激酶mTORC2在EAE模...CD4-+T细胞的调控作用_陈诚.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）是一种由免疫系统介导的慢性炎症性中枢神经系统脱髓鞘疾病，导致肌肉无力、步态困难、视觉障碍甚至瘫痪等症状，最终行为能力丧失，其主要病理特征表现为炎症浸润、脱髓鞘斑块以及轴突浸润1。有研究表明MS 的发病和疾病进程与 EB 病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染、吸烟、维生素D、以及遗传因素有关。中枢神经系统所产生的自身免疫性T细胞反应是MS的诱发因素，但MS的病因及发病机制迄今未明2-4。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE）是MS最常用且可靠的小鼠模型，其疾病特征在许多方面和MS相似5。EAE 模型是通过髓鞘衍生的抗原诱导形成 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0185-07；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230024激酶mTORC2在EAE模型中对致病性CD4+T细胞的调控作用陈诚，路金金，田钦，王怡飞*，叶丽林*摘要 目的 研究mTORC2信号缺陷减轻EAE临床症状和其对致病性CD4+T细胞的调控机制。方法 通过MOG35-55肽免疫分别诱导Rictorfl/flCD4cre（Rictor-/-）和Rictorfl/fl（WT）小鼠，记录其临床症状分数和体质量变化情况，应用流式细胞术检测致病性CD4+T细胞亚群的数目、过氧化脂质水平和线粒体来源的ROS水平。结果 Rictor-/-小鼠中EAE临床症状比WT小鼠更轻，致病性CD4+T细胞更少，且这群细胞更易发生铁死亡。结论 mTORC2信号缺陷通过促使致病性CD4+T细胞发生铁死亡来减轻EAE的临床症状。关键词 mTORC2；Rictor；CD4+T细胞；EAE中图分类号 R392.1文献标识码 AThe kinase complex mTORC2 regulates pathogenic CD4+T cells inEAE murine modelCHEN Cheng1,LU Jinjin2,TIAN Qin1,4,WANG Yifei2,3,*,YE Lilin1,*1.Department of Immunology,Basic Medical College,Army Medical University,Chongqing 400038,China;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Institute ofImmunological Innovation and Translation,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;4.Department of Science and Education,Dermatology Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510091,China*Corresponding Authors:WANG Yifei,E-mail:;YE Lilin,E-mail:Abstract This research is aimed to investigate the mechanism how mTORC2 deficiency alleviates clinicalsymptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)and regulates pathogenic CD4+T cells.Rictorfl/flCD4cremice(Rictor-/-)and Rictorfl/fl(WT)mice were immunized with MOG35-55peptide to induce EAE,andthe clinical scores and body weight changes were recorded.Then,the pathogenic CD4+T cells were detected by flowcytometry to analyze the levels of lipid peroxidation and mitochondrial ROS generation.Compared with WT mice,Rictor-/-mice showed milder clinical symptoms of EAE and decreased pathogenic CD4+T cell population.Mechanistically,mTORC2 deficiency alleviates the clinical symptoms of EAE via inducing ferroptosis in pathogenicCD4+T cells.Key words mTORC2;Rictor;CD4+T cells;EAE基金项目：国家自然科学基金（31825011)作者单位：400038 重庆，陆军军医大学全军免疫学研究所（陈 诚，田 钦，叶丽林）；510515 广州，南方医科大学检验医学与生物技术学院（路金金，王怡飞）；400016，重庆医科大学免疫创新与转化研究院（王怡飞）；510091 广州，南方医科大学皮肤病医院科教科（田 钦）*通信作者：王怡飞，E-mail:；叶丽林，E-mail:185免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023的，EAE模型在研究MS的病因、发病机制以及治疗等方面不可或缺6。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）是一种表达于中枢神经系统的微量成分，MOG35-55是可以诱导中枢神经系统中产生强烈T细胞和B细胞反应的免疫优势表位，可以诱发MS的脱髓鞘特征，具有高度的免疫原性，是目前最常用的建立EAE模型的髓鞘抗原，用于诱导慢性EAE疾病模型，通常在建模后914 d开始诱发小鼠产生临床症状6-7。CD4+T细胞在适应性免疫应答中有着不可或缺的作用。在不同的抗原刺激的条件下，幼稚CD4+T细胞可分化为Th1、Th2、Th17和Treg等功能和特征各异的辅助性T细胞8。MS的发病机制主要由T细胞介导，T细胞在外周被中枢神经相关抗原激活，这些T细胞激活后穿过血脑屏障并进入中枢神经系统，使其产生病变并出现相应的临床症状，而CD4+T细胞在MS中的致病性已在EAE模型中得到证实9。之前的研究发现中枢神经系统自身免疫性疾病由产生 IFN-的 Th1 和产生 IL-17 的 Th17 等致病性CD4+T细胞亚群导致的，而大多数的研究表明致病性Th17是导致MS的罪魁祸首2,10。而在MS中，这群致病性CD4+T细胞具有长期存活的记忆细胞特征、对自身抗原产生有效反应并且可以介导自身免疫反应的反复发作11。在既往的研究中，我们发现激酶mTORC2信号对记忆性CD4+T细胞的维持起到重要的作用；这一发现推动我们探究此信号通路是否可调控自身免疫性疾病中的致病性CD4+T细胞的长期维持。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）是在进化上保守的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，密切调控 T 细胞的分化、功能和存活。mTOR 激酶由 mTORC1 和 mTORC2 两种复合体构成，它们有着相同的催化亚基mTOR，但是它们的支架亚基不同，Raptor 和 Rictor 缺失能够分别抑制mTORC1和mTORC2信号传导12-13。我们之前的研究发现敲除T细胞内Rictor基因会导致记忆性CD4+T 细胞发生铁死亡，mTORC2 通过 mTORC2p-AKTSer473p-GSK3Ser9这一信号通路来维持病毒特异性CD4+T细胞的长期存活14。基于此，我们认为，探究是否能够通过阻止mTORC2信号传导来引发自身反应性CD4+T细胞发生铁死亡来减轻EAE小鼠模型的临床症，具有一定的科学及临床意义。1材料与方法1.1实验材料MOG35-55短肽于中肽生化合成；弗氏完全佐剂、RPMI-1640培养基、PMA和Ionomycincalcium salt钙盐购自美国Sigma公司；百日咳毒素购自Enzo Life Sciences Inc公司；结核杆菌毒素购自List Labs公司；胎牛血清（FBS）、丙酮酸钠和非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；青-链霉素购自索莱宝公司；Percoll细胞分离液购自GE Healthcare公司；荧光标记抗小鼠抗体 FITC-IL-17A、PE(APC)-RORt、Percp(BV-510)-CD4、Percp(PE-cy7)-CD44、PB-IFN-和 PB-T-bet 等购自 Biolegend 公司；p-AKTSer473、p-S6 和 APC(FITC)-anti-Rabbit 购自 CellSignaling Technology 公司。胞内染色试剂盒、磷酸化染色试剂、BD Canto2流式分析仪、BD Fortessa流式分析仪和 BD Aria3 流式分选仪均为 BD 公司产品；FOXP3细胞核内染色试剂盒购自eBioscience公司。Rictorfl/fl、CD4cre基因小鼠和C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory和斯贝福公司。Rictorfl/fl和CD4cre交配获得Rictorfl/flCD4cre（Rictor-/-，KO）小鼠。所有小鼠均饲养于温度为 25、湿度为 55%、12 h 光照/12 h黑暗的无特定病原体（SPF）动物房内，68周龄小鼠用于实验，且实验中所用小鼠雌雄均有。1.2EAE模型的诱导将MOG35-55肽用PBS溶解配制成2 mg/ml溶液，每只小鼠注射剂量为200 g，结核杆菌毒素用10 mg/ml的弗氏完全佐剂（CFA）溶液稀释成5 mg/ml，将稀释好的MOG35-55肽溶液和CFA溶液1 1混合后超声乳化，乳化液滴入水相后乳化物不散开即可用于后续实验，每只小鼠腹部皮下多点注射乳化液200 l，免疫后2 h和26 h 2次腹腔注射百日咳毒素500 ng（2次共1 g）。1.3EAE小鼠的体质量和临床症状评估在免疫的1周内，每2天观察并记录造模小鼠的体质量和临床症状，1周后每天记录。EAE模型小鼠临床症状评分：0分，无任何临床症状；0.5分，小鼠尾巴部分丧失紧张感，步态正常，一半的尾巴丧失紧张感，拿着小鼠时尾巴顶端不能弯曲；1分，尾巴瘫痪，步态正常，尾巴完全软弱无力气；2分，中等程度的后肢轻瘫，后肢无力，蹒跚行走；2.5分，严重的后肢无力，将小鼠倒置后很难翻转回去；3分，部分的后肢瘫痪，不能转向，拖动一只后肢；3.5分，后肢瘫痪，拖动2个186免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023后肢；4分，后肢瘫痪和部分的前肢瘫痪，前肢还有一些移动；4.5分，四肢瘫痪，不移动，垂死；5分，小鼠死亡15。1.4小鼠中枢神经系统T细胞获取麻醉诱导成功的EAE小鼠，PBS灌流冲洗出循环血液，取出小鼠的大脑和脊髓组织，于70 m的细胞滤网中研磨成细胞悬液，用R2（含2%FBS的1640-RPMI培养基）冲洗滤网，1 800 r/min离心6 min，用44%和66%的Percoll溶液2 100 r/min离心40 min进行细胞分层得到淋巴细胞。1.5体外诱导CD4+T细胞分化提前一晚用anti-CD3（5 g/ml）包被48孔板，置于4 冰箱过夜。次日，在无菌条件下将小鼠的脾脏取出，于无菌70 m细胞滤网中研磨得到淋巴细胞悬液，经BD Aria3流式分选仪分选出 CD4+CD25-GITR-CD44-CD62L+的幼稚CD4+T细胞。48孔板中每孔加入约0.25 106分选的细胞，将不同的细胞因子和抗体加入完全培养基（RPMI-1640+10%FBS+1%非必需氨基酸+1%青链霉素+1%巯基乙醇）配成细胞极化工作液，anti-CD28(2 g/ml)、anti-IFN-（5 g/ml）、anti-IL-4（5 g/ml）、IL-6（25 ng/ml）、IL-1（20 ng/ml）和IL-23（20 ng/ml）用于致病性Th17(pTh17)的分化,体外极化的细胞培养72 h后进行检测。1.6流式细胞术检测中枢神经系统T细胞将细胞悬液加入96孔圆底板中，2 000 r/min离心1 min，用FACS缓冲液（2%FBS+PBS）洗涤3次，将配制好的抗体染色液加入细胞中（50 l/孔）并重悬均匀，置于冰上避光染色30 min，染色结束后用FACS洗涤细胞3次，表面标志物染色结束后，根据实验目的，进行后续胞内或者核内染色。对于IFN-和IL-17A细胞内蛋白标志物染色，参考BD胞内染色试剂盒说明书进行染色；对于T-bet和RORt细胞核内蛋白标志物染色，参考eBioscience公司的FOXP3细胞核内染色试剂盒进行染色。1.7脂质过氧化探针和线粒体染料染色细胞先进行表面标志物抗体染色，然后进行脂质过氧化探针和线粒体染料染色。脂质过氧化探针Bodipy C11用PBS配制成5 mol/L的工作液，于37 、5%CO2的条件下孵育30 min，洗涤细胞3次后进行流式检测（FL1通道）；检测线粒体ROS的染料MitoSOX用R10（含10%FBS的RPMI）配制成5 mol/L的工作液，在37 、5%CO2的条件下孵育30 min，洗涤细胞3次后进行流式检测（FL2通道）。1.8统计学分析使用FlowJoV10软件分析流式数据，并且用GraphPad Prism9.0进行统计分析并且绘制EAE模型小鼠临床症状评分和体质量变化曲线。两组之间采用非配对t检验，P0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1致病性Th17中mTORC2活性更强我们用MOG35-55肽免疫诱导C57BL/6J小鼠建立EAE模型，取发病小鼠，引流淋巴结、大脑和脊髓，分离得到淋巴细胞，并通过流式检测引流淋巴结、大脑和脊髓中不同致病性CD4+T细胞亚群中mTORC2活性。在引流淋巴结、大脑和脊髓中存在着一定比例的T-bet+Th1、RORt+Th17和T-bet+RORt+pTh17，且中枢神经系统中此3群细胞比例明显高于引流淋巴结中的比例（图1a）；相较于T-bet+Th1和幼稚CD4+T细胞（CD4+CD44low），RORt+Th17和T-bet+RORt+pTh17（致病性Th17）表达更高水平的p-AKTSer473（图1a，b），结果表明Th17和pTh17中mTORC2活性更强，可能在EAE的疾病进程中有着更为重要的调控功能。2.2T细胞内mTORC2信号缺陷对EAE小鼠的临床症状和体质量变化的影响使用MOG35-55肽免疫分别免疫Rictor-/-（KO）和WT小鼠，在免疫后第1天开始记录EAE诱导小鼠的临床症状评分和体质量变化情况。从第10天开始，小鼠开始出现临床症状并且体质量开始减轻，在经历发病急性期进入平台期后，和WT小鼠相比，KO小鼠症状更轻并恢复更好（图2a），体质量也明显比WT小鼠恢复得更好（图2b）。以上结果表明在T细胞中特异性敲除Rictor会使得EAE小鼠症状更轻、恢复更好。2.3在T细胞中特异性敲除Rictor导致pTh17更少为了证实阻断mTORC2信号会通过影响致病性CD4+T细胞来减轻EAE小鼠的症状，我们通过流式细胞术检测分析小鼠脊髓和大脑中浸润的致病性CD4+T细胞亚群的数量。在Rictor-/-小鼠的大脑（图3a）和脊髓（图 3b）中，浸润的 IFN+Th1、IL-17+Th17、IFN+IL-17+pTh17等致病性CD4+T细胞亚群细胞数量显著少于WT小鼠。以上实验结果说明在T细胞中特异性敲除Rictor可有效减少EAE小鼠体内致病性的pTh17细胞。187免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023a)Flow cytometric analysis of the proportion of T-bet+Th1,RORt+Th17,T-bet+RORt+pTh17,and the expression of p-AKTSer473in Th1,Th17,pTh17 and CD4+CD44lowT cells on day 15 after EAE induction(n=7)in the DLNs,brain and spinal cord;b)comparison of p-AKTSer473levels on Th1,Th17,pTh17andCD4+CD44lowTcellsintheDLNs,brainandspinalcord,respectively.ns:notsignificant;*P0.01;*P0.001,*P0.0001.图1EAE模型中CD4+T细胞各亚群中mTORC2信号的活化情况Fig 1The activity of mTORC2 signaling in CD4+T cell subsets of EAE modela,b)The clinical symptom score and body weight changes curve of the Rictor-/-(KO,n=12)and WT(WT,n=11)group.Data are presented as meanvalues SEM and analyzed by multiple unpaired t test.*P0.05;*P0.01.图 2T细胞内mTORC2信号缺陷对EAE小鼠临床症状和体质量变化的影响Fig 2mTORC2 deficiency in T cell affects the clinical outcome of EAE mice188免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.20232.4在T细胞中特异性敲除Rictor不影响pTh17体外分化为了分析在T细胞中特异性敲除Rictor导致的pTh17细胞数目减少是否与pTh17分化受抑制有关，我们通过流式分选，得到来自Rictor-/-和WT小鼠的幼稚CD4+T细胞(CD4+CD25-GITR-CD44-CD62L+),检测其体外被诱导分化为pTh17的水平。在Rictor-/-和WT CD4+T细胞中，pTh17分化效率没有明显差异（图4），以上结果证明Rictor敲除不影响pTh17的分化，提示pTh17的细胞数量减少和其分化能力无关。2.5在 T 细胞中特异性敲除 Rictor 导致致病性CD4+T细胞发生铁死亡我们既往的研究阐明了mTORC2信号缺陷会诱导铁死亡，从而抑制记忆性CD4+T细胞的长效维持。为分析Rictor敲除导致的EAE小鼠症状减轻是否亦由中枢神经系统中致病性CD4+T细胞发生铁死亡所导致，我们通过流式检测EAE小鼠的引流淋巴结、脊髓和大脑中CD44hiCD4+T细胞内线粒体活性氧（ROS）的产生水平。结果表明，相较于WT细胞，Rictor-/-CD4+CD44hiT细胞产生更多的线粒体ROS（图5a、b）。已知线粒体来源的ROS产生与细胞发生铁死亡密切相关，而Th1、Th17和pTh17是EAE模型中CD44hiCD4+T细胞的主要亚群。以上实验结果表明敲除Rictor可能诱导中枢神经系统中致病性CD4+T细胞发生铁死亡。同时，我们使用Bodipy C11脂质过氧化探针检测Rictor-/-和WT小鼠中记忆性CD4+T细胞脂质过氧化水平，从而指征铁死亡。结果显示Rictor-/-小鼠中大脑、脊髓和引流淋巴结中的CD44hiCD4+T细胞累积的脂质过氧化物水平显著升高（图5c，d），提示铁死亡的发生。以上实验结果证明，mTORC2信号缺陷可诱导EAE模型中致病性CD4+T细胞发生铁死亡。3讨论在自身免疫性疾病中，Th17细胞被证明能够破坏血脑屏障，促进免疫细胞进入中枢神经系统并增Comparison of the cell number of IFN+Th1,IL-17+Th17,and IFN+IL-17+pTh17 in brain(a)and spinal(b)cord between the Rictor-/-mice(n=4)and WT mice(n=6)on day 26 after EAE induction.Data are presented as mean values SD and analyzed by unpaired t test with Welch s correction.*P 0.05;*P 0.01.图 3mTORC2信号缺乏减少Th1、Th17和pTh17的细胞数量Fig 3mTORC2 deficiency decreases the cell number of Th1,Th17 and pTh17 cells in EAE mice189免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023强炎症反应和介导组织损伤16-17。2010年，John等人发现了一群T-bet+RORt+pTh17细胞，通过过继转移实验证明这群 T-bet+RORt+pTh17 比 RORt+pTh17 在 EAE 小鼠中能引起的更严重的临床症状18。在本研究中，通过构建EAE小鼠模型，我们发现不管是在中枢神经系统还是引流淋巴结中，Th17和 pTh17 两群细胞 mTORC2 的活性明显高于幼稚CD4+T细胞和Th1，提示mTORC2信号在EAE发病过程中可能发挥重要的调控功能。基于以上结果，我们在 T 细胞中特异性敲除 Rictor 以阻断 T 细胞mTORC2信号的传导，然后诱导EAE，发现Rictor-/-小鼠表现出更轻的临床症状，并且无论在Rictor-/-小鼠的外周淋巴组织还是中枢神经系统中，Th1、Th17和 pTh17 的数量显著减少。之前有研究证实mTORC2缺乏不会影响Th1和Th17分化19，本研究中的CD4+T细胞体外分化实验同样证实mTORC2缺乏不会抑制pTh17的分化，因此mTORC2缺乏引起的Th1、Th17和pTh17的减少是由其他原因造成的。我们早期的研究发现mTORC2p-AKTSer473p-GSK3Ser9信号通路在预防细胞发生铁死亡促进记a)Flow cytometry analysis of T-bet+RORt+pTh17 cells from Rictor-/-and WT mice after 72 hours ex vivo differentiation;b)comparison of thefrequency of T-bet+RORt+pTh17 cell in CD4+T cells between the Rictor-/-(n=3)and WT(n=3)groups.Data are presented as mean values SD andanalyzed by unpaired t test.ns:not significant.图 4mTORC2信号缺乏不影响pTh17体外分化效率Fig 4mTORC2 deficiency do not affect the ex vivo differentiation of pTh17a,b)Flow cytometry analysis of MitoSOX intensity of Rictor-/-(n=3)and WT(n=3)group at day 32 after EAE induction;c,d)flow cytometryanalysis of Bodipy C11 intensity of Rictor-/-(n=3)and WT(n=3)group on day 32 after EAE induction.Data are presented as mean values SD andanalyzed by unpaired t test.ns:not significant.*P0.05,*P0.001.图5mTORC2信号缺乏诱导致病性CD4+T细胞发生铁死亡Fig 5mTORC2 deficiency induces ferroptosis in pathogenic CD4+T cells in EAE mice190免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023忆性CD4+T细胞长效维持中发挥重要调控作用14。受损的mTORC2信号会促使记忆性CD4+T细胞产生大量的ROS，并抑制CD4+T细胞的抗氧化能力，从而使细胞发生铁死亡14。在本研究中，我们发现mTORC2信号缺陷同样内源性诱导EAE模型中延绵存在的致病性CD4+T细胞发生铁死亡。本研究结果提示，阻断mTORC2p-AKTSer473p-GSK3Ser9信号通路可以促进致病性CD4+T细胞发生铁死亡，控制EAE的发生发展。值得注意的是，铁死亡抑制剂liproxstatin-1可抑制铁死亡以促进记忆性CD4+T细胞的维持14，但同时也可以抑制疾病过程中神经元自身的铁死亡，最终减轻EAE的临床症状20。因此，我们的研究结果从另一方面提示了上述药物类型在进一步的研究与推广中，机制上存在一定的负面影响，需纳入考虑。而如何更具针对性地调控致病性CD4+T细胞内mTORC2信号通路，控制自身免疫性疾病，还有待更深入的研究探索。综上，我们发现在T细胞中特异性敲除Rictor阻断mTORC2信号能够诱导EAE模型中致病性CD4+T细胞发生铁死亡，从而减轻其临床症状。这一研究为临床MS的治疗提供了新的思路。【参考文献】1Dobson R,Giovannoni G.Multiple sclerosis-a review J.Eur J Neurol,2019,26(1):27-40.2Goverman J.Autoimmune T cell responses in the centralnervous system J.Nat Rev Immunol,2009,9(6):393-407.3Yamout BI,Alroughani R.Multiple Sclerosis J.SeminNeurol,2018,38(2):212-225.4杨 帆,顔光涛,李 涛.多发性硬化相关T细胞免疫机制的研究进展 J.免疫学杂志,2013,29(5):452-456.5ConstantinescuCS,FarooqiN,OBrienK,etal.Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)as amodel for multiple sclerosis(MS)J.Br J 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