1、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量(hnling)(hnling)第一页,共十一页。实验实验(shyn)(shyn)目的目的n n了解(li(li oji)oji)考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理n n掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤第二页,共十一页。实验实验(shyn)(shyn)原理原理n n考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色,与蛋白质结合后呈蓝色,其最大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定的蛋白质浓度范围内,595nm处的光密度值与蛋白质浓度成反比,可用比色法进行蛋白质定量(dngling)(dngling)测定。第三页,共十一页。仪器(yq)(yq)和试剂n
2、 n1 1仪器:分析天平;吸管仪器:分析天平;吸管0.1ml10.1ml1、1ml21ml2、5ml15ml1;试管;试管1010个;个;722722型分光光度计;容量瓶型分光光度计;容量瓶100ml100ml、1000ml1000ml各一个;各一个;n n2 2试剂:试剂:(1 1)0.9%NaCl0.9%NaCl溶液;溶液;(2 2)标准蛋白质溶液:称取)标准蛋白质溶液:称取10mg 10mg 牛血清白蛋白,溶于蒸馏牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至水并定容至100ml100ml,制成,制成0.1mg/ml 0.1mg/ml 的原液。的原液。(3 3)考马斯亮蓝)考马斯亮蓝G-250G-25
3、0(0.01%0.01%)染液:称取)染液:称取0.1g0.1g考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250,溶于,溶于50ml 90%50ml 90%乙醇中,加入乙醇中,加入85%85%(m/vm/v)的磷酸)的磷酸100ml100ml,最后最后(zuhu)(zuhu)用蒸馏水定容至用蒸馏水定容至1000ml1000ml。此溶液不宜久存,在常温。此溶液不宜久存,在常温中可放置中可放置1-21-2个月。个月。(4 4)样品液:取牛血清白蛋白)样品液:取牛血清白蛋白0.1mg/ml 0.1mg/ml 的溶液,用的溶液,用0.9%0.9%NaClNaCl溶液稀释至一定浓度。溶液稀释至一定浓度。第四页,
4、共十一页。操作步骤n n10100gmL标准曲线的制作(zhzu)(zhzu):取6支试管,编号后,按下表加入试剂,混匀,室温静置5min后,以管1为空白对照,在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量(g)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。第五页,共十一页。管号123456蛋白质标准液(ml)00.10.10.10.10.10.9%NaCl溶液(ml)1.00.90.90.90.90.9考马斯亮蓝染液555555蛋白质含量(g)A595 第六页,共十一页。n n2样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管(做一重复),加入合适(hsh)(hsh)浓度的待测样品,使其测定值在标准曲线的范围
5、内,测定方法同上,由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。第七页,共十一页。计算计算(j sun)(j sun)样品(yngp(yngp n)n)的蛋白质含量(g/g鲜重)=查得的蛋白质含量(g)/样品(yngp(yngp n)n)鲜重(g)第八页,共十一页。注意事项注意事项n n1.如果要求严格,最好在试剂加入后的520min内测定光吸收,因为这段时间内颜色是最稳定的。n n2测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,不可使用石英(shyng)(shyng)比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时
6、间浸泡。第九页,共十一页。思考题 n n1 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法,并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点?n n2根据(gnj)(gnj)下列所给的条件和要求,选择一种或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。(1)样品不易溶解,但要求结果较准确;(2)要求在短时间内测定大量样品。(3)要求很迅速地测定一系列试管(如30支)中溶液的蛋白质浓度。第十页,共十一页。内容(nirng)总结考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态(zhungti)呈红褐色,与蛋白质结合后呈蓝色,其最大吸收波长由465nm转变为595nm。吸管0.1ml1、1ml2、5ml1。(2)标准蛋白质溶液:称取10mg 牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成0.1mg/ml 的原液。(4)样品液:取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液,用0.9%NaCl溶液稀释至一定浓度第十一页,共十一页。