-CF和S-BS处理中绿弯菌门显著增加，不排除由于这2组处理中添加秸秆的原因。Ramirez等25研究表明，施氮能够降低土壤pH值，使土壤酸化，进而导致酸杆菌门相对丰度下降。研究发现4个施肥处理组均降低土壤中酸杆菌门相对丰度，尤其是BS处理中土壤酸杆菌门相对丰度最低，仅为CK的1/3，这可能与沼液中含有的重金属离子有关14。酸杆菌门中的菌属因为具有以叶绿素为基础的光合作用，同时还参与了铁物质循环、单碳化合物的新陈代谢，故相对丰度与产量密切相关26，这进一步解释了单施沼液肥反而对水稻生产不利，影响水稻结实率和产量指标。在属水平上，各施肥处理均不同程度降低土壤中的稀有菌属的相对丰度，其中CF和BS处理土壤中稀有菌属相对丰度明显下降，表明长期单施化肥和沼液对土壤微生物的生态系统的功能稳定产生了不确定影响，而秸秆的添加有利于减少单施化肥或者沼液带来的负面影响。藤黄单胞菌属是已分类的最优势菌属，研究表明其对土壤中多种病原细菌具有突出的拮抗作用，BS处理显著增加了土壤中藤黄单胞菌属的相对丰度，说明沼液单独施用可以提高土壤代偿性，用以缓解单施带来的生物病原菌副作用27。另外，稀有菌属的占比在67.91%81.99%，说明土壤中依然存在大量微生物有待深入研究。3.3 对土壤细菌群落多样性的影响微生物群落多样性指数作为土壤生态特征的重要指标，细菌占土壤微生物总量的70%90%，对土壤养分的循环利用至关重要。本研究的S-CF和S-BS处理土壤细菌Chao1指数和Shannon指数较CK相比升高，BS处理却显著降低，说明秸秆配施沼液或者化肥有利于提高细菌群落多样性，实现土壤生态系统的“稳态”。单施沼液显著降低土壤细菌群落多样性，使土壤某些细菌富集或丧失，土壤质量降低，进一步佐证BS处理土壤细菌OTU数总量和特有OTU数量最少的原因，并且其微生物群落单独在一个PCoA区域和UPGMA分支，这与施河丽等28-29的研究结果一致。因此，在水稻的农田管理中应该避免长期施用单一种类肥料。4 结论沼液或化肥配施秸秆等量替代全化肥处理能够达到水稻稳产效果，但是略低于全化肥处理。沼液或化肥配施秸秆处理虽然降低变形菌门数量，但可提高其他菌门如放线菌门和绿弯菌门的数量，有利于提高土壤细菌群落结构的丰富度和多样性。参考文献：1 于飞,施卫明.近10年中国大陆主要粮食作物氮肥利用1 期王礼伟等：沼液、化肥与秸秆配施对水稻产量和土壤细菌的调控影响93率分析 J.土壤学报,2015,52(6):1311-1324.2 PadillaFM,GallardoM,ManzanoAF.Globaltrendsinnit-rateleachingresearchinthe19602017period J.ScienceoftheTotalEnvironment,2018,643:400-413.3 BurnsKN,KluepfelDA,StraussSL,etal.Vineyardsoilbacterialdiversityandcompositionrevealedby16SrRNAgenes:Differentiationbygeographicfeatures J.SoilBiol-ogy&Biochemistry,2015,91:232-247.4 周阳,黄旭,赵海燕,等.麦秸秆和沼液配施对水稻苗期生长和土壤微生物的调控 J.土壤学报,2020,57(2):479-489.5 王礼伟,汪国莲,王宏宝,等.沼液代替化肥对甜瓜生长及土壤微生物的影响 J.南方农业学报,2021,52(9):2498-2506.6 唐银生.秸秆还田对机插水稻群体特征及产量构成的影响 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