学术讨论—丙型肝炎疫苗.docx

丙型肝炎疫苗研究进展丙型肝炎的流行现状1989年，choo等1采用差异展示分析法首次获得人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的cDNA克隆，并证实它是输血传播的非甲非乙型肝炎的主要病原体。1991年，国际病毒分类学会将HCV归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV基因组变异较大，分为基因型、亚型、别离株、准种四个层次。世界范围内HCV主要有六个基因型，80多个亚基因型，流行情况与地理和人群分布相关。我国主要为lb，2a，3b型，其中以lb型最多。目前全世界约有4亿HCV感染者，约有70一80%的HCV感染者最终会导致慢性肝病(2)，随病程延长有一定比例开展为肝硬化和肝细胞癌。在兴旺国家，丙型肝炎占急性肝炎病例的20%，占慢性持续性肝炎的70%，占晚期肝硬化的40%，占肝细胞癌的60%，已经成为肝脏移植的主要病因，同时也是阻碍肝移植的重要原因。在美国，约400万人通过输血感染HCV，大多数转为慢性，美国的疾病预防控制中心估计该国每年有八千到一万人死于丙型肝炎及相关疾病，预计未来20年内死亡率将增加3倍以上，大大超过艾滋病。1991一1995年，我国一般人群HCV阳性率为2.15%，与血液接触频繁的人群HCV感染率高达50%以上，急性丙型肝炎转为慢性的机率为乙型肝炎的2一3倍，慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌患者HCV阳性率分别为13.3%、23.8%和13.3一14.5%，急性肝炎患者中合并HCV感染及重叠感染率为62.2%3。目前认为丙型肝炎主要通过血源传播，不洁血液制品、反复注射毒品导致的HCV感染占90%，反复使用污染的注射器，己经导致全世界230一470万人感染HCV。其他还有血液透析、生殖、性行为和职业传染等。HCV疫苗开发的必要性丙型肝炎病毒感染后，机体的免疫力下降，HCV会长期存在引起肝细胞内淋巴细胞浸润及肝坏死。更主要是HCV病毒基因高度变异性, 可逃逸机体免疫系统的识别, 因此, 给HCV 感染治疗带来了很大的困难。目前HCV 感染治疗方法, 局限于疗效欠佳的干扰素和利巴韦林，而且价格昂贵，无法普及。因此对HCV的治疗和预防现在成为全世界关注的重点。寻求一种高效预防和治疗HCV 感染的方法是当务之急。而疫苗是预防病毒性疾病感染和传播的有效手段，并可为抗HCV免疫治疗和基因治疗提供新的思路。HCV疫苗的研究概况早期的研究发现HCV具有慢性感染的趋势，而且康复期的患者和黑猩猩容易重复感染。对于这些问题人们现在有新的认识。首先，急性感染中有50%的概率会出现自发的去除，这种病毒的去除是与特异性的免疫反响相关的4。因此通过相应的免疫重新激发这种免疫反响是理想的选择。其次，在人体和黑猩猩中发现能够去除病毒的天然免疫5,6。虽然有些患者重复感染后开展为慢性感染，但绝大多数情况下，即使是不同的病毒株，康复期的患者和黑猩猩也不会重复感染，这说明至少产生了局部有效的免疫作用。研究说明患者和黑猩猩体内早期诱发的多特异性CD4+Th和CD8+T细胞反响可以有效去除病毒7。这两种类型T细胞都可以分泌IFN-γ，这种细胞因子在体外培养的细胞中对HCV复制子具有直接的抗病毒作用，在急性感染期那么可以大量减少病毒滴度。除此之外，利用外表携带HCV包膜蛋白的慢病毒/HCV假型颗粒(HCVPP)进行检测说明，患者体内的抗体不仅只与一种基因型的颗粒反响，而且可以与多种基因型的HCV颗粒反响8，说明患者体内存在范围较广的交叉中和性抗体。过去几年的研究结果有助于人们了解病毒与宿主之间复杂的斗争。这种病毒并不整合在宿主的染色体上，而是进化出多种机制来逃避宿主的反响9,10。HCV抑制NK细胞11，产生逃逸CTL和中和性抗体的突变体，它可以通过脂蛋白的伪装躲避病毒中和性抗体的结合12，并在持续感染的情况下，能下调病毒特异的效应T细胞。如果宿主体内能尽早诱导产生病毒特异且广谱(针对准种)的CD4+Th和CD8+T细胞反响，产生天然免疫的NK细胞，以及病毒中和性抗体，就会实现病毒的去除。在二十年前，人们对HCV的疫苗不抱有太大的希望，因为HCV不仅在体外无法培养，而且具有遗传异质性，由于HCV的RNA聚合酶缺乏校正机制，使病毒能迅速突变以适应环境，逃逸宿主的免疫系统。这样就给疫苗的研究带来许多的困难。直到最近，人们才刚刚建立了HCV的体外细胞培养模型13-15，因此还未能得到传统的灭活或减毒病毒疫苗。人们开始尝试亚单位疫苗的研究。亚单位疫苗范围很广，包括由病原体中纯化的抗原；携带编码抗原基因的质粒DNA;利用完整的重组病毒作为载体；以及化学合成的短肽。与传统的疫苗相比，亚单位疫苗具有以下优点：(l)去除了病原成分的疫苗不具有传染性：(2)根据特定目的设计的疫苗，不仅可以去除毒素，而且可以诱导重要的免疫反响去除感染：(3)可以应用于无法进行细胞培养的HCV疫苗研制中。科学家们为了研制有效的HCV疫苗，进行了各种尝试，采用了各种策略例如：重组病毒疫苗、DNA疫苗、融合蛋白疫苗、口服疫苗等。研究的热点包括包膜蛋白El/E2、核心蛋白C到非结构蛋白NS3以及NS5。但是目前暂时还没有一种成功的HCV疫苗问世。目前正在研制的HCV疫苗主要有两大类：重组蛋白疫苗和核酸疫苗。另外还有一些新型的HCV疫苗如病毒样颗粒疫苗、细胞表位疫苗等。重组蛋白疫苗在小鼠,猕猴,大猩猩体内进行候选蛋白疫苗的评价均有报道。最先被选择的抗原是HCV 编码的糖蛋白。动物细胞表达的两种蛋白El和E2形成了无二硫键连接的糖蛋白gPE1-gPE2异二聚体。与水/油构成的佐剂混匀后，免疫黑猩猩，可以诱导抗包膜蛋白抗体反响和Th细胞反响16。早期的实验说明如果用与E1、E2同源的病毒攻击，抗体滴度最高的黑猩猩可以得到完全的保护反响。这种保护反响与高滴度的E2抗体直接相关，该抗体能够阻止E2与CD81的结合。而且，尽管抗体水平较低的黑猩猩感染了HCV，但大多数阻断了急性感染，只有少数开展为慢性感染。由HCV-1克隆而来的抗原是否能保护异源的病毒株，这是最关键的问题。利用HCV-H株攻击9只黑猩猩，这一病毒株与HCV-1同样属于美国流行的la基因型。结果说明，通过RT-PCR检测，尽管没有一只黑猩猩免于急性感染，但是除了一只以外，其它所有黑猩猩都去除了急性感染并且没有进入慢性感染。相反，绝大多数没有免疫的对照组动物用HCV-H攻击后都携带了病毒，说明疫苗可以明显减少慢性的持续感染。这些实验结果说明gpE1-gpE2异二聚体疫苗是有效的，提示 HCVEl、E2包膜蛋白可能是HCV疫苗的必须成分。利用来自于HCV-1的NS3-4-5-核心蛋白免疫五只黑猩猩，能够诱导广谱(针对准种)的CD4+和CD8+T细胞反响17。但是利用异源的HCV-H进行攻击，结果说明，在缺乏抗包膜蛋白抗体的情况下，不能使五只黑猩猩免于异源的HCV-H的攻击。这一结果可能是由于免疫方法或免疫原没有充分诱导细胞免疫，而不是由于缺乏抗包膜蛋白抗体，因为细胞免疫反响对急性感染的去除并不依赖于抗包膜蛋白抗体的存在。这一结果也说明了能够同时诱导产生抗包膜蛋白的中和性抗体以及诱导广谱(针对准种)的CD4+和CD8+T细胞反响的疫苗组成可能更为有效。尽管这一次试验失败了，但从另一方面也说明了进入临床研究之前利用黑猩猩攻击模型进行试验的必要性。核心蛋白抗原是HCV疫苗的候选靶目标之一。该蛋白不仅是不同基因型HCV中序列最保守的蛋白质。即便HCV患者体内存在很强的CTL反响的条件下，HCV核心蛋白基因中也没有检测到突变。而且研究说明该蛋白可以诱发理想的体液免疫及细胞免疫应答。目前，利用ISCOMATRIX作为佐剂的核心蛋白已经进入I期临床试验，在猴和健康人体内能诱导针对核心蛋白内保守表位的CD4+和CD8+反响18，因此，它可以作为理想的靶位点。AnneM19等在研究中发现所有感染HCV后能够自发去除病毒的患者均产生了针对NS3蛋白的多特异性CD4+T细胞反响，多数患者产生了CD8+T细胞反响，提示该区抗原可用来设计诱导激活CD4+、CD8+T细胞。Sven等20用复制子系统将HCV的NS3基因导入树突细胞(DC)，在小鼠体内交叉启动CD8+T细胞免疫，从而使外源DC呈递的抗原成分经MHCI类途径有效激发CD8+T细胞应答。Wen等21等将Hcv核心基因和Ns3基因用腺病毒导入DC，发现核心蛋白和NS3蛋白能够在DC中表达，并能引起自体的淋巴细胞增殖。核酸疫苗除了蛋白疫苗，人们还开展大量关于DNA疫苗的研究。与传统蛋白质疫苗相比，DNA疫苗的最大特点是可表达经过程序化的蛋白, 并且是由宿主的APCs 表现出来, 只要将组织相容性复合物结合到脂肽片段上, 就可以诱导出CD4+ 和CD8+ T 细胞反响。此外, 被表达的蛋白以一种适当的形式分泌, 产生高水平抗体。该疫苗不但可产生中和抗体, 还会对感染有抵御作用, 并且也是一种预防性疫苗。DNA本身具有免疫佐剂的作用，并且可以长期稳定表达抗原，为迅速变异的病原微生物提供长久的交叉保护作用，特别适合于高度变异的HCV、HIV、流感病毒等疫苗的研究，因而具有重要的理论意义及应用价值。表达HCV核心蛋白的质粒在BALB/c小鼠中可以产生很强的CTL反响。Zhu22等研究了以HCV E1, E2基因构建的重组质粒免疫BALB/c小鼠的免疫效果。结果说明，3次免疫后，所有小鼠均出现了抗El、E2抗体，抗El抗体滴度最高可达1:320，而抗E2抗体滴度最高可达1:1280，免疫后小鼠的IFN-γ的分泌也显著高于对照组。Tedeschi等构建了E2重组DNA表达载体，免疫12只BALB/c小鼠后，通过免疫荧光法检测到E2蛋白的表达，于免疫后第2周开始可检测到抗-E2抗体(10/12)，第5周加强免疫后抗体水平持续升高，并至少维持8周，而未加强免疫的抗体滴度那么很快降低。虽然E2质粒疫苗不能在黑猩猩模型中产生去除病毒的免疫反响，但它能够防止慢性肝炎的开展。抗HCV非结构蛋白：S3、NS4和NSS的DNA疫苗能在BALB/c小鼠中诱发CD8+CTL反响。不同形式的HCV NS3DNA疫苗在HLA-A2.1转基因小鼠模型体内诱导免疫反响。表达NS3与溶酶体相关膜蛋白组成的融合蛋白的质粒能够诱导产生很强的CTL效应，并且持续很长时间。该模型也可用来检测HCV NS3转化的减毒鼠伤寒沙门氏菌的口服疫苗。这种方法可以诱导产生强的细胞毒和分泌IFN-γ的CD8+T细胞。目前针对HCV的DNA疫苗还存在许多问题，包括：肌肉注射DNA后抗原的表达水平很低，缺乏有效的抗原呈递，许多病毒蛋白的免疫原性很低，以及病毒表位的高突变率。为了解决这些问题，不仅要提高载体的表达效率，而且需要应用能够增强免疫反响的免疫刺激元件。为了提高疫苗的免疫效果，一些免疫方案仍处于不断研究之中，其中包括表位修饰，联合应用细胞因子、化学因子以及协同刺激分子作为疫苗佐剂，阻断抑制宿主免疫反响的通路等。病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒(VLP) 极大程度地模拟了天然病毒体的特性, 包括相似的形态、构象、理化特性和抗原特性, 已成为候选的重组蛋白疫苗研究热点之一。在昆虫细胞中合成的乳头瘤病毒VLP 和轮状病毒VLP 在免疫动物体内不仅能诱导产生高滴度中和抗体, 而且能诱生很强的细胞毒性T 细胞(CTL) 应答, 动物试验显示能提供保护性免疫。因此, 丙型肝炎病毒VLP (HCV -L P) 在昆虫Sf9 细胞内的合成及其良好的免疫原性, 给HCV 疫苗的研制带来了信心和希望。Baumert 等23用纯化的HCV-LP 1b 作为包被抗原, 用ELISA 方法研究发现HCV -LP 能和不同基因型(16 型)HCV 感染的慢性丙型肝炎患者血清反响, 滴度高达16000 64000。Xiang 等24研究显示HCV-LP 能与19% 抗体检测阴性但RNA 阳性的丙型肝炎患者血清反响。因此认为以HCV-LP作为捕获抗原建立的EL ISA 在实验室诊断急慢性丙型肝炎和预测干扰素疗效等方面可能有辅助作用。HCV-LP 免疫BALB/c 小鼠后发现如下特点：能诱导很强的体液免疫应答, 产生的抗C 和E2 蛋白抗体能与不同基因型HCV 的对应蛋白反响25。抗体的产生存在明显的抗原剂量依赖性。VL P 通过MHCI类途径, 诱导产生了抗HCV 的细胞免疫应答, 包括特异性CTL 应答和Th 应答26。HCV-LP免疫小鼠的脾细胞经C 蛋白刺激能引起强烈的淋巴细胞增殖反响, 而E1 和E2 蛋白对淋巴细胞增殖作用较弱。分别用稳定表达HCV C 蛋白或E1 或E2蛋白的P815 细胞作为靶细胞测定HCV-LP免疫鼠中的特异性CTL 杀伤活性, 证实E2 蛋白诱导CTL活性能力最强。加热变性的HCV 2L P 诱导的体液和细胞免疫应答很弱, 说明其免疫原性依赖于颗粒构象。含和不含p 7 蛋白的HCV-LP诱导的体液免疫应答根本相同, 但诱导细胞免疫应答能力后者较前者强。初步说明p 7 蛋白有调节TH1 和TH 2 型应答的功能。佐剂1668p t (含CpG 基序的寡核苷酸) 和DC2Cho l (阳离子脂类胆固醇复合物) 单独或者联合使用均不能显著加强HCV-LP的免疫原性。但Qiao 等27的研究那么显示使用佐剂10105 (含CpG 基序的寡核苷酸) 或AS01B (单磷酰脂类A 与QS21 的复合物) 均能增强HCV-LP 的免疫原性, 如果两者联合使用还可发挥协同作用, 使HCV -LP 的免疫效果更好。CTL表位疫苗HCV急性感染后，机体针对病毒产生了由中和抗体、CD4+Th细胞和CD8+CTL介导的适应性免疫反响，但是仍然缺乏有效的保护性免疫，使多数患者转成慢性感染。由于HCV包膜蛋白的高度变异，使产生的中和抗体难以有效地阻止和去除病毒感染，从而使得细胞免疫的作用尤为突出。人体感染HCV后，大多数人的细胞免疫应答很弱，因此开展为慢性肝炎，但是也有少数人的细胞免疫应答较强，可以去除病毒，完全康复28。越来越多的研究说明，特异性的CTL反响在去除HCV和组织病毒传播中起到最关键的作用。因此，HCV的CTL免疫表位研究和利用将对预防和治疗性HCV疫苗的研制起到关键作用。在HCV基因组中，C区基因最为保守，抗原表位较为集中，刺激产生的应答最强，是HCV疫苗的必须组份。核心区存在多个不同HLA(人类白细胞抗原)限制性CTL表位，主要集中在氨基端。报道最多的是29A2限制性3534aa，9098aa，132140aa。HCV E区存在中和抗原表位，是产生体液免疫的关键区域，但HCVE2区存在高变区(HVRI)。因此在研制针对E区产生中和抗体为主的预防性疫苗的研究一直进展缓慢。HCV非结构区存在多个优势CTL表位，尤其是HLA-A2限制性的CTL表位，经多种方法(四聚物染色分析、ELISPOT以及HCV患者的PBMC与合成肤的细胞毒分析实验等)证实，在诱导特异性的细胞免疫应答方面起重要作用。展望丙型肝炎疫苗是预防HCV感染的关键，但目前的候选蛋白质疫苗、DNA疫苗等尚多不能证实具有理想的保护作用。继续寻找HCV保护性B细胞及T细胞表位，深入探索HCV的致病机制将是制备有效丙型肝炎疫苗的根底。目前认为，理想的HCV疫苗应具有双重功能：1，可以产生交叉活性的体液免疫反响以中和感染的病毒准株；2，能够诱导产生强大的CTL免疫反响，去除逃过抗体中和反响的病毒株。由于HCV的高变异性以及结构抗原和非结构抗原均无法诱导有效的全面免疫应答。因此组合多个抗原表位并加以适宜的佐剂以增强多表位疫苗的免疫效果，体液免疫和细胞免疫应答，将成为HCV疫苗研制的重要开展趋势。内容总结1丙型肝炎疫苗研究进展丙型肝炎的流行现状1989年，choo等1采用差异展示分析法首次获得人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的cDNA克隆，并证实它是输血传播的非甲非乙型肝炎的主要病原体2VL P 通过MHCI类途径, 诱导产生了抗HCV 的细胞免疫应答, 包括特异性CTL 应答和Th 应答26