DB45T 2353 猪主要病毒性腹泻鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法-（高清正版）.pdf

ICS 11.CCS B 4广猪主Diff2021-220 41 西壮主要病ferentia-07-27 发壮族病毒性转l detect发布 广西壮族自性腹泻转录聚tion of mmu壮族自治区自治 泻病毒聚合酶major poultiplex 区市场监督区毒鉴别酶链反rcine viRT-PCR 督管理局 地DB别检测应法 ral diar 发 布 4方标B45/T 235测 多rrhea vi2021-0布 45 标准532021 多重反rusesA08-31 实准 反A 实施DB45/T 23532021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.2 5 材料准备.2 6 操作方法.3 6.1 操作环境.3 6.2 待检样品处理.3 6.3 待检样品总 RNA 提取.3 6.4 RT 反应.3 6.5 PCR 扩增.3 6.6 阴性及阳性对照.4 6.7 扩增产物电泳检测.4 7 结果判定.4 附录 A（规范性）引物序列、扩增片段及结果判定.6 附录 B（规范性）重组质粒标准品制备.8 DB45/T 23532021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本文件起草人：施开创、冯淑萍、尹彦文、陈芳芳、粟艳琼、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军。DB45/T 23532021 1 猪主要病毒性腹泻病毒鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法 1 范围 本文件规定了采用多重反转录聚合酶链反应法鉴别检测猪主要病毒性腹泻病毒的材料准备、操作方法、结果判定等要求。本文件适用于广西行政区域内猪主要病毒性腹泻病毒的鉴别检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 猪主要病毒性腹泻 swine main viral diarrhea 由病毒引起的急性消化道传染病，以厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征，其主要病原有猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒。3.2 猪冠状病毒 porcine coronavirus 为有囊膜的单股正链RNA病毒，主要包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。3.3 猪轮状病毒 porcine rotavirus，PoRV 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，为双股多节段RNA病毒。3.4 反转录 reverse transcription，RT 以RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。3.5 聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 一种在体外快速扩增特定脱氧核糖核酸（DNA）片段的方法。热变性复性延伸三步反应组成一个循环，经多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。3.6 多重聚合酶链反应 multiplex polymerase chain reaction，Multi-PCR 简称多重PCR，是PCR技术的一种形式。同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个模板的PCR技术。DB45/T 23532021 2 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus）PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus）PoRV：猪轮状病毒（porcine rotavirus）RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus）5 材料准备 5.1 试剂 5.1.1 特异性引物 引物序列见附录 A 中的表 A.1，上游、下游引物的使用浓度均为25 pmol/L。5.1.2 RNA 抽提试剂盒 商品化的 RNA 抽提试剂盒使用前经技术验证合格。5.1.3 RT-PCR 试剂盒 商品化的 RT-PCR 试剂盒使用前经技术验证合格。5.1.4 电泳缓冲液 商品化的电泳缓冲液使用前经技术验证合格。5.2 仪器设备及耗材 5.2.1 仪器设备 如下：生物安全柜；普通 PCR 仪；高速台式冷冻离心机；漩涡振荡器；组织匀浆机或研钵；凝胶成像系统；微量移液器；水平电泳仪。5.2.2 一次性耗材 如下：乳胶手套；Eppendorf(EP)管；PCR 管；吸头。DB45/T 23532021 3 注：EP管、PCR管、吸头等使用无RNA酶的一次性塑料制品，否则在使用前应经 DEPC水处理，然后用1.034105 Pa高压灭菌30 min。6 操作方法 6.1 操作环境 有相应的生物安全设施，按样品处理区、核酸提取区、样品配液区、PCR扩增区、结果观察区等不同功能分区，各功能区应有专用试剂和实验耗材，不可交叉混用。操作时，应在生物安全级或级以上防护实验室内且无RNA酶的环境下进行。6.2 待检样品处理 6.2.1 组织样品 取病猪的小肠组织 1 g2 g，置于 2.0 mLEP 管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织匀浆机或研钵充分研磨捣碎组织样品后，反复冻融 3 次；以 10 000g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置-20 保存备用。6.2.2 肛拭子、粪便拭子样品 将样品置于 2.0 mL EP 管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，在漩涡振荡器上振荡 30 s，以 10 000g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置-20保存备用。6.3 待检样品总 RNA 提取 取200 L待检样品于无RNA酶的1.5 m灭菌EP管中，按照RNA提取试剂盒操作说明书提取总RNA。6.4 RT 反应 6.4.1 反应液总量 20 L，在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按下列用量分别加入各成分：5RT 缓冲液 4 L；AMV 反转录酶（5 U/L）0.5 L；dNTP 混合物（各 10 mM/L）1 L；RNA 酶抑制剂（40 U/L）0.5 L；随机引物 6 聚体（50 pmol/L）1.5 L；样品总 RNA 模板：5 L；灭菌双蒸水：7.5 L。6.4.2 加完试剂后立即离心混匀。将 PCR 管置于 PCR 仪内进行反转录，获得 cDNA 直接用于多重 PCR扩增，或置-20保存备用。反应程序如下：a)30保温 10 min；b)45反转录 30 min；c)95反转录酶失活反应 5 min；d)4保温 5 min。6.5 PCR 扩增 6.5.1 反转录后，以获得的 cDNA 为模板建立 50 LPCR 反应体系。在冰浴条件下，按下列用量在 PCR管中分别加入以下成分：DB45/T 23532021 4 2TaqPCR MasterMix25 L；PEDV-N 上、下游引物（25 pmol/L）各 1 L；TGEV-M 上、下游引物（25 pmol/L）各 1 L；PoRV-VP6 上、下游引物（25 pmol/L）各 1.25 L；PDCoV-M 上、下游引物（25 pmol/L）各 1.25 L；cDNA 模板 5 L；灭菌双蒸水 11 L。6.5.2 加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 管置于普通 PCR 仪内，反应结束后，应将 1.5琼脂糖凝胶进行电泳后分析结果。反应程序如下：a)94热变性 5 min；b)94变性 30 s；c)56复性 30 s；d)72聚合 35 s，35 个循环；e)72延伸 10 min。6.6 阴性及阳性对照 6.6.1 阴性对照 用灭菌双蒸水作为阴性对照。6.6.2 阳性对照 用浓度均为每 L107拷贝的 pPEDV-N、pTGEV-M、pPoRV-VP6 和 pPDCoV-M 等 4 种重组质粒混合物作为阳性对照。重组质粒标准品制备见附录 B。6.7 扩增产物电泳检测 6.7.1 称取适量琼脂糖配置 1.5的琼脂糖溶液，充分溶化后按 1:10 000 加入新型核酸染料。倒入胶槽制备凝胶板。6.7.2 在电泳槽中加入 1TAE 电泳缓冲液，使液面没过凝胶板。取 8 L 扩增产物加入到各凝胶孔，取 5 L DL2,000 DNA 分子质量标准加入到另一凝胶孔中。6.7.3 电泳，待染料移行到凝胶板 4/5 距离，结束电泳。6.7.4 将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察，判定结果并做好记录。7 结果判定 将电泳后的琼脂糖凝胶用凝胶成像系统观察并拍照。当阴性对照无任何DNA扩增带，而阳性对照在750 bp、544 bp、329 bp和183 bp位置出现DNA扩增带，则实验结果成立；否则，此次检测无效。实验结果成立时的判定结果如下：被检样品在 750 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PEDV 阳性，标记为 PEDV（+）；若未出现，判定为 PEDV 阴性，标记为 PEDV（-）；被检样品在 544 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 TGEV 阳性，标记为 TGEV（+）；若未出现，判定为 TGEV 阴性，标记为 TGEV（-）；被检样品在 329 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PoRV 阳性，标记为 PoRV（+）；若未出现，判定为 PoRV 阴性，标记为 PoRV（-）；DB45/T 23532021 5 被检样品在 183 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PDCoV 阳性，标记为 PDCoV（+）；若未出现，判定为 PDCoV 阴性，标记为 PDCoV（-）。注：扩增的目的基因片段见附录A中的图A.1。DB45/T 23532021 6 A A 附录A （规范性）引物序列、扩增片段及结果判定 A.1 PEDV、TGEV、PoRV 和 PDCoV 特异性引物序列及扩增片段长度 引物序列及扩增片段长度见表A.1。扩增目的基因片段序列见A.2。表A.1 引物序列及扩增片段长度 引物名称 引物序列（53）目的基因 扩增片段长度bp PEDV-N-F GCATTTCTACTACCTCGGAA PEDV-N 750 PEDV-N-R GCGATCTGAGCATAGCCTGA TGEV-M-F GCGTCTGATTGTGAGTCATG TGEV-M 544 TGEV-M-R GAATAGTCCTGCTGGGTAATG PoRV-VP6-F CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTC PoRV-VP6 329 PoRV-VP6-R CGTTTCGTCGCGACTCTCTAG PDCoV-M-F GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATG PDCoV-M 183 PDCoV-M-R CTGGGCCATCTCCGGTTGGGAATC A.2 扩增的目的基因片段序列 A.2.1 PEDV目的基因片段序列 扩增PEDV N基因750 bp片段。N基因扩增序列为GCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGGCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAATTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATCATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTGCAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAATAGGTCTAGATCTCCAAGTAACAACAGAGGCAATAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAATAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGTGTAACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCACTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGCAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGC。A.2.2 TGEV目的基因片段序列 扩增TGEV M基因 544 bp片段。M 基因扩增序列为GCGTCTGATTGTGAGTCATGCTTCAACGGAGGCGATCTTATTTGGCATCTTGCAAACTGGAACTTCAGCTGGTCTATAATATTGATCGTTTTTATAACTGTGCTACAATATGGAAGACCTCAATTCAGCTGGTTCGTGTATGGCATTAAAATGCTTATAATGTGGCTATTATGGCCCGTTGTTTTGGCTCTTACGATTTTTAATGCATACTCGGAATACCAAGTGTCCAGATATGTAATGTTCGGCTTTAGTATTGCAGGTGCAATTGTTACATTTGTACTCTGGATTATGTATTTTGTAAGATCCATTCAGTTGTACAGAAGGACTAAGTCTTGGTGGTCTTTCAACCCTGAAACTAACGCAATTCTTTGCGTTAGTGCATTAGGAAGAAGCTATGTGCTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGGTGTCACTCTAACTTTGCTTTCAGGGAATTTGTACGCTGAAGGGTTCAAAATTGCAGGTGGTATGAACATCGACAATTTACCAAAATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCAGGACTATTG。A.2.3 PoRV目的基因片段序列 扩增 PoRV M基因329 bp片段。VP6 基因扩增序列为CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTCATTGTCAAAAACCTTAAAAGATGCTAGAGATAAAATTGTTGAAGGTACATTATACTCAAATATAAGTGATTTAATTCAACAGTTCAATCAAATGATAGTTACCATGAATGGAAAAATATAGTAGAGAGA.2.4 扩增TACCCCAATCCTAA标M123456ATGATTTTCAAAGATGCAAATTATGTCGCGACGAAAPDCoV目的基增 PDCoV M基AGCAACCACTCGAACATCAGCTGC引序号说明：DNA 分子质阳性对照；PEDV（+）；TGEV（+）；PoRV-VP6PDCoV-M（阴性对照。图ATGGGAGGAATTGTTGAAAATGACG。基因片段序列基因183 bp片段GTGTTACTTGGCTACCTCTCCG质量标准（DL2,（+）；+）；图A.1 PEDVTAGGAAATTTGGCTAGAACTAC列 段。M 基因扩GGTTAAGGGTTGATTTCCAACC000 Marker）；V、TGEV、PoGCCAATCAGAACCATTGAATAT扩增序列为GTTCGGGAGCTGACGGAGATGGCC；oRV 和 PDCoVAACTGGAATTTTTTTCATTGATTTTCCCAGAGGAAAACACTTCTATTACAG。多重 RT-PCRTGATTTCGGATTTATAGATAATATCTTAAGTATAAACCTCATGTR 扩增结果电DB45/T TTACTTGGCACTGTGTGTATGGTGGTGAACTCCTTGCCAAACGC 电泳图 235320217 CTACTTTACTTGATGAAATGGCCCTCCTAATGACAACCCCAACA TCAADB45/T 2358 B.1 特异性特异性B.2 病毒核 分别取提取总 RNATGEV-M-F/T按 5.5 中的B.3 重组质将PCR产酶试剂盒说平板上，37注：商品B.4 重组质B.4.1 PCR以提取观察，结果B.4.2 测序B.4.2.1 对序列与标准B.4.2.2 经可作为 PCR532021 性引物 性引物序列及核酸提取及 取 PEDV 疫苗 C后，按 6.4 进TGEV-M-R、P的反应程序进质粒标准品构产物进行凝胶说明书将PCR产培养16 h品化的胶回收试质粒标准品鉴R鉴定 取的质粒为模果判定见第7章序鉴定 对获得的质粒准毒株相应区经 PCR、测序反应的阳性扩增片段长度RT-PCR 扩增CV777 株、TG进行反转录PoRV-VP6-F/进行单重 PCR 扩构建 胶电泳、用凝产物连接到pM18 h。挑选蓝试剂盒、T4 连鉴定 模板，利用附录章。粒送商业测序域的序列一致序鉴定正确的重性标准品。附重组质度见附录 A 中增 GEV 疫苗 H 株（RT），获得PoRV-VP6-R、扩增，获得凝胶成像系统MD-18T载体，蓝色的阳性菌接酶试剂盒、录A中表A.1相序公司进行测致。重组质粒，分B B 附录B （规范性）质粒标准品制中的表 A.1。株、PoRV 疫苗得 cDNA。以 cD、PDCoV-M-FPCR 产物。统观察后，按胶，并转化到DH菌落，增菌培质粒提取试剂相应的引物进测序，并将获分别命名为 pC C 制备 苗 N X 株和 PDNA 为模板，F/PDCoV-M-R胶回收试剂盒H5感受态细培养后，按质剂盒使用前经技进行PCR扩增得的序列在pPEDV-N、pTG PDCoV 临床腹分别利用 PER 引物对，建盒说明书回收细胞，涂布于L粒提取试剂盒术验证合格。、凝胶电泳后NCBI 上进行GEV-M、pPoRV腹泻阳性样品EDV-N-F/PED建立 50 L 反应收PCR产物。按LB/Amp+/X-g盒说明书提取 后，用凝胶成行比对，确认所RV-VP6 和 pPD品，按 6.3DV-N-R、应体系，按T4连接gal/IPTG 取质粒。成像系统所获得的DCoV-M，中华人民共和国广西地方标准 猪主要病毒性腹泻病毒鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法 DB 45/T 23532021 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究