特医食品中VC检测关键控制点及稳定性研究_范春婷.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 1 期 142 研究探讨特医食品中VC检测关键控制点及稳定性研究范春婷#，殷耀#，张萍，陆慧媛*，张晓燕，沈伟健南京海关动植物与食品检测中心（南京 210019）摘要根据特殊医学用途配方食品的基质特殊性,确定其维生素C检测的关键控制点,优化特医食品中维生素C的高效液相色谱检测方法,并考察特医液态产品中维生素C的稳定性。在前处理过程增加蛋白的沉淀步骤,对蛋白沉淀试剂种类、用量进行研究;对特医液态产品进行稳定性试验,以考其维生素C的稳定性。结果显示液态和固态产品样品前处理时分别加入2 mL和0.5 mL的200 g/L乙酸锌溶液对蛋白沉淀效果最佳;优化后的方法对不同基质特医食品适用性良好,准确度高。对液态产品进行稳定性测试发现,加速、长期、高温40、高温60、不透光包装光照、透光包装光照和使用中稳定性试验中维生素C衰减率分别为30.6%80.3%,30.0%78.4%,12.1%18.2%,36.4%43.6%,7.00%,12.55%14.67%和18.1%19.0%。高温、光照及空气接触均会造成维生素C的大量衰减;用高纯氮气将样品容器中的空气排空,并且采用不透明避光材料包装更有利于保持特医食品中维生素C的稳定性。关键词特殊医学用途配方食品;高效液相色谱法;维生素C检测关键控制点;稳定性Critical Control Points and Stability Study of VC Detection in Food for Special Medical PurposesFAN Chunting#,YIN Yao#,ZHANG Ping,LU Huiyuan*,ZHANG Xiaoyan,SHEN WeijianAnimal,Plant and Food Inspection Center,Nanjing Customs(Nanjing 210019)Abstract According to the matrix particularity of food for special medical purposes,the critical control points of vitamin C detection were determined,the high-performance liquid chromatography detection method of vitamin C was optimized,and the stability of vitamin C in liquid products of food for special medical purposes was investigated.The protein precipitation step was added in the pretreatment process,and the type and dosage of protein precipitation reagents were studied;The stability test was carried out on the liquid products to investigate the stability of vitamin C.The results showed that adding 2 and 0.5 mL of 200 g/L zinc acetate solution to the liquid and solid products samples respectively had the best effect on protein precipitation;The optimized method had good applicability and high accuracy for it with different matrices.The stability test of liquid products found that the decay rate of vitamin C in the accelerated,long-term,high temperature 40,high temperature 60,opaque packaging lighting,transparent packaging lighting and in-use stability tests were 30.6%-80.3%,30.0%-78.4%,12.1%-18.2%,36.4%-43.6%,7.00%,12.55%-14.67%and 18.1%-19.0%.High temperature,light and air contact will cause a large amount of attenuation of vitamin C.Evacuate the air in the sample container with high-purity nitrogen,and use opaque light-proof material packaging to maintain the stability of vitamin C in Food for Special Medical Purposes.Keywords food for special medical purposes(FSMP);high performance liquid chromatography;the critical control points of vitamin C detection;stability维生素C（Vitamin C，VC）作为特殊医学用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，FSMP）（以下简称特医食品）中重要的营养元素，具有促进抗体形成、促进铁吸收、清除自由基等功能1。但因其对光、热、氧等极不稳定的特性2，使得快速、准确测定特医产品中VC的含量成为行业难点。根据现行国家标准3，特医食品中VC的检测方法GB 5413.1820104存在前处理过程过滤困难、滤液不澄清等缺点5。目前，VC检测方法还有二氯靛酚滴定法6-7、紫外分光光度法8-10和高效液相色谱法11-12。GB 5009.86201613包含了除荧光法之外的3种方法，但此标准适用范围也不包含特医食品，且前处理过程因特医食品富含蛋白质的特性，影响定量。食品及药品中VC的稳定性一直备受关注14-17，但目前未见关于特医食品尤其是特医食品液态产品中VC稳定性的研究。因此，研究并掌握特医食品中VC的降解规律，Behavior,2014,123:136-141.19 ARCHER J.Testosterone and human aggression:An evaluation of the challenge hypothesisJ.Neuroscience&Biobehavioral Reviews,2006,30(3):319-345.20 陈燃,李进华,朱勇,等.雄性黄山短尾猴攻击行为和粪便睾酮水平季节性变化J.动物学报,2008(3):393-398.21 刘金婷,刘思铭,曲路静,等.睾酮与人类社会行为J.心理科学进展,2013,21(11):1956-1966.143 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期找到可有效保持其稳定的方法成为特医食品研发、生产过程中的一个重要环节。此次研究对GB 5009.86201613的液相色谱法进行优化，将蛋白沉淀作为前处理的关键控制点，建立回收率稳定且更适于特医食品VC的测定方法；并对特医食品液态产品中的VC进行稳定性考察，为特医食品中VC的检测和研发提供技术保障及参考依据。1材料与方法1.1仪器与试剂Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；SQP Quintix224-1 cn电子天平（德国赛多利斯公司）；Sigma2-16K台式冷冻离心机（德国Sigma公司）。维生素C标准品（纯度99.98%，Sigma Aldrich）；磷酸、偏磷酸、乙酸锌、磷酸二氢钾，均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇，色谱纯（美国 默克公司）。所有特医食品样品均来源于南京海关动植物与食品检测中心送检的委托样品。1.2试验方法1.2.1溶液配制维生素C标准溶液配制（现配现用）：称取0.01 g（精确至0.000 1 g）维生素C标准品于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g/L）溶解并定容。偏磷酸溶液：称取20 g（精确至0.1 g）偏磷酸，溶于水并稀释至1 L。200 g/L乙酸锌溶液：称取200 g（精确至0.1 g）乙酸锌，加入水溶解至1 L。1.2.2样品前处理称取2 g（精确至0.001 g）样品于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 200 g/L乙酸锌溶液，加入20 g/L偏磷酸溶液震摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50 mL离心管中，超声提取5 min后，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 m水相膜，待分析。1.2.3色谱条件仪器及色谱条件参考GB 5009.86201613第一法 高效液相色谱法6.4仪器参考条件。1.3特医食品中VC稳定性研究依据特殊医学用途配方食品稳定性研究要求（试行）（2017版）的相关规定，选取不同特医食品液态样品，对其贮藏过程中VC含量的稳定性进行跟踪试验。1.3.1加速、长期和影响因素试验将样品分别存放于不同药品稳定性试验箱中（已通过相应温湿度检定），进行加速试验和长期试验，温、湿度分别为302，Hr 60%5%和252，Hr 60%10%。影响因素考察高温和高湿条件，条件分别为40，60 和光照4 500 Lx500 Lx。加速试验于第0，第1，第2，第3，第4和第5个月取出检测，长期试验于第0，第3，第6，第9，第12和第15个月取出检测，影响因素于第5天和第10天取出检测。1.3.2使用中稳定性试验将样品开封后，放置1 min，盖上盖子分别置于48 或252 条件下存放24 h，然后检测。1.4数据处理检测数据、色谱图、标准曲线图采用液相色谱仪自带工作站的数据分析软件处理，表格及图像数据统计分析用Excel 2019及Origin 8.5处理。2结果与讨论2.1维生素C标准物质分析参照GB 5009.86201613第一法，采用液相色谱仪对维生素C标准溶液进行分析，结果显示，目标物在8.4 min出峰，峰形尖锐，总分析时长13 min，在0.550 g/mL质量浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y=88.704 98X，相关系数0.999 96（详见图1）。按3倍信噪比确定此方法检出限为0.5 mg/100 g，10倍信噪比确定定量限为2 mg/100 g。图1维生素C液相色谱图及标准曲线2.2蛋白沉淀剂的选择拟在GB 5009.86201613第一法的基础上，增加蛋白沉淀步骤。常用的蛋白沉淀剂包括金属盐、有机溶剂等18。其中，乙醇可以使蛋白质和溶剂分子之间的相互作用减弱，使蛋白质发生聚集而沉淀19；乙酸锌可以通过降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出20。研究比较无水乙醇和乙酸锌对样品中蛋白质的沉淀效果。结果显示，无水乙醇含量达50%时沉淀效果较好，但此时色谱峰变宽，峰形差（详见#共同第一作者；*通信作者；基金项目：南京海关科技计划（2020KJ21）食品工业 2023 年第44卷第 1 期 144 研究探讨图2a），且回收率仅70%左右，经分析可能是提取液中较高含量的乙醇使VC在色谱柱上的保留性变差导致的；而乙酸锌既可以很好地沉淀蛋白，又不会影响VC在色谱柱上的保留性，色谱峰对称且尖锐（图2b）。图2样品及维生素C标准溶液色谱图基于上述结果，对乙酸锌的最佳使用量进行摸索。固态基质样品分别加入0.2，0.4和0.8 g乙酸锌，液态基质样品分别加入0.1，0.2和0.3 g乙酸锌。结果表明，固态基质样品中，0.2 g乙酸锌蛋白沉淀效果较差，提取离心后样品溶液仍浑浊（图3a），0.4 g和0.8 g乙酸锌可以获得较清澈的样品溶液（图3b，图3c），本着节约试剂的原则，选择0.4 g乙酸锌作为特医食品固态基质样品蛋白沉淀剂；而0.1 g乙酸锌固体即可在液态基质样品中达到较好沉淀效果（图4a），故选择0.1 g乙酸锌作为液态基质样品蛋白沉淀剂。注：a.0.2 g乙酸锌固体；b.0.4 g乙酸锌固体；c.0.8 g乙酸锌固体。图3固态基质特医食品乙酸锌蛋白沉淀效果注：a.0.1 g乙酸锌固体；b.0.2 g乙酸锌固体；c.0.3 g乙酸锌固体。图4液态基质特医食品乙酸锌蛋白沉淀效果为进一步提升可操作性，研究将乙酸锌固体配制成200 g/L乙酸锌溶液。将样品用偏磷酸溶液溶解后，分别加入2 mL（固态样品）、0.5 mL（液态样品），处理后的样品详见图5。试验发现可以较好地完成过滤和后续检测。注：a.固态样品；b.液态样品。图5乙酸锌溶液蛋白沉淀效果2.3不同特医食品样品加标回收试验为验证优化后方法的准确性，选取特医食品液态及固态基质样品共24个，进行加标回收试验。结果显示，液态基质特医食品加标回收率范围95.6%104.2%，固态基质特医食品加标回收率范围95.9%102.2%（详见表1），均符合GB/T 2741721的要求，表明此方法重复性较好，可用于液态和固态特医食品的检测。2.4维生素C稳定性试验2.4.1加速和长期试验中维生素C稳定性随机选取3个特殊医学用途全营养配方食品液态基质产品进行加速和长期稳定性试验，对VC的稳定性进行跟踪检测。每瓶样品在检测前均处于密封状态，一旦开瓶，立即进行检测。结果显示，经5个月加速试验和15个月长期试验后，VC含量均明显降低（图6，图7），衰减率分别为30.6%80.3%和30.0%78.4%；长期试验中，VC含量的降低在前3个月最为 145 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期明显，衰减率为18.3%31.0%；第9第15个月下降趋势逐渐趋于平缓，衰减率仅为3.4%4.3%。经分析，可能与样品中存在残氧量有关，初期VC氧化较快，随时间延长残氧剩余量减少，VC相对稳定。样品状态样品名称本底值/(mg100 g-1)加标量/(mg100 g-1)实测结果/(mg100 g-1)回收率/%回收率范围/%液态特殊医学用途全营养配方食品A17.171016.9597.995.6104.2特殊医学用途全营养配方食品A214.471529.90102.9特殊医学用途全营养配方食品A313.471528.1197.6特殊医学用途全营养配方食品A413.641528.3698.1特殊医学用途全营养配方食品A513.541527.8895.6特殊医学用途全营养配方食品A621.512040.6795.8特殊医学用途全营养配方食品A726.142046.0499.5特殊医学用途流质配方食品B125.412046.04103.2特殊医学用途全营养配方食品A819.542039.96102.1特殊医学用途流质配方食品B228.793058.0797.6特殊医学用途全营养配方食品A930.923061.75102.7特殊医学用途全营养配方食品A1032.443063.47103.4特殊医学用途全营养配方食品A1163.6750112.5197.7特殊医学用途流质配方食品B337.915086.9598.1特殊医学用途全营养配方食品A1228.715079.53101.6特殊医学用途肿瘤病全营养配方食品C167.5650119.68104.2特殊医学用途全营养配方食品A1364.9950114.8899.8固态特殊医学用途全营养配方粉D142.065090.8797.695.9102.2特殊医学用途全营养配方粉D249.885099.3198.9特殊医学用途全营养配方食品E172.2950120.7296.8特殊医学用途全营养配方食品E280.5050131.59102.2特殊医学用途全营养配方食品E383.81100183.5699.8特殊医学用途全营养配方粉D385.66100181.5595.9特殊医学用途全营养配方食品E491.19100191.1199.9表1不同基质特医食品维生素C加标回收试验结果图6加速试验维生素C含量变化图7长期试验维生素C含量变化2.4.2高温试验中维生素C的稳定性高温试验结果表明，温度对特医食品贮藏过程中VC的稳定性影响较大，在40 或60 保存10 d，VC的衰减率分别为12.1%18.2%和36.4%43.6%（图8和图9），且温度越高，衰减越快，如60 保存5 d，VC衰减率高达22.5%。这个结果与Guerra-Hernandez等22的发现一致，即婴幼儿液态奶在55 储藏90 d VC的含量远低于在20 下储存的产品。2.4.3光照试验中维生素C的稳定性选择实验室现有的两种包装材质，分析不同透光率的包材在特医食品中VC受光照影响中的作用，包装材质如图10所示，特医食品D使用不透光材质进行包装，特医食品E、F使用透光材质进行包装。结果显示，在4 500 Lx500 Lx照度下的第5天和第10天（图11），不透光材质瓶装的特医食品D衰减率分别为0.96%和7.00%，而透光瓶装特医食品E、F中VC的衰减率分别为7.95%，12.55%和15.89%，14.67%，由此可见光照对产品中VC的稳定性与包材的透光性有很大关系。这一结果与阎然等23的结果一致，即光照会降低NFC鲜榨橙汁中VC浓度，避光则显著减少VC的损失。另有研究表明光线会加速VC的降解，其降解反应速率符合一级反应模型24，且自然日光的照射比食品工业 2023 年第44卷第 1 期 146 研究探讨日光灯的照射损失更快2。图8高温试验40 维生素C含量变化图9高温试验60 维生素C含量变化图10不透光和透光包装材质示例图11光照试验维生素C含量变化2.4.4使用中稳定性试验维生素C的含量变化及保持其稳定性方式确认结果显示，样品开封后，无论常温或冷藏条件下特医食品F中VC含量下降均很快，衰减率分别为18.1%和19.0%，经分析，可能与样品开封后空气进入瓶中，导致VC发生氧化和降解有关，而与空气的影响比较，不同贮藏的温度条件对VC含量的影响不明显。王亚楠等25也发现菠菜汁中VC保存率与空气暴露时间的长短有很大关系，暴露时间越长，VC保存率越低。在氧气作用下，L-抗坏血酸极易被氧化为L-脱氢抗坏血酸，从而导致VC含量的衰减，这与Renner26的研究结果一致，当UHT乳中氧含量达到89 mg/L，28 d后UHT乳中VC的损失率达100%。图12使用中稳定性试验维生素C含量变化为确认样品中残氧及开瓶后产品中空气进入对样品中VC稳定性的影响，随机取一瓶特医食品液态样品，首次开瓶进行检测后立即充入高纯氮气（纯度99.999%），密封后冷藏保存，分别于不同时间进行检测，且在每次检测后都充入氮气保存，结果发现，样品中VC含量在3个月内仅下降2.79%，具体数据详表2。此结果进一步证实样品中VC的衰减与样品中残留空气有关。表2充入氮气保存特医食品样品后维生素C含量的变化结果检测时间样品中维生素C含量/(mg100 g-1)衰减率/%第0天36.10第10天35.90.55第20天35.71.11第30天35.51.67第40天35.41.95第50天35.32.23第60天35.22.51第70天35.12.79第80天35.12.79第90天35.12.793结论研究根据特殊医学用途配方食品的基质特性，确定了特殊医学用途配方食品中VC检测的关键控制点，利用蛋白沉淀剂净化样品，C18色谱柱分离，紫外检测器定量，建立了一种可准确检测特殊医学用途配方食品中VC含量的高效液相色谱检测法。经实际样品检测，该方法稳定、准确、高效。同时，对特殊医学用途配方食品贮藏过程中VC的稳定性考察结果表明，储存温度、光照、包材避光性及样品瓶中残留 147 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期的空气均可对样品中的VC造成影响，因此在特医食品的研发、生产以及储存过程中均应选择低温、避光场所，并采用隔氧、避光的包装材料，以保证产品中VC的稳定。参考文献：1 宋丽华,任晓燕.分析化学技术M.重庆:重庆大学出版社,2016,1:107-108.2 刘奕博.婴幼儿配方奶粉中维生素C稳定性研究D.长沙:中南林业科技大学,2013.3 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则:GB 299222013S.北京:中国标准出版社,2013.4 中华人民共和国卫生部 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定:GB 5413.182010S.北京:中国标准出版社,2010.5 张海红,王文特,田洪芸,等.分子荧光光谱法检测氨基酸配方和蛋白质水解配方特殊医学用途配方食品中的维生素C含量J.食品安全质量检测学报,2019,10(16):5334-5340.6 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