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ICS 67.080.20 CCS B 30 DB36 江西省地方标准 DB36/T 15122021 DNA 条形码鉴定四种茄属种质技术规程 Technical rules for identification of four Solanum species based on DNA barcode 2021-12-14 发布 2022-06-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 15122021 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.2 5 仪器设备、主要试剂耗材及参照种质.2 6 D NA 条形码序列的获取.2 7 DNA 条形码比对及结果判定.3 附 录 A（资料性）参 照 种 质.4 附 录 B（资料性）引 物 序 列.5 附 录 C（资料性）条形码参考序列.6 附 录 D（资料性）主要仪器设备与试剂、耗材.8 附 录 E（资料性）溶 液 配 制.10 DB36/T 15122021 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本文件主要起草人：袁欣捷、方荣、陈学军、周坤华、雷刚、黄月琴、郭丽虹。DB36/T 15122021 1 DNA 条形码鉴定四种茄属种质技术规程 1 范围 本文件规定了茄属喀西茄（Solanum aculeatissimum）、栽培茄（S.melongena）、蒜芥茄（S.sisymbriifolium）和水茄（S.torvum）等种质的术语和定义、方法原理、仪器设备、主要试剂耗材及参考种质、DNA条形码序列的获取以及DNA条形码比对及结果判定。本文件适用于茄属喀西茄、栽培茄、蒜芥茄和水茄的DNA条形码鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 4625 DNA条形码筛选与质量要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 待测茄属种质 tested Solanum germplasm 由送检人提供的待鉴定的疑似喀西茄、栽培茄、蒜芥茄或水茄的种质。3.2 参照茄属种质 reference Solanum germplasm 用于与待测种质进行PCR扩增片段大小比较或DNA条形码比对的标准种质，喀西茄为改良托鲁巴姆，栽培茄为赣茄1号，蒜芥茄为HC003，水茄为HC002（参照种质见附录A）。3.3 DNA 条形码 DNA barcode 生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段,如matK和psbA-trnH。注1：matK 基因：植物叶绿体中赖氨酸 tRNA 内含子内的成熟酶（参与 RNA 转录本中 II 型内含子剪切）编码基因。本标准 DNA 条形码matK的筛选与质量要求，参照 SN/T 4625 的规定执行。注2：psbA-trnH：植物叶绿体psbA基因和trnH基因间的间隔序列。本标准 DNA 条形码psbA-trnH的筛选与质量要求，参照 SN/T 4625 的规定执行。DB36/T 15122021 2 4 方法原理 根据茄属种质的 matK 或 psbA-trnH 序列特征，应用 DNA 条形码技术对喀西茄、栽培茄、蒜芥茄或水茄等茄属种质进行鉴定。DNA 条形码引物相关信息见附录 B，DNA 条形码序列相关信息见附录 C。5 仪器设备、主要试剂耗材及参照种质 参照种质参见附录A，仪器设备及试剂、耗材参见附录D，溶液配制方法参见附录E。6 D NA 条形码序列的获取 6.1 样品准备 取 0.2 g0.5 g 待测种质或参照种质的植物组织置于 2 mL 离心管中，做好标记。6.2 DNA 提取 6.2.1 改良 CTAB 法提取 DNA 待测种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤为：a）取直径为6 mm钢珠2粒放入装有样品的2 mL离心管中，加入预热至65的CTAB溶液800 L，于植物组织研磨仪中充分研磨后，65水浴20 min。b）取出离心管加入600 L氯仿/异戊醇（24：1）溶液后，上下颠倒混匀，10,000 rpm离心10 min。c）取上清液400 L于新的1.5 mL离心管，加入800 L无水乙醇并混匀，10,000 rpm离心10 min。d）去上清液，加入75%无水乙醇，颠倒混匀后于10,000 rpm离心2 min，弃上清，自然晾干后加50 L ddH2O溶解DNA。e）用超微量分光光度计检测DNA浓度，用ddH2O将DNA稀释到100 ng/L，置于-20冰箱保存备用。6.2.2 试剂盒法提取 DNA 若待测种质样本量少，或样本已降解或部分降解，可购买专用试剂盒提取DNA，按照试剂盒的说明进行提取，并按照9.2.1步骤e）的方法存放。6.3 PCR 扩增 6.3.1 PCR 反应体系 PCR反应体系为：2Taq MasterMix（含染料）20 L，10 M正向引物（附录B 表B.1）和反向引物（附录B 表B.1）各0.4 L，100 ng/L的DNA模板2.0 L，ddH2O补齐至40 L。每管PCR体系滴入一滴液体石蜡防止蒸发。6.3.2 PCR 反应程序 所述PCR反应程序：94预变性2 min；94变性30 s，55退火30 s，72延伸1.5 min，38个循环；72延伸5 min。6.4 PCR 扩增产物检测 DB36/T 15122021 3 6.4.1 凝胶制备 称取1.2 g琼脂糖于三角瓶中，加入120 mL 1 TAE缓冲液，在微波炉中加热至完全溶解后自然冷却至约50，加入12 L核酸凝胶染色试剂GelRed（10,000 水溶液），混匀后倒于放有凝胶托盘的制胶盒中，垂直将加样梳插入制胶盒的小凹槽中。6.4.2 电泳及检测 琼脂糖胶凝固后，垂直拨出加样梳，将凝胶托盘取出置于电泳槽中，用移液器吸取5 L DL2000 Marker点于每排第一个加样孔，其后依次加入4 L待检测PCR产物。将电泳仪设置为恒压150 V，待指示染料迁移至凝胶2/3处时，取出于凝胶成像系统检测PCR条带。参照种质的matK片段大小为1032 bp，psbA-trnH片段大小为745 bp，待测样品条带大小应与参照种质条带大小基本一致，对待测样品PCR产物进行Sanger测序，获取DNA条形码序列。7 DNA 条形码比对及结果判定 7.1 喀西茄的判定 利用DNA条形码psbA-trnH对喀西茄进行判定：将疑似喀西茄待测种质psbA-trnH片段两端质量低的DNA序列截去后，在GenBank数据库进行BLAST比对，相似度最高的为喀西茄；与序列2（附录C.1）进行比对，对应序列2的第232位碱基为A，则确定待测种质为喀西茄。7.2 栽培茄的判定 利用 DNA 条形码 matK 对栽培茄进行判定：将疑似栽培茄待测种质 matK 片段两端质量低的 DNA序列截去后，在 GenBank 数据库进行 BLAST 比对（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），相似度最高的为栽培茄；与序列 1（附录 C.2）进行比对，对应序列 1 的第 491 位碱基为 C，同时第 726 位碱基为T，则确定待测种质为栽培茄。7.3 蒜芥茄的判定 利用 DNA 条形码 matK 对蒜芥茄进行判定：将疑似蒜芥茄待测种质 matK 片段两端质量低的 DNA序列截去后，在 GenBank 数据库进行 BLAST 比对，相似度最高的为蒜芥茄；与序列 1（附录 C.2）进行比对，对应序列 1 的第 645 位碱基为 C，则确定待测种质为蒜芥茄。7.4 水茄的判定 利用 DNA 条形码 matK 对水茄进行判定：将疑似水茄待测种质 matK 片段两端质量低的 DNA 序列截去后，在 GenBank 数据库进行 BLAST 比对，相似度最高的为水茄；与序列 1（附录 C.2）进行比对，对应序列 1 的第 682 位碱基为 T，则确定待测种质为水茄。DB36/T 15122021 4 附 录 A （资料性）参 照 种 质 参照种质名单见表 A.1。表 A.1 参照种质名单 编号 样品名 分 类 来源 1 改良托鲁巴姆 S.aculeatissimum 商品种 2 赣茄 1 号 S.melongena 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 3 HC003 S.sisymbriifolium 重庆市农业科学院 4 HC002 S.torvum 重庆市农业科学院 DB36/T 15122021 5 附 录 B（资料性）引 物 序 列 DNA 条形码引物序列见表 B.1。表 B.1 DNA 条形码引物 编号 目标 DNA 条形码 引物序列(53)1 matK F:ACAAAAAATATCCAAATACCAAATCC R:CCCGTTCATCTGGAAATCTTG 2 psbA-trnH F:ATCCACTTGGCTACATCCGC R:CAACAACTCTCGTTCGTTACACTTC DB36/T 15122021 6 附 录 C （资料性）条形码参考序列 C.1 psbA-trnH 序列 atccacttgg ctacatccgc cccctcccct actgatgaca ttccattttt acattattga 60 aattagaaaa caaaagattt aagttcgaat atttctcttc tttcttattt cacttatttc 120 aatgatagta ttatttcgat tattatttca aagatatgaa agatatgagg tcaaaattgg 180 attttttatg tgaaatgcaa taaaaagata tagtaacatt agcaacaaga ggaacaagtt 240 atatttcttt gaaataaata gaaaatcaaa atcgaatact caatcatgaa taaatgcagg 300 caaataccct ctccttcttt ttctataatt taaacaaaaa agtctatgtc agtcaaatac 360 taggaaatta ataataaaaa aaaaaaaaag aaaggagcaa tagcaccctc ttgataaaac 420 aagaaaatgg ttattgctcc tttcttttca aaacctccta tagactagac tgggatctta 480 tccatttgta gatggagctt cgatagcagc taggtctaga gggaagttat gagcattacg 540 ttcatgcata acttccatac caaggttagc acggttgatg atatcagccc aagtattaat 600 tacacgaccc tgactgtcaa ctacagattg gttgaaattg aaaccattta ggttgaaagc 660 catagtgctg atacctaaag cggtaaacca gatacctact acaggccaag cagctaggaa 720 gaagtgtaac gaacgagagt tgttg 745 C.2 matK 序列 acaaaaaata tccaaatacc aaatccgact tctatatact ccccacaaac tagacgaagc 60 tcgtgggaag gtcaaagaaa gaacttgttc ttccgacgtt aagaattctt ccaataattc 120 cgagcccgat cttttcaaaa aagtgcgtac agtacttttg tgtttccgag ctaaagttct 180 agcacaagaa agtcgaagta tatactttat tcgatataaa gtcttttttt tggaagatcc 240 gctataataa tgaaaaagat ttctgcatat acgcccaaat cggtcaataa tatcagaatc 300 tgataaatcg gaccaaactg gtttactaat gggatgccct aatacggtac aaaagtgtgc 360 tttagctaat gatccaatca aaggaataat tggaacaagg gtctcgaact tcttaattgg 420 attattgatt agaaatgaat tttctaacat ttgactacgt accattgaat gatttagtcg 480 cacacttgaa agatagccca taaagtcacg ggaatggttg gataattggt ttatatggat 540 ccttcctgtg tgaaagtaca tagaaaaatg acattgccaa aaattgacaa ggtaaaattt 600 ccatttattc atcaaaggaa acgtcccttt tgaagccaga attgattttc cttcatacct 660 DB36/T 15122021 7 aacataatgc atgaaaggat ccttgaataa ccatagggta acctgaaaat ccttagcaaa 720 gacttctaca agacgttcta tttttccata gaaatatatt cgttcaagaa gggctccaaa 780 agatgttgat cgtaaatgag aagattggtt ccgtagaaag acgaaagtgg attcgcattc 840 atatacataa gaattatata agaagaagaa gaatctttga tttttttttg aaaaggagta 900 accgggcttc tttgaagtaa taagactatt caaattacaa tattcgtgga gaaagaatcg 960 taataaatgt aaagaagagg catcttttac ccaatagcga agagtttgaa ccaagatttc 1020 cagatgaacg gg 1032 DB36/T 15122021 8 附 录 D（资料性）主要仪器设备与试剂、耗材 D.1 主要仪器设备 D.1.1 PH 计。D.1.2 纯水仪。D.1.3 电子天平。D.1.4 磁力搅拌器。D.1.5 恒温水浴锅。D.1.6 植物组织研磨仪。D.1.7 高速离心机。D.1.8 超微量分光光度计。D.1.9 PCR 仪。D.1.10 微波炉。D.1.11 电泳仪。D.1.12 凝胶成像系统。D.1.13 冰箱。D.2 主要试剂 D.2.1 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB，AR）。D.2.2 聚乙烯吡咯烷酮 K-30（PVP K-30，AR）。D.2.3 乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA，AR）。D.2.4 二水乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O，AR）。D.2.5 冰乙酸（CH3COOH，AR）。D.2.6 氯化钠（NaCl，AR）。D.2.7 三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱，AR）。D.2.8 氯仿（CHCl3，AR）。D.2.9 异戊醇（C5H12O，AR）。D.2.10 无水乙醇（CHO，AR）。DB36/T 15122021 9 D.2.11 氢氧化钠（NaOH，AR）。D.2.12 2Taq MasterMix。D.2.13 DNA Marker（DL2000）。D.2.14 液体石蜡（AR）。D.2.15 DNA 条形码引物。D.2.16 ddH2O。D.3 主要耗材 D.3.1 离心管（1.5 mL，2.0 mL）。D.3.2 移液器及配套枪头。D.3.3 枪头盒。D.3.4 96 孔 PCR 板。D.3.5 蓝盖试剂瓶。D.3.6 6 mm 钢珠。D.3.7 一次性手套。D.3.8 乳胶手套。D.3.9 量筒。D.3.10 玻璃棒。D.3.11 三角瓶。D.3.12 制胶盒 D.3.13 凝胶托盘 D.3.14 加样梳。DB36/T 15122021 10 附 录 E（资料性）溶 液 配 制 E.1 DNA 提取液的配制 E.1.1 2%CTAB 溶液 称取Tris-HCl 12.44 g，NaCl 81.82 g，Na2EDTA 7.45 g，CTAB 20 g，PVP K-30 20 g，加ddH2O至800 mL刻度处，于65加热使其充分溶解，待溶液冷却至室温后用NaOH将pH调至8.0。E.1.2 氯仿/异戊醇（24:1）溶液 量取480 mL氯仿，20 mL异戊醇置于棕色玻璃瓶中，混匀备用。E.1.3 75%无水乙醇 量取375 mL无水乙醇，125 mL ddH2O于棕色玻璃瓶中，混匀备用。E.2 PCR 扩增溶液的配制 E.2.1 DNA 条形码引物稀释 装有引物（见附录C）粉末的离心管在离心机中5000 r/min离心2 min，加适量ddH2O将引物稀释到10 mol/L。E.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液的配制 E.3.1 50TAE 缓冲液 称取Tris碱242 g，Na2EDTA2H2O 37.2 g，加ddH2O至800 mL刻度处，搅拌混匀，加入57.1 mL冰乙酸，加ddH2O定容至1000 mL。_