DB51_T 2964-2022口岸松材线虫疫情监测技术规范.pdf

ICS 65.020 CCS B 16 DB51 四川省地方标准 DB51/T 29642022 口岸松材线虫疫情监测技术规范 Technical standard for monitoring the pinewood nematode at ports 2022-12-27 发布 2023-02-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 监测范围.3 5 应施监测的植物及其产品.3 6 制定监测计划及实施方案.3 7 监测方法.3 8 实验室检测.4 9 监测样品的保存及处理.6 10 监测结果管理.6 附 录 A（资料性附录）松材线虫相关信息.7 附 录 B（规范性附录）口岸松材线虫疫情监测记录表.10 附 录 C（资料性附录）松材线虫组介绍及鉴定特征.11 附 录 D（资料性附录）松材线虫及其近似种.17 附 录 E（规范性附录）特异 PCR 鉴定方法.26 附 录 F（规范性附录）实时荧光 PCR 鉴定方法.28 附 录 G（规范性附录）DNA 条形码.30 参考文献.32 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国成都海关提出、归口并解释。本文件起草单位：成都海关技术中心、宁波海关技术中心、四川省农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：邵宝林、张婧、李星月、顾建锋、张涛、刘露希、杨益芬、王成华、鲁昕、陆丽华、宿白玉、刘国瑛、张军、刘俊。本文件为首次发布。口岸松材线虫疫情监测技术规范 1 范围 本文件规定了口岸松材线虫监测范围、应施监测的植物及其产品、监测计划及实施、监测方法、实验室检测、监测样品的保存及处理、监测结果管理。本文件适用于口岸进出境松木及其制品、木质包装材料、松材线虫寄主繁殖材料以及监管场所周边林地的松材线虫监测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 23476-2009 松材线虫病检疫技术规程 GB/T 23478 松材线虫普查监测技术规程 SN/T 1132-2002 松材线虫检疫鉴定方法 SN/T 1724-2006 进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程 SN/T 2757 植物线虫检测规范 SN/T 4350-2015 旅客携带物和邮寄物检疫鉴定和处理程序 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 口岸 port 是国家批准对外开放，允许人员、货物、交通工具、寄递物等进出国境的地方。3.2 松材线虫 pinewood nematode 学名：Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle,1970。松材线虫是一种植物寄生线虫，属于小杆目（Rhabditida），垫刃亚目（Tylenchina），滑刃总科（Aphelenchoidea），滑刃科（Aphelenchoididae），寄生滑刃亚科（Parasitaphelenchinae），伞滑刃属（Bursaphelenchus），能引起松树萎蔫病，是针叶树木上最重要的病原生物之一。松材线虫相关信息参见附录A。3.3 媒介昆虫 intermediary insect 能携带松材线虫并能将松材线虫传递给寄主树木的天牛。在自然条件下，松材线虫需依靠墨天牛属（Monochamus）的天牛实现近距离传播。3.4 松褐天牛 Monochamus alternatus Hope,1843 又名松墨天牛、松天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是为害松树的一种蛀干性昆虫，为传播松材线虫的主要媒介天牛。3.5 云杉花墨天牛 Monochamus saltuarius Gebler,1830 又名云杉花黑天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是一种蛀干性昆虫，是松材线虫病的传播媒介昆虫。3.6 木材 wood 带皮或不带皮的原木、锯木、木板、木片等。3.7 原木 raw woods 未经过干燥、化学防腐剂等处理，并未永久改变其特性的木材。3.8 松木及其制品 pine wood andwoodenware 指松科木材和由松科木材为原料制作的产品，包括松木木质包装材料。经人工合成或经加热、加压等深度加工的木质材料（如胶合板、纤维板等）除外。3.9 木质包装材料 wood packing materials 用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木、衬木等。3.10 疫木 diseased wood 感染松材线虫病的寄主植物及其制品，主要为松属植物及其制品。3.11 蓝变 blue-stain 木材因松材线虫感染或其他原因，使得各种真菌在木材管胞或导管中大量繁殖，真菌菌丝分泌出着色物将胞壁染色，促使木材蓝变的现象。蓝变是判断松材线虫监测抽样的一个重要依据。3.12 海关指定监管场地 customs designated supervision site 是指符合海关监管作业场所（场地）的设置规范，满足动植物疫病疫情防控需要，对特定进境高风险动植物及其产品实施查验、检验、检疫的监管作业场地。3.13 海关监管货物 cargo under customs supervision 是指所有进出境货物，包括海关监管时限内的进出口货物，过境货物、转运货物、通运货物，特定减免税货物，以及暂时进出口货物、保税货物和其他尚未办结海关手续的进出境货物。3.14 诱捕器监测 trap monitoring 利用人工合成引诱剂来捕获松墨天牛，并检查其体内、体表是否携带松材线虫的一种监测方法。3.15 松墨天牛引诱剂 pine sawyer attractant 对松墨天牛成虫具有引诱活性的挥发性化合物，如萜烯类等特异性植物源物质、昆虫源信息素等，需与松墨天牛诱捕器配合使用。4 监测范围 海关监管作业场所（场地）及其周边。海关监管作业场所（场地）划分为监管作业场所和集中作业场地。监管作业场所是指由企业负责经营管理，供进出境运输工具或者境内承运海关监管货物的运输工具进出、停靠，从事海关监管货物的进出、装卸、储存、集拼、暂时存放等有关经营活动，符合海关监管作业场所设置规范，办理相关海关手续的场所，包括水路运输类海关监管作业场所、公路运输类海关监管作业场所、航空运输类海关监管作业场所、铁路运输类海关监管作业场所、快递类海关监管作业场所等；集中作业场地是指从事海关监管货物的进出、装卸、储存、集拼、暂时存放等有关经营活动，基本符合海关监管作业场所（场地）设置规范，有一定环境条件或检验、检疫专业要求，因经营主体、属性等因素不具备“海关监管作业场所”管理条件，办理相关海关手续的作业场地，包括旅客通关作业场地、邮检作业场地等。5 应施监测的植物及其产品 应施监测的植物及其产品为：来自国内外疫情发生区的松属、雪松属、冷杉属、云杉属和落叶松属等松材线虫寄主植物的苗木、接穗、插条、盆景等生长繁殖材料；来自国内外疫情发生区的上述植物的木材、枝桠、根桩、木片以及它们的制品；带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的货物、包装材料、铺垫材料、运输工具、邮寄物及旅客携带物。松材线虫的寄主植物范围参见附录A.6。6 制定监测计划及实施方案 科学制定监测计划及具体实施方案。依据全国海关各口岸松材线虫疫情截获数据，结合本关区业务实际设置监测区域，对应施监测的植物及其产品开展松材线虫疫情监测，即在海关监管作业场所重点对海关监管货物的松木及其制品是否携带松材线虫进行监测；在海关集中作业场地开展进境邮寄物及旅客携带物是否携带松材线虫的监测；在海关监管作业场所（场地）及其周边开展诱捕器监测，对诱捕的媒介天牛是否携带松材线虫实施监测。重点关注来自美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、葡萄牙、西班牙以及中国台湾等国家或地区的松木及其制品、邮寄物及旅客携带物。7 监测方法 7.1 抽样监测 观察松木材质是否干燥，木质部是否有蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。重点抽取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品，若无上述特征时，可随机抽样。针对进境针叶树原木、木制品和木质包装材料的抽样监测，需结合单证查验，即核实产地、品种、数量、证书等信息否与货物相符合，抽样及采样方法按照SN/T 1724-2006中6.2和6.3执行。针对邮寄物及旅客携带物的抽样监测，按照SN/T 4350-2015中第5章和第6章内容，对可能携带松材线虫的所有寄主植物及其繁殖材料、松木及其制品进行取样监测，不宜现场取样的可将其整体带回送实验室检测。样品标识信息应完整、清晰，确保可溯源、可追查，规范填写附录表B.1。7.2 诱捕器监测 7.2.1 诱捕器设置 重点在口岸木材及木制品装卸地和木质包装集散点等重要疫情监测区域进行布点，每个诱捕器之间相距50 m100 m。周边有林地的按照GB/T 23478执行。7.2.2 诱捕时间 诱捕时间一般为每年的4月下旬至10月底（不同地区有差异），即松墨天牛成虫羽化初期开始，直至当年成虫羽化完毕为宜。7.2.3 松墨天牛引诱剂 可根据监测需要选用商品化的高效引诱剂。7.2.4 诱捕器安装、维护及媒介天牛的收集 诱捕器安装及维护在松墨天牛羽化前1 d5 d，诱捕器应安装在空气流通较好的地方，悬空挂置，诱捕器下端离地面1.5 m2.0 m。诱捕器上下两端应用铁丝绑牢并固定，正确添加或更换引诱剂，应注意防撒漏、防跌落，以免影响诱捕效果。诱捕器应及时维护，结合查虫定期巡查诱捕器，清洗集虫罐，补充水淹式集虫罐中的清水。风雨过后也要及时检查诱捕器，确保诱捕器处于良好的诱虫状态。定期添加诱剂，每隔10 d15 d添加1次。诱捕器每隔3 d5 d检查一次，及时收集并清理诱捕器中的媒介天牛，并在当日送实验室检测。详细记录相关信息，填写附录表B.2。7.2.5 安全事项 松墨天牛引诱剂属于易燃品，在运输、储存和使用过程中，应遵守国家有关易燃品安全管理的有关规定和安全使用方法。8 实验室检测 8.1 松材线虫的分离 疑似松材线虫疫木样品，采用贝尔曼漏斗法或浅盘法或改进型线虫分离器法分离线虫，具体操作按照GB/T 23476-2009中附录C执行。分离时室内温度应保持在20 30 之间，或置于恒温培养箱中进行分离，分离时间一般需12 h24 h。用直径约10 cm的凹面皿或培养皿接取少量线虫分离液（大约10 ml），置体视显微镜下镜检（放大倍率10 X20 X为宜）。媒介昆虫样品的分离，可将天牛剪碎后直接分离或可采用局部分离线虫的方法分离线虫，即将天牛的触角端部或胸部腿节取下，捣碎后用漏斗法或浅盘法分离线虫，也可直接浸泡于加水的表面皿或培养皿中，2h后在体视显微镜下直接观察是否有线虫。8.2 镜检 在体视显微镜下，用100 L200 L移液器吸取线虫（根据虫量多少，一般吸取线虫数10条为宜，以避免漏检），转移到载玻片上，液滴体积50 L左右为宜。在酒精灯上以1 s左右的频率通过8 次10 次，使线虫恰好被杀死为宜。加盖玻片，制成临时玻片。若分离的线虫均为幼虫或数量极少影响后续鉴定时，可培养获得成虫后再进行鉴定。一般要求观察线虫20条以上。如发现样品中线虫幼虫较多，或者样品中线虫种类较为复杂，应加大观察数量，以防漏检。如果每份样品的分离液中线虫含量在20条以下的，全部制成临时玻片镜检。一般鉴定要求至少发现雌虫和雄虫各1条以上。仔细观察雌虫和雄虫主要鉴定特征并显微摄影，主要鉴定特征包括雌虫、雄虫唇区、口针、中食道球、尾部，尤其注意雌虫阴门区以及雄虫交合刺，并拍摄显微照片。一般在40 倍物镜下，拍摄雌虫头部、阴门区、尾部各1张照片，拍摄雄虫头部和尾部各1张照片，必要时在100倍油镜下拍摄。显微镜配置微分干涉（DIC）功能可提高观察效果，以获得更清晰的照片。应在每张图片上加相应标尺。必要时，测量并计算体长/虫体最宽处体宽（a）、体长/尾长（c）、尾长/肛门处体宽（c）等值。如样品足够，应测量雄虫、雄虫各20条以上。测计方法参考SN/T 2757。8.3 半永久标本及永久标本的制作 按照SN/T 1132-2002中附录C.2相关内容执行。8.4 线虫培养 按照SN/T 1724-2006中附录B执行。8.5 松材线虫检测鉴定 8.5.1 鉴定流程 分离获得线虫后，一般先进行形态学鉴定。形态学鉴定以雌、雄虫的形态特征为依据，判定为松材线虫组线虫后，在发现雌雄成虫的情况下，一般可快速根据形态特征做出判定。鉴定松材线虫时，如仅发现雄虫和（或）幼虫，则无法进行形态鉴定；如仅有雌虫，有经验的鉴定人员可做出初步鉴定结论，并应进一步请专家复核确认；如仅发现雄虫和（或）幼虫、样品来自非疫区、实验室首次发现、形态鉴定结果存疑等情况，应进一步用特异PCR、实时荧光PCR或DNA条形码等任何一种方法进一步鉴定，或联系相关专家复核。特异PCR、实时荧光PCR或DNA条形码等任何一种方法均能对松材线虫进行准确鉴定，也可作用形态学鉴定的补充。8.5.2 形态学鉴定 松材线虫形态学鉴定按照SN/T 1132-2002中第8章执行。松材线虫组介绍及鉴定特征详见附录C，松材线虫及其近似种显微特征详见附录D。8.5.3 分子生物学检测 松材线虫特异PCR检测见附录E，实时荧光PCR检测见附录F，DNA条形码鉴定见附录G。8.5.4 结果判定及复核 8.5.4.1 结果判定 形态学鉴定符合8.5.2形态特征的，可鉴定为松材线虫；疑似松材线虫的标本经外送专家或专业检测机构鉴定或复核的，可采纳专家出具的结果进行判定。分子生物学检测依据附录E附录G相关内容进行判定，检测结果呈阳性的可鉴定为松材线虫。8.5.4.2 复核 对首次检出松材线虫的结果，需经过专家复核或相关专业检测实验室复核。其中相关专业检测实验室是指具备相应检测技术能力的实验室，即实验室获得CNAS认可的有效能力范围覆盖松材线虫检测项目。提供复核的材料为具松材线虫雌雄成虫的线虫分离液、临时玻片、照片、分子检测数据或影像材料等。9 监测样品的保存及处理 监测样品应及时分离鉴定，若需要保存，应在4 条件下保存。如木屑、木片或木条等样品，可放入塑料袋内，扎紧袋口，在袋上扎几个小孔，放入4 冰箱；木段、圆盘可直接裹上几层湿纱布后放入4 冰箱保存。若需保存时间较长，样品需经常喷水保湿。对不宜保存的样品（如媒介天牛样品），应及时销毁或灭活处理，确保疫情不扩散。样品保存应做好登记工作，并做好标识，信息可追溯。经检测发现含有松材线虫的样品（不宜保存的样品除外），保存期不少于6个月，以备复查、谈判或仲裁。保存期满后，含松材线虫的样品必须销毁（如焚烧、粉碎）或灭活处理（疫木样品中心温度在56 以上时，处理时间不少于30 min）。10 监测结果管理 严格监测数据保密工作，未经许可，任何单位或个人不得擅自对媒体、单位、个人通报或发布监测结果，更不得擅自在学术论文、刊物上发表。监测相关的原始记录、表格、检测报告及标本应妥善保存，并按档案要求进行管理，保存期限为3年。一经发现并确认监测到松材线虫的有关情况，应立即向属地监管部门和行业主管部门报告，同时做好数据核查、溯源分析等工作，必要时按照四川省重大植物疫情防控管理要求及时启动应急预案响应。A A 附 录 A（资料性附录）松材线虫相关信息 A.1 发现历史和背景 松材线虫最早于1929年从美国德克萨斯州的长叶松（Pinus palustris）木材中分离到，被描述为Aphelenchoides xylophilus Steiner&Buhrer，1934。当时观察到带线虫的木段有蓝变现象，认为该线虫可能通过昆虫传播，能在多种真菌上繁殖，但没有认识到其致病性。尽管日本早在1905年就有关于大量松树枯死的记录，损失巨大，但长期未找到病因。直到1971年，Kiyohara等研究认为一种伞滑刃属线虫是日本松树枯萎病病原。1972年，Mamiya等将该病原线虫描述为Bursaphelenchus lignicolus。1981年，Nickle等确认其为异名，松材线虫从此被定名为Bursaphelenchus xylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970。目前，专家普遍认为松材线虫发源于北美洲，在美国、加拿大等国的针叶木（主要是松属）中普遍发生，但本土的松树品种大多数抗性较强，因此松树枯萎病仅零星发生，为害很小。其原因可能是北美松材线虫与松树长期共同进化，松树获得了较强的抗病性或耐病性，并且当地传媒天牛传播松材线虫的效率也相对较低，同时有大量的自然天敌存在。然而，当松材线虫通过北美输出的松木原木、木质包装等传入亚洲、欧洲各国后，由于寄主、媒介昆虫、环境及天敌等条件的改变，松材线虫引起了巨大的为害。在日本，松材线虫可能在20世纪初通过从美国大量进境松木产品而传入。日本对松材线虫及其媒介昆虫长达数十年的防治工作都收效甚微，目前松材线虫在日本除北部数县外已扩散到全国。我国1982年首次在南京紫金山发现松材线虫，随后该线虫在广东省深圳市、安徽省马鞍山市、山东省长岛县、浙江省象山县等陆续被发现，为害十分严重。据2020年国家林业和草原局信息，全国共计18个省份、673个县级行政区、4187个乡镇级行政区发生松材线虫病疫情，发生面积1375.30万亩，病死松树数量112.48万株。1998年，葡萄牙海岸松发现松材线虫，这是欧盟境内首次报道该病。2009年，西班牙发现松材线虫。A.2 地理分布 美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、西班牙、葡萄牙、中国。A.3 侵染循环 松材线虫通过墨天牛属（Monochamus）昆虫在寄主植物间传播。天牛蛹中羽化后即将离开寄主树木之前，线虫进入其体内。天牛飞至健康树木的树冠，取食嫩枝和树叶补充营养。随后，雌雄虫交配，雌虫寻找树势衰弱或新近死亡的树木、树干或大枝条，在树皮下产卵。天牛幼虫从卵中孵化，随后几个月取食树皮下的形成层组织。发育成熟时，天牛幼虫蛀入木材深处化蛹，进而完成其生活史。松材线虫通过伤口进入松树后，立即转为繁殖阶段，4 d5 d即可发育为成虫。松材线虫利用天牛的发育过程，通过取食和产卵这两种途径，传播到新的寄主树木。A.4 传播途径 松材线虫的传播媒介仅限于松墨天牛属种类，传播媒介种类随地理区域变化而不同；例如中国和日本松材线虫的传播媒介为松褐天牛（M.alternatus）、云杉花墨天牛（M.saltuarius），北美洲为卡罗来纳墨天牛（M.carolinensis），葡萄牙为樟子松墨天牛（M.galloprovincialis）。天牛科其它属及鞘翅目其它昆虫曾被发现其体内携带松材线虫的幼虫，但未证实其传播媒介作用。人类活动是松材线虫远距离传播的主要途径，松材线虫及其传播媒介在木材、木制产品特别是针叶树加工成的木质包装材料中经常被截获。因此，松材线虫在国际贸易中进一步扩散的风险很高。A.5 松材线虫生活史 松材线虫具有6个发育阶段：卵、4个幼虫阶段及成虫。1龄幼虫（J1）在卵中蜕皮成为2龄幼虫（J2）；2龄幼虫从卵中孵化，经历2个幼虫龄期（J3与J4）发育为成虫。不同的条件下会出现不同类型的幼虫阶段。在25 的有利条件下，松材线虫从卵开始，经过4个繁殖阶段的幼虫龄期（J1至J4），在4天内发育为成虫。在逆境下，松材线虫发育为分散型3龄幼虫J而非繁殖型3龄幼虫J3。J是一个不取食的龄期，幼虫在肠道细胞中积累脂肪，可在干旱、低温或营养缺乏的逆境下存活。通常该龄幼虫蜕皮成为分散型4龄幼虫JIV（持久型幼虫），再由媒介甲虫传播给新的树木。然而，如果条件变得适合线虫发育，例如将分散型3龄幼虫J接种到真菌培养皿中，线虫会发育成为繁殖型4龄幼虫J4。A.6 寄主 松材线虫的寄主主要是松属（Pinus spp.）针叶木，我国寄主主要是马尾松（P.massoniana）、黑松（P.thunbergii）和赤松（P.densiflora）。此外，香脂冷杉（Abies balsamea）、欧洲云杉（Picea excelsa）、加拿大云杉（P.canadensis）、北美云杉（P.pungens）、欧洲落叶松（Larix europaea）、美加落叶松（L.americara）、雪松（Cedrus daeodara）、大西洋雪松（C.atlantica）等也在自然条件下感病。然而，松属以外的寄主很少在感染松材线虫后死亡。目前仅美国报道蓝杉（Picea pungens）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）感染松材线虫后死亡。A.7 松材线虫雌虫尾形变化综述 当确定为伞滑刃属、松材线虫组后，雌虫尾形是松材线虫鉴定的关键。一般描述松材线虫雌虫尾为圆柱形、亚圆柱形、近圆柱形或指形，无尾尖突；偶尔群体内部分雌虫有微小的尾尖突，但不超过2 m。然而，这不是绝对的。许多学者的研究证实，松材线虫的尾形会随着寄主、环境等条件的变化而改变。1995年，刘伟等报道一种来自加拿大的经多毛孢培养的松材线虫群体个体间差异较大：尾尖突小于1 m的占77%（其中圆尾型占44%），超过1 m（1.46 m3.41 m）的占23%。2005年，赵文霞等报道一种采自南京黑松的松材线虫群体，在多毛孢上人工培养，所有雌虫尾均宽圆，无尾尖突。该群体接种到黑松后重新分离，4.2%雌虫有尾尖突；接种到油松上，15%雌虫有尾尖突，但未测量尾尖突长度。2007年，郑炜等从宁波北仑区采集的马尾松样品中分离一个松材线虫群体，几乎所有雌虫尾端都有短尾尖突，平均长度约为1.7 m，最长达2.9 m。但该线虫经灰葡萄孢培养后，所有雌虫尾均宽圆，无尾尖突。2009年，夏永刚等报道从湖南临湘市枯死马尾松中分离到一种具尾尖突的松材线虫，其尾尖突长度为0.5 m1.2 m，较本文的群体更短。2011年，顾建锋等报道了一种美国木质包装中截获的松材线虫，从木质包装中直接分离获得的雌虫约一半尾端宽圆，无尾尖突；其余则有很短的尾尖突，约0.5 m1 m。但经过灰葡萄孢人工培养一月后，超过一半雌虫有1 m2 m的尾尖突，另有大约10%的雌虫尾尖突为2 m2.4 m，其余雌虫则无尾尖突或小于0.5 m。2020年，顾建锋等从辽宁红松分离到一种具明显尾尖突的松材线虫，其雌虫尾末端宽圆且无尾尖突的个体极少，仅占2%3%，其余绝大部分均有或长或短的尾尖突，末端钝圆或锐尖，长1.8 m(0.3 m3.2 m)。但经灰葡萄孢人工培养后，所有的雌虫尾端钝圆，均无尾尖突。由此可见，无论是国内外松材线虫群体，都有不少关于雌虫尾尖突变异的报道。上述比较复杂的雌虫尾尖突变化情况显然增加了松材线虫形态鉴定难度，但上述情况，即几乎所有松材线虫雌虫均有尾尖突、或者尾尖突长度超过2 m的情况是比较罕见的，从实验室对上千批次松材线虫检测结果来看，发现这种情况不到1%。因此，对于大多数样品或松材线虫群体，松材线虫都有典型的形态特征：松材线虫雌虫尾近圆柱形，末端宽圆，无尾尖突。群体内一些雌虫有短尾尖突，但长度不超过2 m。并且，通常群体内总能发现无尾尖突的个体。B B 附 录 B（规范性附录）口岸松材线虫疫情监测记录表 表B.1B.2给出了口岸松材线虫疫情监测情况记录表。表B.1 口岸松材线虫疫情监测抽样记录表 时间 口岸 样品编号 样品来源 报关单号或邮件号 来源渠道 样品类型 抽样场所 外部症状 取样部位 有无天牛危害 有无蓝变 是否发现活虫及采取的措施 取样数量 备注 注：【时间】具体到年月日；【口岸】填写抽样所在地口岸具体名称；【样品编号】填写“关区代码+日期+2位流水号”，确保唯一性和可溯源性；【样品来源】填写样品来自哪个国家或地区；【来源渠道】填写贸易渠道、非贸易渠道；【样品类型】填写货物、木质包装、旅客携带物、邮递物等；【抽样场所】填写查验场所、快件中心、监管作业场所、货物堆放场所、检疫处理场所等；【外部症状】依据抽样对象具体描述；【取样部位】依据抽样对象具体描述；【有无天牛危害】填写是或否；【有无蓝变】填写是或否；【备注】对上述内容信息进行必要补充。表B.2 口岸松材线虫诱捕监测记录表 口岸：诱捕器编号 检查时间 监测地点 地理坐标 捕获天牛数量 诱剂添加/更换情况 监测点是否变更 检查人 注：【诱捕器编号】填写“关区代码+场所代码+2位流水号”，确保唯一性和可溯源性；【检查时间】具体到年月日；【监测地点】填写具体地点信息,如货物堆放场所、检疫处理场所或周边区域等；【地理坐标】填写具体经纬度。C C 附 录 C（资料性附录）松材线虫组介绍及鉴定特征 松材线虫组线虫雄虫具有船形大交合刺，很容易与属内其他组线虫区分。目前已报道15种线虫，名单如下：松材线虫 B.xylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970 伪伞滑刃线虫 B.fraudulentus R hm，1956（J.B.Goodey，1960）拟松材线虫 B.mucronatus Mamiya&Enda，1979 锥尾伞滑刃线虫 B.conicaudatus Kanzaki，Tsuda&Futai，2000 鲍嘉伞滑刃线虫 B.baujardi Walia Negi，Bajaj&Kalia，2003 灰黄锦天牛伞滑刃线虫 B.luxuriosae Kanzaki&Futai，2003 豆伞滑刃线虫 B.doui Braasch，Gu，Burgermeister&Zhang，2004 新加坡伞滑刃线虫 B.singaporensis Gu，Zhang，Braasch&Burgermeister，2005 大尖尾伞滑刃线虫 B.macromucronatus Gu，Zheng，Braasch&Burgermeister，2008 杨伞滑刃线虫 B.populi Tomalak&Filipiak，2010 拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫 B.paraluxuriosae Gu,Wang,Braasch,2012 日本冷杉伞滑刃线虫 B.firmae Kanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012 韩国伞滑刃线虫 B.koreanus Gu,Wang&Chen,2013 吉拉尼伞滑刃线虫 B.gillanii Sch nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013 锦天牛属伞滑刃线虫 B.acaloleptae Kanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,2019 松材线虫组线虫均具有以下共同鉴定特征：侧线4条；典型的雄虫交合刺形状（较长、弓形，喙突明显，远端一般有盘状突：均与松材线虫交合刺形态相似）；尾乳突7个，P4明显，P3和P4邻近且位于交合伞起始处；雌虫阴门盖较长（图C.1）。上述特征中，由于侧线和尾乳突特征有时在光学显微镜下不容易观察，最重要的特征是船形大交合刺和长阴门盖。雌虫尾形是松材线虫组内各种的主要鉴定依据（表C.1，表C.2）。注：A.侧线和雄虫尾乳突排列；B.雄虫尾乳突排列；C.交合刺形态；D.雌虫阴门盖；P1P4.尾乳突。图C.1 典型的松材线虫组线虫的特征 表C.1 松材线虫组雄虫交合刺和雌虫尾形特征图 种类种类 交合刺交合刺 雌虫尾雌虫尾 松材线虫（圆尾型）伪伞滑刃线虫 拟松材线虫（欧洲亚种）拟松材线虫（东亚亚种）锥尾伞滑刃线虫 鲍嘉伞滑刃线虫 灰黄锦天牛伞滑刃线虫 拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫 种类种类 交合刺交合刺 雌虫尾雌虫尾 豆伞滑刃线虫 新加坡伞滑刃线虫 大尖尾伞滑刃线虫 杨伞滑刃线虫 日本冷杉伞滑刃线虫 韩国伞滑刃线虫 吉拉尼伞滑刃线虫 锦天牛属伞滑刃线虫 表C.2 松材线虫组雌虫尾形显微特征图 种类种类 雌虫尾雌虫尾 1 雌虫尾雌虫尾 2 松材线虫（圆尾型 R 型）伪伞滑刃线虫 拟松材线虫欧洲亚种 拟松材线虫东亚亚种 锥尾伞滑刃线虫 拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫 豆伞滑刃线虫 新加坡伞滑刃线虫 种类种类 雌虫尾雌虫尾 1 雌虫尾雌虫尾 2 大尖尾伞滑刃线虫 杨伞滑刃线虫 韩国伞滑刃线虫 吉拉尼伞滑刃线虫 锦天牛属伞滑刃线虫 D D 附 录 D（资料性附录）松材线虫及其近似种显微特征 图D.1图D.9给出了松材线虫及其近似种的显微特征照片。注：A.头部；B.阴门区（有阴门盖）；CF.雄虫尾部及交合刺；GK.雌虫尾部（通常尾端钝圆，无尾尖突；有时一些个体有尾尖突，但不超过2 m）。图D.1 典型的松材线虫雌雄虫照片(标尺=10 m)注：A.持久型幼虫；B.繁殖型幼虫；C.雌虫；D.雄虫；E.繁殖型幼虫体前端；F.雌虫阴门区；G.繁殖型幼虫尾部；H.雌虫尾部；I.雄虫尾部。图D.2 不同发育阶段松材线虫形态图(标尺=10 m)注：A.头部；B.生殖原基；C-I.尾部。图D.3 松材线虫持久型幼虫头部和尾部显微特征图(标尺=10 m)注：该群体为红松中分离到的松材线虫，其雌虫尾部较特殊。其雌虫尾末端宽圆且无尾尖突的个体极少，仅占2%3%，其余绝大部分均有或长或短的尾尖突，末端钝圆或锐尖，长1.8 m 0.7 m(0.3 m3.2 m)。但经灰葡萄孢人工培养后，所有的雌虫尾端钝圆，均无尾尖突。AN.直接从红松样品分离到的松材线虫雌虫尾形；O.经灰葡萄孢培养后的松材线虫雌虫尾形。图D.4 辽宁红松中分离到的松材线虫雌虫尾尖形态图(标尺=10 m)注：A.体前部；B.中食道球区；C、E.雄虫尾部；D.雌虫阴门区；FI.雌虫尾部。松材线虫M型株系雌虫具有长约2.2 m3.0 m的尾尖突，且经人工培养后仍如此。而松材线虫R型株系尽管有些个体会有短尾尖突，甚至有些群体大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培养后消失。目前M型松材线虫仅分布于北美，其寄主主要是冷杉属，因此，口岸检疫时发现M型松材线虫的频次极低，必要时需通过分子生物学方法核实。图D.5 松材线虫 M 型株系(标尺=10 m)图D.6 拟松材线虫东亚亚种（上面 4 幅）和欧洲亚种（下面 4 幅）雌虫尾形图(标尺 10 m)注：A.头部；B.交合伞及尾乳突；C-D、F-G、J-K.雌虫尾部；E、I.雄虫尾部及交合刺；H.阴门及阴门盖。图D.7 伪伞滑刃线虫（B.fraudulentus）(标尺=10 m)注：A-B.阴门；C.交合刺；D.交合伞；E-H.培养后雌虫尾部；I-L.原木中分离到的雌虫尾部 图D.8 豆伞滑刃线虫新种雄虫显微照片(标尺=10 m)A B C H G F E D I J K L 注：A、B.头部；C.雌虫阴门盖；D.雌虫阴门至尾末端；E-F.培养后的雌虫尾部形态；G.木质包装中直接分离的雌虫尾部；H.雄虫交合伞；I,J.雄虫交合刺。图D.9 杨伞滑刃线虫光学显微照片(标尺=10 m)E E 附 录 E（规范性附录）特异 PCR 鉴定方法 E.1 试剂 10 PCR Buffer（Mg2+free）、蛋白酶K、2 Taq MasterMix预混液、ddH2O。E.2 实验步骤 E.2.1 DNA提取 方法1（蛋白酶K方法）：将1条或数条线虫放入ddH2O浸泡几分钟后，用毛针挑取单条线虫放入200 L PCR管中（含8 L ddH2O和1 L 10PCR Buffer（Mg2+free），液氮中放置1 min（或超低温冰箱放置20 min以上），85 加热2 min，向PCR管中加入1 L 1 mg/mL蛋白酶K，56 加热15 min，95 加热10 min，即得到线虫DNA模板。得到的DNA提取液可直接进行PCR扩增（或者于-20备用）。方法2（试剂盒法）：市售各种提取试剂盒均可。挑取单条或数条线虫放入ddH2O中，约1分钟后用干净的挑针挑出即可，必要时重复1次；按照说明书要求进行操作，获得线虫DNA模板后可直接进行PCR扩增（或者于-20 备用）。E.2.2 特异PCR扩增 E.2.2.1 引物序列 引物序列见表E.1。表E.1 引物序列 引物名称 碱基序列 扩增片段长度 X-F 5-ACGATGATGCGATTGGTG-3 约 560 bp X-R 5-TATTGGTCGCGGAACAAACC-3 J10-1 5-GGTGTCTAGTATAATATCAGAG-3 约 160 bp J10-2Rc 5-GTGAATTAGTGACGACGGAGTG-3 E.2.2.2 特异PCR扩增反应体系及参数 PCR反应体系见表E.2。X-F/X-R引物对的反应参数：94 4 min；94 30 sec，56 30 sec，72 1 min，35个循环；72 5 min。J10-1和J10-2Rc引物对的反应参数：94 5 min；94 30 sec，64 1 min，72 1 min，35个循环；72 5 min。表E.2 PCR 反应体系 试剂名称 加样量 L 2 Taq MasterMix 预混液 25 正向引物（浓度 10 mol/L）2 反向引物（浓度 10 mol/L）2 DNA 模板 2 ddH2O 补足反应总体积至 50 L 以松材线虫DNA模板作为阳性对照，以不含松材线虫的DNA模板作为阴性对照，以ddH2O作为空白对照。E.2.3 琼脂糖电泳 配制1.0%（质量分数）的琼脂糖凝胶，微波炉溶解后加入GelRed染料（浓度为0.5 g/mL)。凝胶制备后，移液器吸取5 L PCR产物，并选取100 bp DNA Marker分别加到琼脂糖凝胶孔中。接通电源，以3 V/cm5 V/cm电场强度电泳，约0.5 h，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上拍照并保留结果。E.2.4 结果判定 在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下，经琼脂糖电泳：采用X-F/X-R引物对扩增后，电泳检测得到与阳性对照一致的560 bp左右大小的特有条带，或采用J10-1/J10-2Rc引物对得到160 bp左右大小的特有条带，判定结果为阳性；否则判定结果为阴性。阳性对照、阴性对照和（或）空白对照不正确，无论待测样品结果如何，应重复试验。F F 附 录 F（规范性附录）实时荧光 PCR 鉴定方法 F.1 试剂 10 PCR Buffer（Mg2+free）、蛋白酶K、2 Taq MasterMix预混液、ddH2O。F.2 实验步骤 F.2.1 DNA提取 操作方法见附录E.2.1 F.2.2 实时荧光PCR检测 F.2.2.1 引物及探针序列 引物及探针序列见表F.1。表F.1 引物及探针序列 引物名称 碱基序列 正向引物 BsatF 5-TGACGGAGTGAATTGACAAGACA-3 反向引物 BSatRV 5-AAGCTGAAACTTGCCATGCTAAA-3 探针 BSatS 5-FAM-ACACCATTCGAAAGCTAATCGCCTGAGA-TAMRA-3 注：探针 5端含有 FAM 基团的荧光染料，3端含有 TAMRA 基团的荧光染料。F.2.2.2 实时荧光PCR反应体系及参数 每个样品设置3个平行实验，同时每次检测设立3个对照，分别为：含有松材线虫DNA的阳性对照，不含松材线虫DNA的阴性对照以及双蒸水代替模板DNA的空白对照。以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR反应，反应体系见表F.2。表F.2 实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 加样量 L 2 Taq MasterMix 预混液 25 引物 BsatF（浓度 10 mol/L）2 引物 BSatRV（浓度 10 mol/L）2 探针 BSatS（浓度 10 mol/L）1 DNA 模板 2 ddH2O 补足反应总体积至 50 L 实时荧光PCR的反应参数：95 10 min；95 15 sec，60 45 sec，共40个循环。对PCR反应管荧光信号的收集条件应与探针的荧光基团一致，具体设置方法参照相应荧光PCR仪的使用说明。F.2.3 结果判定 实时荧光PCR反应结束后，应设置无