响应面优化微波协同双水相体...取咖啡豆中绿原酸的工艺研究_郑琰.pdf

现代食品现代食品XIANDAISHIPIN9797/工艺技术工艺技术 Process Technologydoi:10.16736/41-1434/ts.2022.24.024响应面优化微波协同双水相体系提取咖啡豆中 绿原酸的工艺研究Study on the Extraction of Chlorogenic Acid from Coffee Bean by Microwave Assisted Two-phase System Optimized by Response Surface 郑琰，赵丽娟（普洱学院，云南普洱665000）ZHENG Yan,ZHAO Lijuan(Puer University,Puer665000,China)摘要：为优化提取云南小粒咖啡豆中绿原酸的工艺条件，以微波辅助低级醇双水相提取体系，对云南小粒咖啡豆中的绿原酸进行提取研究。分别研究了乙醇体积分数、磷酸氢二钾质量浓度、料液比、微波功率和微波时间对咖啡豆中绿原酸提取率的影响程度，采用响应面法优化提取工艺，得到云南小粒咖啡豆中绿原酸的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数为 76.98%，磷酸氢二钾质量浓度为 0.14 gmL-1，料液比为 1 54.97（g mL），微波功率为 280 W，微波时间为 15.48 s，绿原酸提取率为 4.54%，与预测值 4.55%相近。关键词：咖啡豆；绿原酸；响应面优化；微波技术；双水相Abstract：In order to optimize the extraction conditions of chlorogenic acid from coffea arabica beans in Yunnan,the extraction of chlorogenic acid from coffea arabica beans in Yunnan was studied by microwave assisted low alcohol aqueous two-phase extraction system.The effects of ethanol volume fraction,dipotassium hydrogen phosphate mass concentration,material liquid ratio,microwave power and microwave time on the extraction rate of chlorogenic acid from coffee beans were studied respectively.The optimum extraction conditions of chlorogenic acid from Yunnan coffea beans were obtained by using response surface methodology.The ethanol volume fraction was 76.98%,the dipotassium hydrogen phosphate mass concentration was 0.14 gmL-1,the material liquid ratio was 154.97(gmL),and the microwave power was 280 W,Microwave time was 15.48 s,and the extraction rate of chlorogenic acid was 4.54%,which was close to the predicted value of 4.55%.Keywords：coffee beans;chlorogenic acid;response surface method;microwave extraction;aqueous two-phase system中图分类号：TS209咖啡是众多消费者喜爱的饮品，其营养价值一直备受关注，尤其是咖啡豆中所含的大量多酚类化合物已成为关注的重点1。咖啡豆中的活性物质极其丰富，绿原酸是其主要生物活性成分之一，具有降血压、抗氧化、抗病毒、清除自由基等功效，常应用于食药、化工等行业2-4。绿原酸在不同的植物中含量不同，以杜仲叶、蒲公英、葵花籽、咖啡豆中绿原酸类似物的含量较高5-7。绿原酸在新鲜咖啡豆中含量占2%8%，烘焙过后含量会因发生美拉德反应、焦糖化等化学反应降低。基金项目：2022 年度普洱学院咖啡研究专项项目（2022KFZX09）。作者简介：郑琰（1988），女，硕士，讲师，研究方向为分析化学。现代食品现代食品XIANDAISHIPIN9898/工艺技术工艺技术Process Technology目前国内以咖啡豆作为研究对象提取绿原酸的工艺研究相对较少，云南咖啡年产量位居全国前列，对咖啡豆中绿原酸提取工艺进行研究，提高绿原酸的产率具有很大的研究意义，有必要探究适合于云南咖啡豆中绿原酸提取的有效方法。相较于传统单一的溶剂提取技术，微波技术作为一种新发展起来的加热技术，具有提取速度快、对样品破坏小、体系受热均匀等特点8-9。作为新型的溶剂萃取分离技术，双水相萃取根据组分在两相间的选择性分配从而达到目标成分分离的目的，提取过程中能有效保护目标成分的生物活性，并且双水相萃取操作简单、反应速度快、选择性强、成本低、破坏小，对于天然活性物质的分离纯化，其效率更高，并且不会残留有机溶剂造成危害10-12。双水相萃取体系，若加以微波辅助，能有效提高提取率、减少反应时间和萃取成本，并且安全、环保13-16。本文根据双水相的特点，采用微波技术协同乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中的绿原酸，并采用响应面法优化提取体系，为云南小粒咖啡中绿原酸的提取奠定理论基础，为咖啡豆中的绿原酸资源利用提供参考。1材料与方法1.1材料与设备试剂：无水乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；绿原酸标准品（中国食品药品检定研究院）。仪器：紫外-可见分光光度计 UV-2600，岛津企业管理（中国）有限公司；格兰仕微波炉（P70F20CN3L-HP3，广东格兰仕微波生活电器制造有限公司）。咖啡豆样品：购于云南某咖啡公司，用蒸馏水将咖啡豆洗净，烘干，取出后粉碎成粉末，过 30 目筛，装袋密封备用。1.2实验方法1.2.1绿原酸标准溶液的配制分别准确移取不同体积的 100 gmL-1绿原酸标准储备液配制成浓度为 0 gmL-1、1.00 gmL-1、2.00 gmL-1、5.00 gmL-1、8.00 gmL-1、10.00 gmL-1的标准溶液，在 331 nm 波长处测定吸光度值，绘制标准曲线。1.2.2咖啡豆绿原酸含量的测定按一定比例配制乙醇-磷酸氢二钾双水相体系，加入准确称取的咖啡豆粉末样品，在一定微波功率下加热萃取，离心，取上清液稀释定容，在 331 nm 波长下测其吸光度，代入标准曲线方程，得到样品溶液中绿原酸浓度，按下式计算出样品的绿原酸提取率。=100%c VnXm（1）式中：X 为绿原酸的提取率，%；c 为样品中绿原酸浓度，gmL-1；V 为样液体积，mL；n 为提取液的稀释倍数；m 为样品质量，g。1.2.3单因素实验准确称取咖啡粉末样品 1.000 0 g，在固定其他因素不变的条件下，分别探讨不同乙醇体积分数（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、不同磷酸氢二钾质量浓度（0.1 gmL-1、0.2 gmL-1、0.3 gmL-1、0.4 gmL-1、0.5 gmL-1、0.6 gmL-1）、不 同 料 液 比（1 20、1 30、1 40、1 50、1 60、1 70）、不同微波功率（210 W、280 W、350 W、420 W、490 W、700 W）、不同微波时间（10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s）对小粒咖啡绿原酸提取效果的影响，并按照 1.2.2方法进行测定，计算绿原酸提取率。1.2.4响应面优化实验设计本研究采用 Design Expert 8.0.6.1 软件，以乙醇体积分数、磷酸氢二钾质量浓度、料液比、微波时间为变量值，以绿原酸提取率为响应值，建立模型，进行优化实验，通过对响应曲面图和等高线图进行分析，以获取优化参数，因素水平见表 1。2结果与分析2.1绿原酸标准曲线的绘制如图 1 所示，绿原酸标准曲线的线性回归方程为y=0.055 9x-0.004 1，相关系数值为 0.999 7，说明线性关系良好，标准曲线可用于后续数据分析研究，结果可靠。表 1响应面实验设计因素水平表水平因素A 乙醇体积分数/%B 磷酸氢二钾质量浓度/gmL-1C 料液比/（g mL）D 微波时间/s-1700.11 40100750.21 50151800.31 6020现代食品现代食品XIANDAISHIPIN9999/工艺技术工艺技术 Process Technologyy=0.055 9x-0.004 1R2=0.999 700.1000.2000.3000.4000.5000.60001.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00吸光度质量浓度/gmL-1图 1绿原酸标准曲线图 2.2单因素实验结果2.2.1乙醇体积分数根据单因素实验设计进行实验，由图 2 可知，当乙醇体积分数达到 75%时，咖啡豆绿原酸提取率得到最大值，为 4.05%，故初步选取 75%为最佳乙醇体积分数。3.503.603.703.803.904.004.105560657075808590提取率/%乙醇体积分数/%图 2乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响2.2.2磷酸氢二钾质量浓度由图 3 可知，磷酸氢二钾质量浓度在 0.2 gmL-1时达到最大值 4.09%，故初步选取 0.2 gmL-1为最佳磷酸氢二钾质量浓度。3.703.803.904.004.104.2000.10.20.30.40.50.60.7提取率/%磷酸氢二钾质量浓度/gmL-1图 3磷酸氢二钾质量浓度对绿原酸提取率的影响2.2.3料液比由图 4 可知，咖啡豆绿原酸提取率在一定的料液比条件范围内波动，当物料与溶剂的比例在 1 50（g mL）时，提取率达到在此范围内的最大值4.26%，而后逐步降低，故初步选取150（gmL）为最佳料液比。4.054.104.154.204.254.3010110120130140150160170提取率/%料液比/（gmL）图 4料液比对绿原酸提取率的影响 2.2.4微波功率由图 5 可知，微波功率在 210 280 W，咖啡豆中绿原酸的提取率急剧增加，于 280 W 达到最大值4.33%，故初步选取 280 W 为最佳微波功率。4.164.204.244.284.324.36140210280350420490560630700770提取率/%微波功率/W图 5微波功率对绿原酸提取率的影响 2.2.5微波时间由图 6 可知，微波时间在 10 15 s 内，咖啡豆绿原酸的提取率急剧升高且在 15 s 时达到了整个时间研究范围内的最大值 4.44%。故初步选取 15 s 为最佳微波时间。3.904.004.104.204.304.404.50510152025303540提取率/%微波时间/s图 6微波时间对绿原酸提取率的影响综 上 所 述，初 步 选 取 75%乙 醇 体 积 分 数、0.2 gmL-1磷酸氢二钾质量浓度、1 50 料液比、280 W 微波功率、15 s 微波时间的工艺条件用于后续优化研究。现代食品现代食品XIANDAISHIPIN100100/工艺技术工艺技术Process Technology2.3响应面实验结果2.3.1响应面实验设计方案及结果根据单因素实验的结果，以咖啡豆中绿原酸提取率为因变量，乙醇体积分数（A）、磷酸氢二钾质量浓度（B）、料液比（C）、微波时间（D）4 个因素为自变量，设计响应面分析水平实验，设计水平见表1，优化咖啡豆中绿原酸的提取条件。按照软件所设计的各因素条件进行试验，如表 2 所示，计算出相应绿原酸提取率。表 2响应面实验设计及结果表序号A/%B/gmL-1C/（g mL）D/s提取率/%180.000.2050.0010.004.05280.000.2040.0015.004.27380.000.1050.0015.004.55475.000.2050.0015.004.48570.000.2040.0015.004.11675.000.3060.0015.004.31780.000.2050.0020.004.32870.000.2060.0015.004.26975.000.2040.0010.004.121075.000.1050.0020.004.361175.000.1060.0015.004.501275.000.2060.0010.004.171370.000.3050.0015.004.241475.000.3050.0010.004.091575.000.3050.0020.004.421675.000.2050.0015.004.431775.000.1040.0015.004.311870.000.2050.0010.003.971975.000.2050.0015.004.522070.000.1050.0015.004.182175.000.2060.0020.004.432270.000.2050.0020.004.192375.000.3040.0015.004.292475.000.2050.0015.004.512575.000.2050.0015.004.462680.000.2060.0015.004.422775.000.2040.0020.004.262875.000.1050.0010.004.302980.000.3050.0015.004.302.3.2回归方程和方差分析利用 Design Expert 8.0.6.1 软件进行多元回归方程拟合方差分析，得到绿原酸的提取率（响应值 E）的回归方程为E=4.48+0.080A-0.046B+0.061C+0.11D-0.078AB+0.013AD-0.043BC+0.067BD+0.030CD-0.15A2-0.026B2-0.076C2-0.17D2由表 3 可知，本实验模型的 F 值为 28.52；回归方程达到显著（P 值 0.000 1），决定系数 R2=0.932 2，说明回归模型可靠。由表中的 F 值的大小可以看出这4 个因素对绿原酸提取率影响程度为微波时间乙醇体积分数料液比磷酸氢二钾质量浓度。表 3回归方程的方差分析表方差 来源平方和自由度均方F 值P 值回归 模型0.63140.04528.52 0.000 1A0.07710.0748.490.000 1B0.02510.02515.920.001 3C0.04410.04428.040.000 1D0.1410.1486.20 0.000 1AB0.02410.02415.170.001 6AC0.00010.0006.2510-41.000 0AD6.25010-416.25010-40.390.540 0BC7.22510-317.22510-34.560.050 80BD0.01810.01811.510.004 4CD3.60010-313.60010-32.270.153 9A20.1510.1592.14 0.000 1B24.47010-314.47010-32.820.115 2C20.03810.03823.810.000 2D20.1910.19121.86 0.000 1残差0.022141.58410-3失拟 误差0.017101.67710-31.240.450 6纯误差5.40010-341.35010-3总和0.6528注：P 0.05 为差异不显著；P 0.05 为差异显著；P 0.01 为差异极显著。2.3.3响应面图分析响应面图中图形曲面坡度的大小、等高线的形状和密集程度能直观反映出两个单因素之间的交互作用大小17。各个因素之间的交互作用对绿原酸提取率的影响见图 7 和图 8，可以据此分析 4 个单因素的交互作用。图 7 所示为乙醇体积分数分别与磷酸氢二钾质量浓度、料液比、微波时间两两之间对咖啡豆中绿原酸提取率的交互影响。比较乙醇体积分数与磷酸氢二钾浓度的交互影响可知，随着乙醇体积分数的增加，绿原酸的提取率变化幅度更大，说明乙醇体积分数相现代食品现代食品XIANDAISHIPIN101101/工艺技术工艺技术 Process Technology较于磷酸氢二钾质量浓度对响应值的影响更为显著。在乙醇体积分数与料液比两个因素的交互影响图中，咖啡豆绿原酸提取率随乙醇体积分数变化的曲面较料液比变化曲面陡峭，说明乙醇体积分数的影响大于料液比的影响。比较乙醇体积分数与微波时间两个因素的交互影，绿原酸提取率随两因素条件的变化均呈先增加后减小的趋势，微波时间对响应值的影响较乙醇体积分数稍大。图 8 所示为料液比、微波时间、磷酸氢二钾质量浓度 3 个因素两两之间对咖啡豆中绿原酸提取率的交互影响。比较 3 个因素对咖啡豆中绿原酸提取率的两两交互影响，可知料液比对咖啡豆中绿原酸提取率的影响大于磷酸氢二钾质量浓度；微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响明显大于磷酸氢二钾质量浓度的影响；微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响大于料液比的影响。（a）乙醇体积分数与磷酸氢二钾 （b）乙醇体积分数与 （c）乙醇体积分数与 质量浓度的交互影响 料液比的交互影响 微波时间的交互影响图 7乙醇体积分数与其他因素的两两交互影响图 （a）料液比与磷酸氢二钾 （b）微波时间与磷酸氢二钾 （c）料液比与微波 质量浓度的交互影响 质量浓度的交互影响 时间的交互影响图 8料液比、微波时间、磷酸氢二钾质量浓度 3 个因素的两两交互影响图综上所述，通过比较 4 个因素相互作用，它们对咖啡豆中绿原酸的提取率影响大小排列顺序结果与回归方程的方差分析表结果一致，微波时间对咖啡豆绿原酸提取率的影响最大，磷酸氢二钾质量浓度的影响最小。2.3.4实验条件的优化、预测和验证用 Design-Expert 8.0.6.1 软件进行分析，能够得到提取云南小粒咖啡豆绿原酸的最优工艺条件，以及最佳提取率的预测值，为了证明响应面优化结果的准确度，在最佳预测条件下进行验证实验，得到绿原酸平均提取率为 4.55%，验证值与预测值 4.54%相近，证明最佳预测条件下的工艺条件是合理的。3结论本文研究了微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中绿原酸的工艺条件，在单因素实验的基础上，用 Box-Behnken 响应面优化法设计模型，进行线性回归方程和二项式拟合，得到提取云南小粒咖啡绿原酸的最佳工艺条件为乙醇体积分数为76.98%，磷酸氢二钾质量浓度为 0.14 gmL-1，料液比为 1 54.97，微波功率为 280 W，微波时间为 15.48 s；在该优化条件下得到的云南小粒咖啡豆中绿原酸提取率为 4.54%，与预测值 4.55%相近，说明该方法对提（下转第106页）现代食品现代食品XIANDAISHIPIN106106/工艺技术工艺技术Process Technology35（3）：1-5.5 李鑫.马铃薯优良种质资源品质性状评价及 SSR分析 D.大庆：黑龙江八一农垦大学，2021.6 梁单.马铃薯抗性淀粉调节肠道菌群及改善肥胖的作用机制 D.北京：中国农业科学院，2021.7 王胜男.马铃薯全粉性质和应用性能研究 D.哈尔滨：哈尔滨商业大学，2018.8 易伟民.马铃薯淀粉废水中蛋白质回收及其水解物抗氧化性的研究 D.大庆：黑龙江八一农垦大学，2015.9 杨川.马铃薯啤酒的工艺技术研究 D.济南：齐鲁工业大学，2020.10 张霞.不同马铃薯品种块茎质地特性的研究 D.哈尔滨：东北农业大学，2021.11 吉春晖.藜麦啤酒的酿造工艺及其风味物质分析D.济南：齐鲁工业大学，2021.取咖啡豆中的绿原酸效果显著，本研究方法采用微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相体系提取云南小粒咖啡豆中绿原酸具有一定可行性，为云南小粒咖啡中绿原酸的提取及相关资源开发利用提供一定理论参考。参考文献1 龙文静.咖啡豆中多酚类物质的提制技术及抗氧化性能评价 D.长沙：湖南农业大学，2011.2 杨剀舟，翟晓娜，栾霞，等.响应面优化水-乙醇法提取云南咖啡生豆绿原酸工艺研究 J.粮油食品科技，2020，28（5）：156-162.3 胡皓，宋红坤，王继良，等.高效液相色谱法同时测定咖啡中 6 种绿原酸 J.食品安全质量检测学报，2018，9（7）：1634-1642.4 高林晓，文冬冬，郭蒙，等.响应面法优化水麻果中绿原酸提取工艺 J/OL.中国饲料：1-72022-10-19.https:/ 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