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ICS 65.020.30 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 38062020 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范 Guideline for surveillance of kiwifruit bacterial canker 2020-05-25 发布 2020-06-25 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 38062020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准制定由江苏省中国科学院植物研究所提出。本标准由江苏省林业局归口。本标准起草单位：江苏省中国科学院植物研究所，江苏长江果品产业研究院有限公司。本标准主要起草人：贾展慧、王刚、张计育、王涛、郭忠仁、宣继萍、张英、沈强、王建。DB32/T 38062020 1 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范 1 范围 本标准规定了猕猴桃溃疡病的监测原理、监测准备、监测区域、监测时期、监测方法、可疑样本检测方法、监测结论和资料保存。本标准适用于江苏地区猕猴桃细菌性溃疡病的疫情监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 236212009 农业植物检疫实验室基础条件 LY/T 16812006 林业有害生物发生及成灾标准 3 监测原理 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa）属于薄壁菌门（Gracilicutes）变形菌纲（Proteobacteria）假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas），是引发猕猴桃细菌性溃疡病的致病细菌。设置监测区域，通过踏查和调查，依据猕猴桃细菌性溃疡病田间症状（参见附录A）、可疑样本病原菌检测及病原细菌生物学特征、致病性和分子生物学检测鉴定结果进行病害监测。4 监测准备 收集当地猕猴桃属植物种植情况、猕猴桃细菌性溃疡病发生历史和现状等相关资料，制定有效易行的猕猴桃细菌性溃疡病监测计划。5 监测区域 5.1 一般要求 监测区域包含猕猴桃栽培种植果园、林场、种质资源圃、种苗繁育基地、砧穗繁殖圃、境外引进猕猴桃种苗种植区等，重点监测红阳、金艳、楚红、Hort 16A、西选 2 号等易感病猕猴桃品种的集中种植区域。5.2 未发生区 重点监测疫情高风险区域，包括毗邻发生区的区域、有猕猴桃细菌性溃疡病发生历史的果园、新建果园；猕猴桃产品集散地周围猕猴桃种植区，通往疫情发生区域交通要道沿线猕猴桃属、种植物等。5.3 发生区 DB32/T 38062020 2 重点监测发生猕猴桃细菌性溃疡病的种植区及周边区域。6 监测时期 在每年34月春芽膨大期和910月初秋溃疡病发病小高峰时期分别进行1次监测；11月下旬至来年1月期间遭遇大风、暴雨、极速降温等异常天气应及时增加1次监测。7 监测方法 7.1 访问调查 向果农、相关生产经营者、农技人员等询问调查当地猕猴桃种植和猕猴桃细菌性溃疡病发生的情况，特别是苗木、接穗和花粉来源和有无猕猴桃细菌性溃疡病疑似症状等情况，将调查记录填入附录B中表B.1。7.2 踏查 对访问调查过程中发现的疫情发生区、可疑发生区和高风险区域进行重点踏查，踏查面积不小于被查面积的50%。以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查，重点检查枝蔓及其分杈处、茎蔓幼芽、皮孔、落叶痕和新生叶片等（参见附录A第A.4节）。踏查发现可疑症状应直接采样进行室内检测。确认有疫情需进一步掌握危害情况的，应设样方做详细调查。7.3 样方调查 7.3.1 种苗、接穗繁育基地样方设置与调查 样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。每块样方面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树5株10株，进行病害分级调查（参见附录C）。7.3.2 果园样方设置与调查 按果园面积设置，10 hm2以下（含10hm2）设1块样方，每增加5 hm2增设1块样方。每块样方面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树10株，进行病害分级调查（参见附录C），将调查数据填入附录B中表B.2。8 可疑样本检测方法 8.1 采集部位 所采集的样品应包含植物的感病叶片、花蕾、嫩梢、枝条等部分，应尽可能采集病株感病初期的部位，以利于病原细菌的分离。8.2 样品保存 样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。8.3 实验室要求 DB32/T 38062020 3 猕猴桃细菌性溃疡病菌鉴定用实验室的设置与管理符合GB/T 236212009中农业植物检疫实验室基础条件要求。8.4 常规检测 8.4.1 溢菌检查 用手术刀取一小块病健交界处组织，放于载玻片上，向病变组织上滴12滴无菌水或蒸馏水，加盖玻片后在低倍显微镜下（10X）观察，检查在水滴与组织交界处是否有云雾状菌溢。8.4.2 革兰氏染色检测 检查到菌溢的载玻片将植物组织移去，水滴干燥后通过火焰固定，采用结晶紫草酸胺染色法染色，观察染色反应。8.4.3 形态特征检测 病原菌分离纯化、保存过程参见附录D。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征参见附录A第A.6章，根据菌落特征选取可疑菌落做进一步致病性测定和分子生物学检验。8.4.4 致病性的测定 8.4.4.1 烟草过敏性反应 将8.4.3纯化的猕猴桃溃疡病病原菌菌株划线培养后，取生长旺盛的菌株用平板计数法配成3 108CFU/mL 的菌悬液，采用表皮皮下注射法注射2l菌悬液在六叶龄烟草叶片的细胞间，以注射2l蒸馏水为对照，3次重复，置于25培养，12h后观察烟草叶片过敏性反应。8.4.4.2 常规接种测定 对烟草叶片呈过敏反应的菌株，取浓度为3 108CFU/ml的菌悬液2l，对红阳猕猴桃健康叶片和枝条进行离体针刺涂抹法接种，以蒸馏水接种为对照，3次重复，置于20恒温保湿环境，5d后逐日观察其发病情况，至20d。8.5 分子生物学检验 用已知的猕猴桃溃疡病菌菌株作为阳性对照，非猕猴桃溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照，无菌水作为空白对照进行PCR检测。待测菌株DNA提取和PCR检测方法参见附录E，如采用市售的试剂盒，按说明操作。8.6 结果判定 8.6.1 症状识别判定 田间植株发病症状符合附录A描述猕猴桃细菌性溃疡病典型症状，判定为猕猴桃细菌性溃疡病。8.6.2 常规诊断判定 镜检有溢菌现象，革兰氏染色菌体呈红色，即呈现阴性反应，分离培养物在选择培养基上的菌落特征和培养特性符合附录A第A.5章描述，致病性测定产生典型症状，并再次从接种病斑成功分离病原菌，确定病原菌为猕猴桃细菌性溃疡病菌。8.6.3 分子生物学检验结果判定 观察PCR检测电泳结果，如扩增产物的片断大小与附录E第E.6描章描述相符，可以判定样品携带猕猴桃细菌性溃疡病病菌，否则为阴性反应，即样品不携带猕猴桃细菌性溃疡病病菌。8.7 检验记录 DB32/T 38062020 4 检验记录应包括：样品来源、种类（品种）、时间，检测的时间、地点、方法和结果，PCR检测需要有电泳结果照片等，并要有检测人员、审核人员签字。上述材料应归档并妥善保存。9 监测结论 整理汇总猕猴桃细菌性溃疡病监测调查记录，包括猕猴桃细菌性溃疡病的发生面积、发生范围、危害程度和变化趋势，病原鉴定过程中的各类信息（包括照片、影像等）等详细资料，并根据LY/T 16812006 林业有害生物发生及成灾标准评估疫情状况，形成监测报告，按国家、省林业主管部门规定上报。10 资料保存 监测过程中的各类信息（包括照片、影像等）等详细资料应建立专门监测档案，妥善保存以备查。DB32/T 38062020 5 A A 附 录 A（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)相关资料 A.1 英文名称 Kiwifruit bacterial canker A.2 学名 Pseudomonas syringae pv.actinidiae A.3 发病规律 溃疡病菌主要在枝蔓病组织内越冬，春季从病部伴菌脓溢出，通过风、雨、昆虫和农事作业、工具传播，从伤口或自然孔口侵染寄主。经过一段潜伏繁育期，逐渐导致发病。新菌斑溢出菌脓后，经传播进行再侵染为害。该病菌属于低温高湿性侵染病菌，一年有两个发病高峰时期，第一个高峰时期是猕猴桃萌芽前10天至落花期。春季旬均气温1014时（江苏省一般为3月上旬）开始发病，以主干、枝蔓发病为主，叶片发病很少。随温度升高，主干和枝蔓逐渐停止发病，叶片、花蕾和花瓣上开始发病。如遇高温阴雨天气，病害容易流行。入夏气温升高，病害停止流行。第二个发病时期是秋季果实成熟期前后。一般在9月中旬开始发病，主要危害秋梢叶片，主干、枝蔓很少发病。受害植株发病，上部枝条枯死后，又可萌发新枝，翌年感病后再次死亡，循环23年后，整株死亡。A.4 症状诊断 主要危害枝蔓、枝条，也可为害叶片和果实，以枝蔓受害最重。A.4.1 枝溃疡症状 枝蔓受害，多从萌芽初期开始发病，初期呈水渍状，后扩大，颜色加深，皮层组织隆起变软，有淡黄色或黄褐色病斑。后期病斑处皮层纵向线状开裂，伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出滴状黄白色菌脓，干后在菌斑表面形成红褐色点状脓胶，剥开皮层后可见木质部呈黑褐色，韧皮部腐烂。小枝条受害，多从芽周围发生，初期产生暗绿色或暗褐色水渍状，后很快扩展为暗褐色腐烂病斑，稍凹陷，易造成新梢枝叶萎蔫枯死。A.4.2 叶斑症状 主要危害新生叶片，感病初期叶面呈现红褐色小点，后扩展为2mm3mm深褐色不规则或多角形病斑，病斑周围有2mm5mm的明显黄色水渍状晕圈。病叶向里或向外翻卷，易脱落。A.4.3 花果腐症状 花蕾受害后不能张开，变褐死后脱落；果实受害，造成果实软腐，伤口处有褐色汁液流出。DB32/T 38062020 6 A.5 病原菌形态特征及培养性状 猕猴桃溃疡病菌为革兰阴性细菌，好氧。菌体短杆状，两端钝圆，单细胞，菌体大小为（1.42.3）m（0.30.5）m，鞭毛极生，多为1根，少数为23根，无荚膜，无芽孢。在牛肉蛋白胨培养基（BPA）平板上培养，菌落直径1mm3 mm，乳白色、圆形、凸起、边缘整齐，有光泽。在金氏B培养基（KBA）平板上培养形成白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光的菌落。病原菌生长最适温度为2528，生长最高温度为35，生长最低温度为-12以下，致死温度为5510min。A.6 传播途径 在田间，该病原菌主要通过雨水、灌溉水、农具、昆虫等传播，由伤口、自然孔口侵入寄主组织。可随种苗、接穗、砧木、花粉和昆虫等病菌携带者远距离传播。DB32/T 38062020 7 B B 附 录 B（规范性附录）猕猴桃细菌性溃疡病调查记录表 表表B.1B.1 猕猴桃细菌性溃疡病访问调查记录表猕猴桃细菌性溃疡病访问调查记录表 调查单位：调查人：调 查 地 点：市 县 乡（镇）村（组）调查日期：年 月 日 经度/纬度 坡度/坡向 土壤质地、湿度与土壤厚度（cm）当地温度和降雨（特别记录休眠期 11-1 月以及萌芽期 3-4 月的情形）业主姓名：联系方式：品种：平均树龄（年）种植面积（hm2）调查面积（hm2）种苗来源：接穗来源：花粉来源：灌溉和排水情形 施肥情形 栽培方法（指出特点）症状描述：感病各级株数：_：_：_：_：_：_ 果园感病等级：备注：DB32/T 38062020 8 表表B.2B.2 猕猴桃细菌性溃疡病猕猴桃细菌性溃疡病监测监测调查记录表调查记录表 调查单位：调查时间：年 月 日 检测编号 作物品种及类型（苗圃、果园）调查地点 监测面积（hm2）调查株数 感病等级 株数 监测（鉴定）结果 调查人（签字）：DB32/T 38062020 9 C C 附 录 C（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病病害分级表 单株感病分级 级数 症状描述 级 主干无病斑，全株枝条、蔓、叶无病 级 主干无病斑，120 片叶片或 1/3 枝条发病 级 主干无病斑，2130 片叶片或 1/31/2 枝条发病 级 病斑绕主干 1/41/2 或 31 片以上叶片或 1/2 以上枝条发病 级 病斑绕主干 1/23/4，或植株部分枯死 级 病斑绕主干超过 3/4，或全株死亡 果园感病分级（以感病株率计）无 未发现感病株 轻 感病株率 3%10%中 感病株率 11%20%重 感病株率 21%以上 DB32/T 38062020 10 D D 附 录 D（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)分离纯化步骤 D.1 病原菌分离纯化步骤病原菌分离纯化步骤 无菌条件下用手术刀取病健交界处组织（2mm3mm）（2mm3mm），分别用70%乙醇和0.5%1.0%的次氯酸钠表面消毒3min5min，再用无菌水冲洗3次后，放在灭菌研钵中，用解剖刀充分切碎，加1ml无菌蒸馏水研磨成浆状。静置10min，用灭菌接种环蘸取以上组织液，在培养基平板上划线培养；先在平板的一侧顺序划3条5条线，再将培养皿转60，将接种环灭菌后，从第二条线末端划出3条5条线。将培养皿倒置于25恒温培养48h72h。筛选疑似单菌落进行划线纯化，25恒温培养48 h后，观察菌落形态和病原菌形态特征。D.2 培养基配方培养基配方 D.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏蛋白胨培养基（BPA）：）：牛肉浸膏 3.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母粉 1.0 g 蔗糖 10.0 g 琼脂粉 15.0 g 蒸馏水补充至 1000mL 将上述药品溶于蒸馏水，并调pH值到6.87.0，灭菌（121）15min D.2.2 金氏金氏B培养基（培养基（KBA）：）：蛋白胨 20.0 g 甘油 10.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4）1.5 g 硫酸镁（MgSO4 7H2O）1.5 g 琼脂粉 15.0 g 蒸馏水补充至 1000mL 将上述药品溶于蒸馏水，并调pH值到6.87.0，灭菌（121）15min DB32/T 38062020 11 E E 附 录 E（资料性附录）猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)的 PCR 检测方法 E.1 试剂及配制 PCR试剂：特异引物对（10mol/l）、dNTP（25mmol/l）、PCR缓冲液（10）、氯化镁（25mmol/l）、Taq DNA聚合酶（5U/l）。2000bp DNA Marker、5mol/l NaCl、蛋白酶K（20mg/ml）、RNase A（10mg/ml）、无水乙醇、70%乙醇、核酸染料 电泳缓冲液TBE（5）（pH8.0）：每升溶液中含54g Tris，27.5g硼酸，10mM EDTA。电泳时稀释成1 浓度使用。琼脂糖凝胶（1%）：称取0.1g琼脂糖加入到10ml 1 TBE溶液中，微波炉煮沸后加入1体积核酸染料，混匀后制胶。E.2 细菌DNA提取 用接种环挑取12个9.4.3中纯化菌苔加入150l无菌水中，混匀，100煮沸10min，12000rpm/min离心10min，取上清作为待测模板。亦可按常规方法或试剂盒提取细菌DNA后作为模板。4保存备用。E.3 PCR检测 E.3.1 PCR检测引物 使用基于16SrDNA和16S-23SrDNA间隔区序列（ITS）开发的猕猴桃溃疡病鉴定引物27F/1492R、Psa F1/Psa R2引物类型见下表：表E.1 引物类型 引物类型 上下引物 产物大小 引物序列（5-3）27F/1492R 27F 上引物 1500bp AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R 下引物 TACGGTTACCTTGTTACGATT Psa F1/Psa R2 Psa F1 上引物 280bp TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT Psa R2 下引物 CACGCACCCTTCAATCAGGATG E.3.2 PCR反应体系及扩增条件 PCR反应体系为25L体系：细菌DNA模板1.2l、10mol/l正反引物各0.7l、2mmol/l dNTPs 0.5l、10 PCR Buffer 1.5l、25mmol/l MgCl2 1.5l、Taq DNA聚合酶0.2l、灭菌水18.7l。PCR扩增条件：95预变性3min；95变性30s，55退火30s，72延伸1min，30个循环；72 5min，16保持。DB32/T 38062020 12 E.4 凝胶电泳 取出PCR样品，吸取8l PCR产物加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中，同时用2000bp DNA Marker作为片段大小的标准，置于1 TBE电泳缓冲液中进行电泳20min30min。E.5 成像观察与记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下，根据DNA Marker片段判断扩增出的目的条带的大小，记录观察结果，并将电子文件存档备查。E.6 结果判定 在阴性对照无扩增条带，阳性对照在280bp和1500bp处出现特异性条带的前提下，待测样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品判定为阳性，即携带有猕猴桃细菌性溃疡病菌；待测样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品判定为阴性，即未携带有猕猴桃细菌性溃疡病菌。