(高清正版）DB43_T 2009-2021香芋茎尖脱毒技术规程.pdf

香芋茎尖脱毒技术规程Regulations for virus-free technology of Taro stem tip发 布湖南省市场监督管理局2021-02发布-202021-05实施-2043DB43/T 20092021 湖南省地方标准ICSCCS 65.020B 16 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 材料选择与处理 1 5 培养基的配制 1 6 培养 2 7 培养室环境调控 3 附录 A（规范性）MS 培养基母液配制表 4 附录 B（资料性）PCR 法检测病毒病 5 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省蔬菜研究所。本文件主要起草人：李倩、杨建国、汪端华、吴双花、皮向红、王鑫、宋志伟。香芋茎尖脱毒技术规程 1 范围 本文件规定了茎尖脱毒的术语和定义、材料选择与处理、培养基配制、培养、病毒检测的基本要求。本文件适用于香芋茎尖脱毒。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 1538.12005 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 29642011 植物病毒检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 茎尖脱毒 Stem tip detoxification 利用茎尖生长点附近的分生组织病毒少或不带病毒的特点，通过取顶端生长点培养获得无病毒植株的方法。4 材料选择与处理 4.1 材料选择 选择健壮、生长旺盛、无病虫害症状的母芋为茎尖脱毒材料。4.2 材料处理 将取得的香芋材料种于细沙或珍珠岩中，用多菌灵 800 倍液处理 7 d10 d。5 培养基的配制 5.1 MS 培养基的配制 5.1.1 母液的配制 直接用合成 MS 培养基或按照附录 A 的成分表配制 MS 大量元素母液、微量元素母液、有机母液、铁盐母液。5.1.2 MS 培养基配制方法 先在烧杯中放入适量蒸馏水，加入琼脂粉 6 g7 g 搅拌均匀，置于电炉上加热；依次加入上述母液或 MS 培养基，其中大量元素 20 mL，其他母液各 5 mL，蔗糖 30 g；边加热边搅拌至完全溶解；加蒸馏水定容至 1 L；调节 pH 至 5.75.9；根据不同需要定量分装，盖好瓶盖；分装好的培养基置于灭菌锅内 120 高压灭菌 20 min；放置 5 d7 d，检验培养基灭菌效果。培养基贮存时间不超过 30 d。5.2 初代培养基的配制 在 MS 培养基的基础上，加入激素 NAA 0.15 mg/L、6-BA 4.0 mg/L 和山农 1 号 1 mL/L，再灭菌，其操作同 5.1.2。5.3 增殖培养基的配制 在 MS 培养基的基础上，加入激素 NAA 0.4 mg/L、6-BA 4.0 mg/L 和山农 1 号 1mL/L，再灭菌，其操作同 5.1.2。6 培养 6.1 茎尖接种 6.1.1 材料器械准备 在接种前准备酒精灯、75酒精、NaClO、无菌滤纸或接种盘以及接种器械、培养基、体视显微镜、外植体、无菌水等。6.1.2 灭菌 提前 30min 打开超净工作台紫外灯，紫外灭菌完后，打开风机和照明灯。6.1.3 接种人员准备 接种人员在准备室消毒后在更衣室更换拖鞋、穿白大褂、戴上帽、口罩后方能进入接种室。6.1.4 接种前准备 操作人员用 75酒精喷或擦手，在操作台内自然吹干后点酒精灯，全程操作须带手套。6.1.5 外植体的消毒灭菌 解剖刀切下备用的外植体，表面消毒后转入超净工作台进行操作。将芽段放入灭菌后的烧杯内，用75酒精泡 30 s45 s，无菌水冲洗 2 次3 次，10 NaClO 溶液浸泡 8 min10 min，最后用无菌水冲洗 3 次4 次。6.1.6 茎尖剥离及接种 将消毒灭菌后的香芋芽段放在无菌滤纸上吸干水分，在 3040 倍体视显微镜下用无菌的解剖针剥取带一个叶原基的茎尖，大小 0.2 mm0.5 mm，将生长点迅速接入初代培养基中，分别编号登记，便于后续观察。6.2 香芋茎尖的初代培养 60d80d 后成苗，待苗长至 2 cm3 cm 时，整株取出接入增殖培养基中。6.3 病毒检测 6.3.1 主要检测对象 烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)和芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV），引物按表 1。表 1 病毒病检测引物序列 病害 正向引物 反向引物 目的片段 CMV CCCACTCTTAACCACCCAACC GACGCAGCATACTGATAAACCAA 323 TMV TAGACCCGCTAGTCACAG CAGAGGTCCAAACCAAAC 237 DsMV GGGCTTGGGTGATGATGGA GCCTTTCAGTGTTCTCGCCTTG 357 6.3.2 检测方法 采用 PCR 法对脱毒的香芋组培苗进行病毒检测，确认不带病毒的株系，进一步进行增殖培养，对带病毒的株系进行再次脱毒或直接淘汰。各病毒病检测引物按下表 1。6.4 茎尖苗增殖培养 组培苗接入增殖培养基后，40 d50 d，发出 36 个丛生芽，切取各丛生芽转入增殖培养基进行增殖培养，30 d 后，去除基部老化组织，切取各丛生芽继续进行增殖培养。增殖培养周期为 25 d35 d，增殖率为 36，连续继代不超过 10 次。6.5 病毒检测 病毒检测同 6.3。7 培养室环境调控 培养室温度应控制在 282；相对湿度保持在 4060；光照强度控制在 54molm2s，光照培养周期为 12 h/12 h。附 录 A（规范性）MS 培养基母液配制表 母液种类 成分 称取量（mg/L）扩大倍数 母液体积（L）吸取量（mL/L）大量元素 KNO3 1900 50 1 20 NH4NO3 1650 MgSO47HO2 370 KH2PO4 170 CaCl22H2O 440 50 1 20 微量元素 MnSO44H2O 2.23 200 1 5 ZnSO47H2O 860 H3BO3 6.2 KI 0.83 NaMoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl6H2O 0.025 铁盐 Na2-EDTA 37.3 200 1 5 FeSO47H2O 27.8 维生素 甘氨酸 2 200 1 5 盐酸吡哆醇（B1）0.1 盐酸硫胺素（B6）0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 IBA 0.005 MET 0.005 附 录 B（资料性）PCR（Polymerase Chain Reaction）法检测病毒病 B1 香芋病毒病检测 应用 PCR 法检测香芋脱毒苗是否带有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和芋花叶病毒（DsMV）等主要香芋病毒。B2 仪器和设备 病毒病检测主要仪器设备包括电泳仪、电泳槽、转数为 3 000 r/min 以上的离心机、1.5 mL2 mL，50 L 离心管、冰箱、高温水浴、微量可调进样器，需要 2 L10 L，10 L50 L，10 L200 L三种规格，并附有相应规格的塑料头、玻璃或白瓷制造的小研钵、PCR 扩增仪、凝胶成像系统等。B3 试剂 主要试剂包括植物 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、5PrimeScript II Buffer、dNTP、2.5units/L Taq DNA 聚合酶、10Buffer、TAE 缓冲液等。B4 RNA 提取 取 1 g2 g 香芋脱毒组培苗，放入液氮预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，放入备好的离心管中，RNA 提取参照试剂盒说明书进行，提取 RNA 后马上进行反转录或放于-80保存备用。B5 cDNA 合成 参照说明书，利用反转录试剂盒合成 cDNA。B6 PCR 扩增 B6.1 反应体系（总体积 20L）PCR 反应体系为：10Buffer 2.0 L；dNTP(2 mmol/L)1.5 L；Primer(2 mol/L)1.5 L；模板 DNA4.0 L；Taq(2.5 units/L)1U；加 ddH2O 至 20 L。B6.2 扩增反应程序 PCR 扩增反应程序为：94 5min；94 30 s，55 30 s，72 30 s 运行 35 个循环；72延伸5 min,4保存。B7 电泳检测与分析 PCR 反应完毕，短暂离心 10s，取 6-8 L 反应产物于 1.5琼脂糖凝胶电泳检测，选择 DNA Marker 500-1000 作参照。