学术讨论—第五章-病原细菌.ppt

第五章第五章昆虫昆虫(knchng)病原细菌病原细菌昆虫因细菌侵染而引起的疾病称为细菌病。昆虫病原细菌是指其代谢产物或菌体本身对宿主昆虫有致病或致死效应的细菌类群，通常也称为杀虫细菌。细菌杀虫剂还具有以下一些特点：具有一定的特异性和选择性的杀虫作用，不杀伤天敌，对人、畜安全，不污染环境；易于和其他生物学手段相结合来进行害虫综合治理，能维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有相对(xingdu)较低的生产成本；可以通过生物技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用。第一页，共九十页。一、昆虫病原细菌的主要(zhyo)类群Bucher（1960）曾把昆虫病原细菌分为4个类型，但实际上这些类型可以大致划分为3类：专性病原体（obtigate pathogens）：在自然界中只能在特定的寄主昆虫体内增殖，很难在人工培养基上正常生长增殖。一般经口服感染，寄主范围较窄；如金龟子芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌。兼性病原体（facultative pathogens）：可在昆虫内增殖，也能在人工培养基上正常生长发育的细菌；Bt、Bs。潜在病原体（potential pathogens）：通常生活(shnghu)在昆虫的消化道内，通常情况下极少引起疾病，但一旦进入昆虫体腔，则可表现出较强的致病力。假单胞菌属、肠杆菌属。第二页，共九十页。据报道，杀虫细菌约有100多种，且新分离的杀虫细菌种类还在不断增加。伯杰氏系统细菌学手册所划分的33个细菌类群中，有9个类群的部分细菌种类具有杀虫活性。目前(mqin)已知的杀虫细菌主要有：芽孢杆菌属（Bacillus）梭状芽孢杆菌属（Clostridium）假单胞菌属（Pseudomonas）赛氏杆菌属（Serratia）链球菌属（Streptococcus）发光杆菌属（Photorhabdus）致病杆菌属（Xenorhabdus）第三页，共九十页。二、主要昆虫病原(bngyun)细菌的生物学特性（一）芽孢杆菌属（Bacillus）1.蜡状芽孢杆菌（Bacillus cerues）：是一种分布广泛的兼性腐生细菌，广泛分布于土壤中，从发病幼虫中也可分离到。其形态学特征与苏云金芽孢杆菌很相似，但不形成伴胞晶体。营养细胞大小为0.50.6 m1.56.0 m。寄主范围广泛，可侵染鞘翅目、膜翅目和鳞翅目等30余种昆虫。蜡状芽孢杆菌可产生(chnshng)-毒素（磷脂酶C），从而破坏宿主中肠细胞，使菌体进入昆虫血腔而引起败血症。另外，蜡状芽孢杆菌还能产生蜡样菌素（cerecine）和多种外毒素，对人和许多动物也有致病作用。第四页，共九十页。2侧胞芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）是一种好氧芽孢杆菌，可从蜜蜂幼虫、蛴螬、土壤和水中分离到。在上世纪初即发现该菌可引起蜜蜂幼虫发生欧洲腐烂病，后又发现该菌对黄腹侧蝇、烟草(ynco)甲幼虫有杀虫活性，而我国学者则首次报道了该菌对双翅目蚊幼虫的杀虫活性。徐婉学和范云六（1983）报道侧胞芽孢杆菌AS 1.864菌株对三带喙库蚊、尖音库蚊、一种库蚊、白纹伊蚊和中华按蚊的杀虫活性。Favret和Yousten（1985）进一步证实侧胞芽孢杆菌对蚊幼虫以及一种蚋（Simulium bivittatum）的杀虫活性，但发现该菌对粉纹夜蛾无毒性，而该菌对蚊幼虫的毒性又可分为病原性菌株和非病原性菌株。该菌的杀虫活性与其伴胞体无关，而与其细胞壁和原生质膜有关。第五页，共九十页。ToxicactivitiesofB.laterosporus921and615forlarvaeofmosquitoesStrainSpores/ml(107)LC50for:AedesaegyptiAnophelesstephensiCulexpipiens9214.05.6103(0.4103-11.9103)7.7103(6.9103-8.4103)5.6102(4.6102-13.5102)6152.45.3103(4.0103-6.5103)0.11103(0.05103-0.2103)4.6102(3.3102-10.4102)aStrainsweregrowninNickersonbrothat30Cfor72hwithshaking.bLC50sarepresentedasFWCdilutions.Thedataareaveragesoffourorfiveassays,with95%confidencelimits,asdeterminedbyprobitanalysis,inparentheses.第六页，共九十页。3.森田芽孢杆菌（Bacillus moritai）由日本的鲇沢启夫（1962）从蝇体中分离得到，是一种对多种蝇类幼虫致病的芽孢杆菌。营养细胞杆状，能运动，其芽孢囊明显膨大。森田芽孢杆菌幼虫的毒杀作用可能与菌体生长繁殖过程中产生的毒素无关，而是菌体在虫体内(t ni)繁殖的结果。在日本，森田芽孢杆菌制剂已作为商品用于卫生害虫的防治，商品名Labillus。防治家蝇，每克幼虫饲料中有107个芽孢，可抑制96%99%的成虫羽化。第七页，共九十页。4.幼虫芽孢杆菌（Bacillus larvae）是一种革兰氏染色阴性的兼性厌氧菌。营养细胞杆状，通常(tngchng)单个存在或呈链状排列，可运动。大小0.50.8 m2.05.0 m。形成芽孢时产生一种抗菌素，对其他种类细菌有抑制作用。幼虫芽孢杆菌是蜜蜂的专性病原菌，感染蜜蜂只是在幼虫饲喂时期，当敏感昆虫幼虫取食芽孢后，在24 h内芽孢即可萌发生长。其营养细胞通过溶解中肠细胞壁而进入血腔，并大量繁殖，从而导致幼虫发病直至死亡。幼虫感染的第一个症状是虫体失去正常的白色而变为淡褐色。第八页，共九十页。5.其他芽孢杆菌(gnjn)坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）对鳞翅目昆虫有致病作用蜂房芽孢杆菌（Bacillus alvei）对蜜蜂幼虫和几种蚊幼虫有致病作用短芽孢杆菌（Bacillus brevis）对蚊幼虫有致病作用坚强芽孢(y bo)杆菌（Bacillus firmus）第九页，共九十页。（二）梭状芽孢杆菌属（Clostridium）梭状芽孢杆菌一般简称为梭菌，是一类专性厌氧芽孢杆菌，其形态学上的突出特征是由于芽孢囊的膨大而使菌体呈梭形。营养细胞一般为直杆状，两端钝圆，单个或成短链存在。运动或不运动。Bucher等（1957，1961）首次报道分离到对昆虫有致病性的两种梭菌，即缩短梭菌（Clostridium brevifaciens）和天幕毛虫梭菌（Clostridium malacosomae）。缩短梭菌：大小(dxio)为0.91.3 m320 m，其芽孢囊不膨大，革兰氏染色阴性，其芽孢被昆虫取食后仅在中肠繁殖，不侵入血腔，虫体死后收缩变短，干燥而僵化。缩短梭菌的芽孢在昆虫中肠内经1624 h萌发成营养体，24 h后形成芽孢，36 h可在虫体粪便中观察到营养体和芽孢。目前尚不能在人工培养基上形成芽孢。天幕毛虫梭菌：营养体不运动，大小为1.0 m47 m；芽孢囊约呈纺锤形，专性寄生于加州天幕毛虫。第十页，共九十页。（三）假单胞菌属（Pseudomonas）是一类专性好氧的革兰氏阴性杆菌。该属具杀虫活性的有铜绿假单胞（Pseudmonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pfluorescens）、恶臭假单胞菌（Pputida）和败血性假单胞菌（Pseptica），它们均为昆虫的潜在病原菌。普遍存在于土壤、水、植物以及昆虫消化道中。铜绿假单胞菌俗称绿脓杆菌，是一种广泛分布于昆虫体内的革兰氏阴性小杆菌，其细胞大小为0.50.6 m1.5 m，无芽孢，单个或两个相连，或多个串连成短链状，具13根极生鞭毛，可运动。该菌可以产生多种对昆虫有毒性的胞外酶，不过(bgu)该菌在昆虫中肠中的侵染能力较差，但一旦进入血腔，则致病性很强。铜绿假单胞菌对双带黑蝗、透翅蝗、苹天幕毛虫等多种昆虫有致病性，其病原性与其产生的蛋白酶有关。败血性假单胞菌主要对一些金龟子幼虫和家蝇有致病作用。第十一页，共九十页。（四）赛氏杆菌属（Serratia）是广泛分布于水域、土壤、牛奶及其他食品中的一类革兰氏阴性杆菌，其中对昆虫有致病作用的有粘质赛氏杆菌（S.marcescens）、嗜虫赛氏杆菌（S.entomophila）、液化赛氏杆菌（S.liquefaciens）等几个种。粘质赛氏杆菌是已知的最小的杆菌种类之一，由于在常温培养(piyng)下能产生一种深红色的灵杆菌素，故又称为灵杆菌。据报道，该菌可侵染直翅目、鞘翅目、膜翅目等6个目的70多种昆虫。第十二页，共九十页。Serratia entomophila嗜虫赛氏杆菌可引起新西兰牧场(mchng)的一种主要害虫草地蛴螬（Costelytra zealandica）发病，感染幼虫在几天内停止进食，消化道变空，中肠变为琥珀色，并在46周内死亡。由于具有较高的杀虫活性，且对非目标生物和环境影响较小，因此，由该菌研制的商品Invide在新西兰获准登记，并用于草地蛴螬的防治。第十三页，共九十页。第十四页，共九十页。（五）链球菌属（Streptococcus）该属有代表性的昆虫病原细菌为粪链球菌（Sfaecalis），为一种机会致病菌，其有毒菌株与无毒菌株的血清型不同。该菌对舞毒蛾幼虫有致病作用。舞毒蛾幼虫吞食该菌后，12日便停止进食，虫体收缩，在315天内死亡。死虫干僵脱水(tu shu)，但不腐烂。第十五页，共九十页。（六）发光杆菌属（Photorhabdus）和致病杆菌属（Xenorhabdus）发光杆菌属和致病杆菌属的细菌几乎都是昆虫病原线虫的共生菌。其中致病杆菌属与斯氏属线虫（Steinernema）共生。发光杆菌属与异小杆线虫（Heterorhabditis）共生。二者的共同特征是均为革兰氏阴性、周生鞭毛、兼性厌氧、能运动的杆状细菌。大小约为0.32 m210 m。这些共生菌均具有两型现象，分别称为初生型（或型）和次生型（或型）共生菌。初生型细菌能支持线虫的大量繁殖(fnzh)，而次生型细菌不能与线虫共生，也不支持线虫在昆虫体内生长。初生型细菌不稳定，体外培养时极易转化为次生型。共生菌中已经发现有多种物质参与病原线虫对昆虫的致死作用，包括蛋白毒素、蛋白酶、抗生素类以及脂多糖等。该类共生菌既能产生对昆虫具有注射活性的杀虫蛋白，还可以产生具有口服活性的蛋白。Bowen等（1998）从P.Luminescens中分离到4种毒素蛋白Tca、Tcb、Tcc和Tcd，其中Tca和Tcd在对烟草天蛾的杀虫活性中占主导地位。第十六页，共九十页。第十七页，共九十页。第十八页，共九十页。三、苏云金芽孢三、苏云金芽孢(y bo)(y bo)杆菌杆菌第十九页，共九十页。苏云金芽孢杆菌：（Bacillus thuringiensis,Bt）分布广泛，革兰氏阳性，芽孢杆菌。1901年，石渡（S.Ishiwata）从患病的家蚕幼虫(yuchng)分离得到。猝倒杆菌 Bacillus sotto Bt猝倒亚种1911年Berliner从德国苏云金地区谷仓中患病的地中海粉螟幼虫体内分离到类似的细菌。1915年才正式命名为 Bacillus thuringiensis。此后分离出与苏云金杆菌类似的产生晶体的芽孢杆菌，被陆续命名为苏云金杆菌的各个亚种。第二十页，共九十页。（一）Bt的分类Bt的分类系统是由Barjac（1973）把鞭毛抗原作为分类标准(biozhn)而建立起来的，还以酯酶型、生理生化反应等指标，现在以RAPD、Ap-PCR等方法进行分类。Bt分成27个血清型，7个亚型；1994年45个血清型，13个亚型，58个亚种；1996年发现55个血清型；2002年70个血清型，83个亚种，我国11个血清型。第二十一页，共九十页。第二十二页，共九十页。第二十三页，共九十页。第二十四页，共九十页。（二）Bt发育(fy)的三个阶段：营养体芽孢囊晶体和芽孢释放 杀虫结晶蛋白（Insecticide Crystal Proteins，ICPs）或苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxin)第二十五页，共九十页。第二十六页，共九十页。第二十七页，共九十页。第二十八页，共九十页。（三）（三）BtBt的活性：的活性：BtBt产生的生物活性成分：胞内、胞外产生的生物活性成分：胞内、胞外 蛋白质：蛋白质：（-endotoxin、-exotoxin V VegetativeInsecticidalProteins，Vip）核苷类：核苷类：（-exotoxin）氨基多元醇：氨基多元醇：（ZwittermicinA，ZwA）对动物对动物(dngw)(dngw)中的节肢动物中的节肢动物(dngw)(dngw)门、扁形动物门、扁形动物(dngw)(dngw)门、线形动物门、线形动物(dngw)(dngw)门以及原生动物门以及原生动物(dngw)(dngw)门中的门中的600多种有害种类有选择杀灭活多种有害种类有选择杀灭活性。性。（鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等昆虫）昆虫）对癌细胞有杀灭活性。对癌细胞有杀灭活性。对微生物中的细菌、真菌等有活性。对微生物中的细菌、真菌等有活性。第二十九页，共九十页。苏云金素苏云金素又称乙体外毒素（-exotoxin）、热稳定外毒素、蝇毒素，或简称外毒素。McConnell等于(dngy)1959年首次发现，具有热稳定性质，经12015min不失活性，能溶于水，可透析。苏云金素不是蛋白质，而是一种核苷酸类物质。在菌体生长过程中先于芽孢和晶体产生，在24h达到最高量。该毒素包含两种核苷酸衍生物，为苏云金菌素A（thuringiensin A）和苏云金菌素B（thuringiensin B）。两者都含有一个腺嘌呤、一个核糖、一个磷酸、一个葡萄糖和一个别粘酸。羧基在菌素A是游离的，而在B则结合为内脂。实际上菌素B是菌素A的内脂。菌素A可加热失水而成B，而菌素B则可由碱水解而成A。无水的菌素A分子量是701，含水的为755。对家蝇毒力A大于B约8倍。第三十页，共九十页。营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins,VIP）：是最近几年发现的在某些Bt菌株营养生长期分泌的一类杀虫蛋白，对鳞翅目夜蛾科害虫具有广谱高效的杀虫活性。到目前为止，VIPs主要分为VIP1、VIP2和VIP3三种，它们的杀虫作用特征不同，其中VIP3蛋白的研究较多。VIP3是一类新型杀虫蛋白，组织病原学试验表明，敏感昆虫小地老虎喂食VIP3A 24h后，中肠上皮细胞发生变化；48h后，细胞严重受损，但仍然与基膜相连；72h后，与基膜完全脱离，细胞核溶解，细胞质膨胀、空泡化，昆虫中肠形成孔洞。在致病机理方面，VIP3与杀虫晶体蛋白ICPs完全不同，它以可溶性蛋白的形式存在于害虫中肠，与中肠上皮细胞上的受体结合，形成稳定(wndng)的离子通道，破坏中肠形成孔洞，造成昆虫死亡。受体现在已被分离，它与一类胞外糖蛋白具有同源性，是分子量为80kDa或100kDa左右的蛋白。第三十一页，共九十页。双效菌素（Zwittermicin A，简称ZwA）是近年来在苏云金芽孢杆菌中发现的一种(y zhn)具有抑菌和杀虫双重作用的多元醇类物质。对多种真菌和细菌都有抑制效果，对昆虫的毒性非常低，但对苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白具有显著的增效作用，可以使Cry1Cry6类的毒素蛋白增效1.51000倍，并且随着浓度的提高其增效作用也随之提高。第三十二页，共九十页。其他(qt)毒素：甲体外毒素（-exotoxin）、丙体外毒素（-exotoxin）辅助蛋白（helper proteins）肠毒素（enterotoxin）芽孢第三十三页，共九十页。杀虫晶体蛋白（ICP）基因的定位：ICP基因 cry基因基因的克隆(k ln)基因的分类基因的结构杀虫机制应用第三十四页，共九十页。杀虫晶体蛋白基因(jyn)的定位1953年发现杀虫活性与伴孢晶体有关(yugun)伴孢晶体由蛋白质组成：杀虫晶体蛋白，晶体蛋白，毒蛋白，-内毒素基因定位：大质粒、染色体 质粒消除、接合转移、分子杂交Bt质粒：多样性、112个、2200kb第三十五页，共九十页。杀虫晶体蛋白基因(jyn)的克隆1981年美国的年美国的Schnepf和和Whiteley年克隆了第一个杀虫晶体蛋年克隆了第一个杀虫晶体蛋白基因后，白基因后，1989年命名为年命名为cryIAa（cry1Aa1），对鳞翅目昆虫），对鳞翅目昆虫(knchng)有活性。有活性。1984年年Ward等克隆了对双翅目昆虫有毒的等克隆了对双翅目昆虫有毒的cyt1A基因。基因。1987年克隆对鞘翅目昆虫有活性的年克隆对鞘翅目昆虫有活性的cryIIIA（cry3A）。）。近年，发现一些具有特殊活性（对同翅目、膜翅目以及线形动物近年，发现一些具有特殊活性（对同翅目、膜翅目以及线形动物门和原生动物等具有活性）的门和原生动物等具有活性）的cry基因。基因。第三十六页，共九十页。克隆的克隆的Bt杀虫基因的数量杀虫基因的数量(shling)：1981第一个第一个cry基因基因1990年年461995年年1072000年年1982007年年374我国（我国（2000年至今）年至今）61个个,28%第三十七页，共九十页。苏云金杆菌毒蛋白(dnbi)基因的分类 1989年Hfte and Whiteley建立cry基因的分类系统(xtng)，以cry基因产物的杀虫谱和基因序列相似性为依据，将发现的42种基因分为5类，13个小组：cryI 鳞翅目 130kDacryII 鳞翅目和双翅目 70kDacryIII 鞘翅目 70kDacryIV 双翅目 70、130kDacyt(cytolytic crystal protein coden gene)，27kDa第三十八页，共九十页。1995年，年，Crickmore28届无脊椎动物病理学年会届无脊椎动物病理学年会分类分类(fnli)命名原则：命名原则：氨基酸同源性氨基酸同源性第一等级第一等级小于小于45%第二等级第二等级45%-78%第三等级第三等级78%-95%第四等级第四等级95%以上以上第三十九页，共九十页。杀虫晶体蛋白的结构杀虫晶体蛋白的结构(jigu)Cry1AaCry3AaDomainI7个个-螺旋穿孔，毒性螺旋穿孔，毒性(dxn)区区DomainII3个个-折叠，受体特异结合区折叠，受体特异结合区DomainIII2个个-折叠，毒性保护区折叠，毒性保护区第四十页，共九十页。Bt杀虫晶体蛋白的保守杀虫晶体蛋白的保守(boshu)区域区域第四十一页，共九十页。杀虫晶体蛋白的杀虫机制(jzh)伴孢晶体的溶解：伴孢晶体的溶解：昆虫肠道环境昆虫肠道环境(hunjng)pH原毒素的激活：原毒素的激活：蛋白酶消化蛋白酶消化60kDa核心片段核心片段与受体结合与受体结合BBMV（刷状缘膜囊）（刷状缘膜囊）穿孔和离子通道穿孔和离子通道发夹结构，发夹结构，“刀状刀状”模型模型肠细胞破坏而死亡肠细胞破坏而死亡离子梯度，细胞裂解离子梯度，细胞裂解第四十二页，共九十页。第四十三页，共九十页。第四十四页，共九十页。第四十五页，共九十页。世界上第一批苏云金杆菌(Bt)制剂的工业产品于1958年诞生于美国。目前已有60多个国家生产120多种商品，并成为世界上产量最大、防效最好、应用最广的微生物杀虫剂，广泛用于防治农业害虫、林业害虫、医学昆虫和仓贮害虫。在微生物农药行业(hngy)中苏云金芽孢杆菌杀虫剂成为支柱产业之一。优点：选择性强，对人畜、天敌、植物都十分安全，堪称“无公害”农药。Bt的应用的应用(yngyng)第四十六页，共九十页。第四十七页，共九十页。第四十八页，共九十页。第四十九页，共九十页。第一代第一代Bt杀虫剂的缺点：杀虫剂的缺点：杀虫蛋白类型比较单一、杀虫谱较窄：杀虫蛋白类型比较单一、杀虫谱较窄：虽然发现Bt可以(ky)杀死节肢动物门昆虫纲中的鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等，还可以(ky)杀死线形动物门、扁形动物门、原生动物门等，但就某一个菌株或亚种来说，它的杀虫谱还是比较窄，使用对象主要限于鳞翅目害虫。毒蛋白晶体易分解：毒蛋白晶体易分解：受自然环境影响，特别经紫外线照射极易分解破坏，田间杀虫效果通常仅能维持34天。第五十页，共九十页。Bt的基因工程(jyn gngchng)Bt基因工程(jyn gngchng)微生物的构建 抗虫转Bt基因植物第五十一页，共九十页。Bt 工程(gngchng)微生物 广谱Bt工程菌的构建(u jin)高效表达Bt工程菌的构建 延长持效期工程菌的构建 延缓抗性Bt工程菌的构建 多功能Bt工程菌的构建第五十二页，共九十页。(1)质粒的接合转移质粒的接合转移 为了增强Bt的杀虫范围，可消除毒蛋白表达水平较低的质粒而保留表达水平较高的质粒，或将不同亚种、不同菌株中的质粒通过接合作用加以复合。美国Ecogen公司1991年注册的生物杀虫制品Foilo F的有效成分EG2424。EG2424在孢子形成期产生cryA和cryA(c)蛋白，形成菱形和双金字塔形晶体(jngt)，对玉米螟与马铃薯甲虫害虫均有杀伤作用，已应用到土豆、茄子及其它农作物的生物防治中。广谱(un p)Bt工程菌的构建第五十三页，共九十页。cryIIIAcryIA(c)cryIIIAcryIIIAcryIA(c)EG2424(Foilo F)Bt.kurstakiHD-263-8Bt.morrisonEG2158第五十四页，共九十页。（2）杀虫蛋白基因的体外重组杀虫蛋白基因的体外重组重组DNA技术的迅速发展，为构建新Bt工程菌提供了更大的灵活性。许多杀虫蛋白基因不能通过接合作用进入一个新的受体细胞，因为并不是每一种(y zhn)质粒都可以通过接合进行转移。另外，对于几种昆虫特异的ICPs可能定位在同一质粒上。第五十五页，共九十页。Crickmore等（1990将对鞘翅目昆虫有效(yuxio)的拟步行甲亚种tenibrionis亚种的毒蛋白基因cryIIIA导入对双翅目有效的isreal亚种，新菌株不仅对鞘翅目以及双翅目蚊幼虫有毒外，还产生了一种新的杀虫活性，对鳞翅目的菜青虫也具有一定的杀虫活性。Gamel and Piot把鞘翅目特异的cryIII基因利用载体导入Bt subsp.kurstaki，转基因菌株不仅表达了高水平的鞘翅目杀虫活性，而且保持了对鳞翅目昆虫的杀伤作用。第五十六页，共九十页。第五十七页，共九十页。第五十八页，共九十页。第五十九页，共九十页。高效(o xio)表达Bt工程菌的构建（1）在无芽孢(Spo-)或经消除(或部分消除)质粒的受体菌中表达ICP基因cry1、cry2和cry11类基因是依赖于芽孢形成的ICP基因，它们的表达受到芽孢形成过程(guchng)的调控。cry3A是一类不依赖于芽孢形成过程的ICP基因。Cry3A蛋白在无芽孢的菌株中的产生量是野生菌株的2.5倍。通过质粒消除使菌株的毒力得以提高。第六十页，共九十页。（2）增加ICPs基因拷贝数 基因拷贝数对表达量的影响将cry3Aa基因连接于在细胞中有15个拷贝的载体上的表达量，明显高于仅4个拷贝的载体的表达量。（3）增加ICP基因的稳定性 质粒的不稳定性，外源质粒DNA对宿主DNA的影响。Kalman等 运用转化与转导相结合的方法将cry1C基因经HD-73整合到库斯塔克亚种菌株的染色体上，结果表明，所得到(d do)的工程菌株中cry1C基因能高效表达，同时稳定性增加。第六十一页，共九十页。（4）对启动子结构加以改造(gizo)对ICP基因启动子区域的改变，有可能是提高ICP基因表达量的一种有效方法。沉默基因的表达表达载体（5）利用辅助蛋白的增效作用 27kDa、20kDa(P20)蛋白质能显著增加杀虫蛋白基因的表达量，在Bt中对cytA表达及晶体形成具有增强作用。利用辅助蛋白的增效作用，可以构建高效表达工程菌。第六十二页，共九十页。延长(ynchng)持效期工程菌的构建 1991年Mycogen公司利用生物囊(biopacking)技术将Bt毒蛋白基因转化荧光假单胞菌，经发酵使工程菌大量产生毒蛋白，再采用加热与浸碘工艺将菌体细胞杀死，灭活的菌体细胞壁便形成一种微囊将毒蛋白包裹其中研制了一种Cellcap包囊(bo nn)系统，由于形成了包囊(bo nn)毒蛋白的有效保护包囊(bo nn)，延缓了Bt毒蛋白降解，杀虫持效提高了23倍。M-One，M-Trak，MVP等系列产品 第六十三页，共九十页。第六十四页，共九十页。第六十五页，共九十页。延缓(ynhun)害虫抗性工程菌 昆虫对不同种类ICP的抗性越来越引起人们的重视，抗性可能成为限制Bt杀虫剂发展的一个主要障碍。许多昆虫尤其(yuq)对Cry1类蛋白容易产生抗性。以色列亚种产生的CytA蛋白具有显著的减缓害虫对Cry4类蛋白的抗性。多种杀虫蛋白基因的协同作用。Cry1与Cry2第六十六页，共九十页。多功能Bt工程菌的构建(u jin)杀虫防病工程菌的构建中国农科院植保所将Bt基因转入荧光(ynggung)假单胞菌p303菌株，构建三价（cry1Ab、cry1Ac、cry2Aa）的转基因工程菌。玉米螟 小麦全蚀病杀虫固氮工程菌的构建慢生根瘤菌 双翅目昆虫将携带Bt以色列亚种ICP基因的质粒转移到慢生根瘤菌IG3554菌株并获得表达，从而构建成功一种具有杀虫和固氮双重功能的工程菌株。利用多寄主质粒pRK311将cry3A基因导入苜蓿根瘤菌中进行表达，也获得具有固氮和杀马铃薯甲虫活性的工程菌株。第六十七页，共九十页。蓝细菌E.coli农杆菌蜡状芽孢杆菌枯草(k co)芽孢杆菌多粘芽孢杆菌巨大芽孢杆菌Clavibater xyli subsp.cyanodontis（CXC）狗牙根木质部的一种共生细菌昆虫杆状病毒啤酒酵母第六十八页，共九十页。转转Bt基因基因(jyn)植物植物第六十九页，共九十页。1987年，首次将Bt毒蛋白基因(jyn)导入烟草中表达。最初杀虫晶体蛋白在植株上的表达量很低。1990年Monsanto公司对Bt毒蛋白基因进行修饰，改变了21的核苷酸序列，消除了不利于高效表达的因素，人工合成全长的Bt毒蛋白基因在转基因棉花植株中获得了高效表达，表达量从原来的占可溶性蛋白的0.001%提高到0.050.1%，比原来增加了50100倍，抗虫能力也大大增强。随后根据植物基因组的优化密码子对ICPs基因进行修饰、改造或人工全合成ICPs基因，将之导入烟草、番茄、棉花、玉米而获得ICPs高表达植株，其ICPs占可溶性蛋白超过0.2%，先后培育出高水平表达的植物。第七十页，共九十页。已获得的转已获得的转BtBt杀虫晶体蛋白基因杀虫晶体蛋白基因(jyn)(jyn)植物植物植物类别转Bt毒蛋白基因的物种粮、棉、油类水稻、玉米2、小麦、棉花2、大豆1、油菜1、花生、向日葵1果树类苹果1、梨、甜橙、柑桔、葡萄、越桔、洋李、胡桃1、草莓、山楂、黄实黑茶麓子、悬钩子、酸果曼1、唐棣、番木瓜、花楸果、板栗蔬菜类番茄1、茄子1、颠茄1、牛角椒、芹菜、芥菜、莴苣、白菜1、花椰菜1、卷心菜、芜箐、胡萝卜、豌豆、豇豆、鹰嘴豆、石刁柏、黄瓜、甜瓜、马铃薯2林木杨树1、落叶松、白云杉、枫香树、欧洲黑杨花卉类石竹、田旋花、长春花、玫瑰、兰花、矮牵牛、菊花其它烟草1、甜菜1、苜蓿1、桔味薄荷、三叶草、甘蔗 注：1示已进入(jnr)田间试验，2示已商品化第七十一页，共九十页。基因转基因植物转化方法抗虫测试结果cryIA(b)玉米基因枪法对玉米螟抗虫效果明显cryIA(b)棉花农杆菌介导法对棉铃虫植株保护率7075cryIA(b)番茄农杆菌介导法对烟天蛾0.25植株受害，对照9.5受害cryIA(c)棉花农杆菌介导法对棉铃虫植株保护率7087cryIA(c)欧洲黑杨农杆菌介导法对舞毒蛾死亡率80100cryIA(c)烟草农杆菌介导法对烟青虫死亡率80100cryIA(c)大豆基因枪法对蚜虫有很强杀虫活性cryIA(c)花生基因枪法对螟虫死亡率66100进入(jnr)大田试验阶段的部分转Bt基因植物的防治效果 第七十二页，共九十页。cry2cry3cry9cry1Ac+cry2Ab Bollgard抗虫棉 cry1A+CpTI 双价抗虫棉第七十三页，共九十页。四、球形芽孢(y bo)杆菌 球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，简称BS）属芽孢杆菌属（Bacillus），为兼性病原菌，在土壤、水和昆虫体中广泛存在。1965年，Kellen等首次报道球形芽孢杆菌对蚊幼虫有毒杀作用。20世纪(shj)70年代以来，各国学者从罗马尼亚、印度尼西亚、斯里兰卡和尼日利亚等国家分离到对蚊幼虫有高度致病力的球形芽孢杆菌菌株。20世纪80年代中期以来，我国学者广泛开展了利用球形芽孢杆菌防治蚊幼虫的研究和应用。第七十四页，共九十页。（一）形态(xngti)和生物学特性 1.形态特征 营养体：杆状，两端钝圆，周生鞭毛，大小0.640.86m1.54.18m，单个或两个相连。革兰氏染色反应不稳定。芽孢和伴孢体：芽孢球形或近球形，芽孢大小0.91.1m，端生，位于孢子囊的一端，孢子囊显著膨大呈槌状。有的菌株在形成芽孢的同时(tngsh)，还形成具折光性的伴孢体。伴孢体形状有菱形、不规则形、杆状或线状，有的菌株在一个细胞中可产生2个或2个以上的伴孢体。2.培养特征菌落在营养琼脂平板上为圆形，边缘呈细丝状，表面光滑、湿润而粘稠，半透明。第七十五页，共九十页。3.生理特性球形芽孢杆菌易于在人工培养基上生长，能在含蛋白质的不同培养基中生长。不同菌株对蛋白质浓度(nngd)的要求水平不同，有的菌株在蛋白质含量高的培养基中芽孢形成多，产毒能力强，而另一些菌株的产毒能力则被抑制。球形芽孢杆菌缺乏糖酵解途径和己糖磷酸化途径的葡萄糖激酶、己糖激酶以及磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，不能利用糖类作为碳源和能源。菌体生长还需要生物素和硫胺素。芽孢的形成，需供氧充足，还需要无机盐和大量的氨基酸或蛋白质作氮、碳源。球形芽孢杆菌最适生长温度为2428，1015菌体生长发育缓慢，超过35发育加快，但抑制芽孢的形成与毒素的产生。最适生长的pH为68。第七十六页，共九十页。（二）球形芽孢(y bo)杆菌的分类主要(zhyo)采用H抗原血清型作为指标，DNA同源性以及对噬菌体的敏感性。目前已有49个H血清型，有活性菌株属9个H血清型。大部分高毒力菌株属于血清型H5、H6和H25。菌 株来 源H-血清型杀蚊活性晶体基因MtxMtx2 KellenKKellenQBS-191SSII-1LAB881LP1-G1593M23622317-31691IAB59312314-22297(MR4)2173(ISPC5)IAB872美 国 美 国 印 度 印 度 加 勒 新加坡印度尼西亚 尼日利亚 泰 国 萨尔瓦多 加 勒 土耳其泰 国 斯里兰卡 印 度 加 勒 1ala1a2a2b335a5b5a5b5a5b5a5b69a9c9a9b2526a26b48低 低 高 中 高 中 高 高 高 高 高 低 低 高 中 高+第七十七页，共九十页。（三）对蚊幼虫(yuchng)的致病性及致病机理1.球形芽孢杆菌对蚊幼虫的致病性对库蚊属（Culex）、按蚊属（Anopheles）、伊蚊属（Aedes）和鳞蚊属（Psorophora）的蚊幼虫有致病性。大多数库蚊对球形芽孢菌最敏感，按蚊中等敏感，伊蚊最不敏感。库蚊中，淡色库蚊、致倦库蚊最为敏感，三带喙库蚊次之。2.球形芽孢杆菌产生的毒素产生两种对蚊幼虫具有杀虫活性的毒素，即二元毒素（Binary Toxin，简称Btx）和杀蚊幼虫蛋白（Mosquitocidal Toxin，简称Mtx）。二元毒素，又称伴孢体毒素，由两种蛋白质P51和P42组成，其相应的编码基因，即p51和p42，已经证实定位于染色体上。单独的P51和P42对蚊幼虫无毒，二者相互(xingh)协同，才能发挥最大的毒杀作用。Mtx毒素现在已发现有三种，即Mtx、Mtx2和Mtx3，Mtx毒素是从Bs SSII-1中分离出来的，由870个氨基酸组成，分子量为100kDa。Mtx2和Mtx3是从Bs SSII-1中分离得到的30.8和35.8kDa蛋白，Mtx毒素能被蚊幼虫肠道蛋白酶作用而酶解为27kDa和70kDa两个片段，相当于N端和C端区。27kDa片段包含的一个短区域对应于转膜功能域；70kDa片段包括3个约90个氨基酸的重复区，但功能不详。第七十八页，共九十页。3.球形芽孢杆菌的致病机理（1）致病机理：是通过毒素或与孢子囊有关(yugun)的毒素或芽孢实现的。球形芽孢杆菌对敏感幼虫的作用包括以下几个阶段：孢晶混合物被蚊幼虫吞食；伴孢晶体在蚊中肠蛋白酶和高pH的双重作用下溶解，释放出P51（51.4kDa）和P42（41.9kDa）的蛋白；P51和P42原毒素蛋白被进一步降解为43kDa和39kDa的活性多肽；毒性肽与胃盲囊和中肠后段上皮细胞结合；毒素进入上皮细胞通过目前尚不清楚的方式实现毒杀作用。（2）组织和细胞病理：致倦库蚊感染了C3-4l菌株，组织病理变化主要发生在胃盲囊、中肠前段和后段。中肠前段上皮细胞脱落、膨胀，进而破裂瓦解，而中肠后段上皮细胞病变则是脱落、膨胀，而后出现空泡，最后由于细胞脱落和破坏，中肠仅剩下完整的基底膜。胃盲囊的病变发生较迟，中肠中段细胞无明显的病变。第七十九页，共九十页。五、金龟子乳状病芽孢(y bo)杆菌日本金龟子芽孢杆菌（Bacillus popilliae）和缓死芽孢杆菌（Bacillus lentimorbus）是引起日本金龟子（Popillia japonica）等幼虫乳状病（Milky disease）的两种专一性杀虫芽孢杆菌，属芽孢杆菌属（Bacillus）。由于感染后菌体在幼虫血淋巴中进行繁殖并形成芽孢，而使病虫虫体呈不透明的乳白色，刺破虫体，流出的血淋巴为乳白色，故称之“乳状病乳状病”。乳状菌在世界上分布很广，北美、澳洲、亚洲以及欧洲均有发现。我国自1974年以来进行金龟子芽孢杆菌的研究，先后在河北、河南、山东、山西、陕西、黑龙江、福建等省陆续(lx)发现和分离到我国自己的菌株和若干新变种，如从华北大黑金龟子幼虫分出的山东变种（B.p.var.shandong）、从鳃金龟分出的蓬莱变种（B.p.var.penglai）、从丽金龟分出蒙古变种（B.l.var.mongolica）、从棕金龟分出鳃金龟变种（B.p.var.holotrichiae）等。同时进行了寄主范围、菌剂制作、应用技术和离体培养等方面的研究。第八十页，共九十页。（一）形态(xngti)特征和生物学特性1.形态特征(tzhng)日本金龟子芽孢杆菌营养体杆状，两端近圆形，单生或成对，不运动，活营养体大小为0.50.8 m1.35.2 m。革兰氏阳性。形成芽孢时营养体逐渐呈纺锤形，芽孢卵圆形，大小为0.91.3 m1.82.4 m。在形成芽孢的同时还形成一个具折光性的伴孢体，或称副孢（Paraspore）。伴孢体呈半球形、近立方形、三角形、菱形或不定形，大小为0.5 m0.5 m。缓死芽孢杆菌的营养体大小为1.0 m5.0 m，芽孢囊近似梭形，大小为1.4 m3.9 m，芽孢则为0.9 m0.8 m，没有伴孢体。2.生物学特征对营养要求苛刻，两菌很难在营养肉汤中生长形成有侵染力的芽孢。但在一些成分复杂的培养基，如Myp GP培养基上则可以生长。糖类是生长的能源物质，还需要11种氨基酸、硫胺素、巴比妥酸等，但不需要嘌呤和嘧啶。该菌专化性很强，能在被感染的蛴螬体内进行营养生长，并形成芽孢。芽孢可在体外存活多年，在干燥蛴螬体液涂片上保存芽孢，经过42个月后，加水湿润，洗下芽孢制成悬液，注射到健康蛴螬体内仍有高度致病力，但营养体在任何基质中都很快死亡。第八十一页，共九十页。第八十二页，共九十页。第八十三页，共九十页。（二）金龟子乳状病芽孢杆菌的分类