DB34_T 3737-2020大豆品种耐旱性与耐热性评价体系技术规程(高清正版）.pdf

ICS 65.CCS B 1安Te2020-1020 15 徽大豆echnical P11-27 发布徽豆品种Procedure o布 安省种耐旱技of EvaluatSoy安徽省市场地 旱性与技术规tion Systeybean Ger 场监督管理方与耐热规程 em of Drourmplasms 理局 发方DB性评价ught and H发 布3标B34/T 373价体系Heat Toler2020-34 准372020 系 rance of-12-27 实准 0 实施DB34/T 37372020 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业标准化专业委员会归口。本文件起草单位：安徽农业大学、中国农业科学院作物科学研究所、合肥市农业经济技术监督管理总站、淮北双收种业有限责任公司、安徽永民种业有限责任公司。本文件主要起草人：李佳佳、王晓波、邱丽娟、李英慧、刘章雄、张俊、张文明、汪明华、赵敬会、邵文韬、程安东、黄岩、赵德军。DB34/T 37372020 1 大豆品种耐旱性与耐热性评价体系技术规程 1 范围 本文件规定了大豆品种耐旱性与耐热性评价体系构建过程中的干旱胁迫和热胁迫处理条件、处理时间、主要指标选择、响应干旱和热胁迫的综合值公式及其定义以及耐旱性与耐热性分级标准等技术内容。本文件适用于大豆品种耐旱性与耐热性的鉴定和评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 1352 大豆 GB 4404.2 粮食作物种子 第2部分：豆类 GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 干旱胁迫 土壤中可利用水的缺乏，使植物根系呼吸困难，引起植物的生理、形态、生化和分子性状的变化，称为干旱胁迫。3.2 热胁迫 高于植物最适生长温度上限的温度环境对植物造成的危害，称为热胁迫。4 耐旱性和耐热性鉴定方法 4.1 种子质量 种子质量按 GB 4404.2 的规定执行。4.2 幼苗培育 以田间条件下的自然正常供水和温度为对照，以大棚盆栽试验作处理，盆钵高 25 cm、直径 29 cm，每盆装土和沙 8 kg9 kg。播前用 1次氯酸钠浸泡大豆种子 1 min2 min，纯水冲洗 35 次，于穴盘中萌发 3 d，挑选长势基本一致的健壮幼苗移栽，每盆保留 3 株大豆植株。4.3 处理方法 DB34/T 37372020 2 4.3.1 干旱处理 处理前按正常田间管理，于大豆始花期（R1 期）开始处理至成熟期（R8 期）间不浇水，干旱胁迫后的土壤含水量范围为 15.020.0，以形成有效的干旱胁迫效应，对照土壤含水量控制在 75.085.0。4.3.2 热处理 处理前按正常田间管理，于大豆始花期（R1 期）每天上午 10:00 至下午 16:00 连续 7 天塑料大棚覆膜进行热（高温）处理，通过温湿度记录仪（RC-4HC,Elitech）实时监测棚内温度，高温设定范围为 40.045.0（通过升降塑料薄膜的覆盖高度调控处理温度），棚内湿度控制在 50.075.0范围内，使其能够形成有效的热胁迫处理效应。5 耐旱性和耐热性指标检测 5.1 渗透调节物质 5.1.1 相对电导率（RC）采集胁迫处理与对照植株上部第 3、4 复叶为实验材料，利用浸泡法检测其相对电导率（参见附录A）。5.1.2 相对含水量（RWC）采集胁迫处理与对照植株上部第 3、4 复叶为实验材料，测其叶片相对含水量（参见附录B）。5.2 保护酶活性 5.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 利用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法检测分析（参见附录C）。5.2.2 过氧化物酶（POD）活性 利用邻甲氧基苯酚（愈创木酚）显色法检测分析（参见附录D）。5.2.3 过氧化氢酶（CAT）活性 利用紫外吸收法检测分析（参见附录E）。5.3 产量性状 大豆收获期间，每种材料（处理和对照）考察 10 个单株的株高（cm）、单株荚数（个）、单株粒数（粒）、单株粒重（g）、百粒重（g）、籽粒饱满度（饱满/皱缩）等产量组分及性状。该类性状部分指标检测按 GB 1352 的规定执行。5.4 花粉萌发率 利用挂线标记大豆幼小花芽，于热胁迫处理后的第二天早上采集处理与对照植株上的标记花芽（已露白/紫但尚未开放），检测分析其花粉萌发率。5.5 花粉活力 花芽6 田间6.1 在发生。6.2 防7 耐旱7.1 耐7.1.1 时运用隶进行聚类7.1.2 其中 U式中D U(X mX mi Wi Pi 7.1.3 7.2 耐7.2.1 主成分分芽标记方法同上管理 进行大豆品种 止病虫草害使性和耐热性评旱性评价体系以相关渗透调隶属函数值对类分析（SPSS大豆响应干旱中：（xi）=(xi-x中：大豆响应(xi)通 max 每个 min 每个 样本数量 每个主 主成分基于 D 综合DD 0.50 0.35 0.20 D 0.20（热性评价体系以花粉活力作分析（SPSS 上，利用 I2-KI种耐旱性与耐使用农药等药评价体系分级系标准 调节物质、保对各主成分得S 19.0）。旱胁迫综合值D?x min)/(x ma 应干旱胁迫综通过隶属函数个主成分中的个主成分中的量；主成分中的权分分析中每个合值和聚类分值 0.65 D 0.65 D 0.50 D 0.35 或植株枯死）系标准 作为主要指标 19.0），同时I 染色法检测耐热性鉴定期药品按 GB/T级标准 保护酶活性和得分值进行标 值（D）按公?U?Xi?ax-x min)综合值；数方法分析在的最大值；的最小值；权重系数；个主成分的特分析图的平均表1 大豆 标，结合相关时运用隶属函测热胁迫处理期间，要及时T 8321（所有和产量组分等标准化，获得公式（1）计算?Wi?（i 在主成分分析 特征值。均隶属值结果豆抗旱性评价聚类分V IV IIIII I 关渗透调节物函数值对各主理与对照植株时防治病、虫有部分）的规等生理指标，一个大豆响应算：?1,2,3,中的标准数据，将大豆抗旱价体系分级标准分析结果 级 级 级 级 级 物质、保护酶主成分得分值株的花粉活力虫、草和鸟害规定执行。进行主成分应干旱胁迫综,n）据；旱评价体系划准 酶活性和产量值进行标准化DB34/T 力，统计并分害，防止倒伏 分分析（SPSS综合值（D）划分为五个等抗旱性等级耐旱型 较耐旱型 中间型 较敏感型 敏感型 量组分等生理化，从而获得373720203 析。伏等不利情况S 19.0），同，根据 D 值(1)等级，见表 1。级 理指标，进行得一个大豆响0 况同值 行响DB34/T 3734 应干旱和热7.2.2 大豆 其中：U（xi）式中：H U(xi)X max X min i Wi Pi 7.2.3 基于2。372020 热胁迫综合值豆响应热胁迫 ）=(xi-x mi 大豆响应热)通过 每个主 每个主 样本数量；每个主成 主成分分于 H 综合值H值 H 0.50.40 H0.30 H0.20 HH0.20值（H），根据迫综合值（HH?n)/(x max-x 热胁迫综合值过隶属函数方法主成分中的最主成分中的最 分中的权重系分析中每个主成值和聚类分析表 50 0.50 0.40 0.30 0 据 H 值进行聚）按公式（2?U?Xi?min)值；法分析在主成最大值；最小值；系数；成分的特征值图的平均隶属表2 大豆耐热聚类分析（SP2）计算：Wi?（i?1成分分析中的值。属值结果，将热性评价体系聚类分析结V 级 IV 级 III 级II 级 I 级 PSS 19.0）。1,2,3,的标准数据；将大豆耐热性系分级标准结果 n）性评价体系划抗划分为五个等抗旱性等级 耐热型 较耐热型 中间型 较敏感型 敏感型 (2)等级，见表DB34/T 37372020 5 附录A （资料性）相对电导率检测分析 将处理组和对照组叶片用去离子水冲洗 2 次，再用洁净滤纸吸净表面水分。用 6 mm 8 mm 打孔器避开主脉打取叶圆片（或切割成大小一致的叶块），每组叶片打取叶圆片 30 片，分装在 3 支洁净的刻度试管中，每管放 10 片。在有叶片的各管中加入 10 mL 的去离子水，并将大于试管口径的塑料纱网放入试管距离液面 1 cm 处，以防止叶圆片在抽气时翻出试管。然后将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气 10 min（也可直接将叶圆片放入注射器内，吸取而的去离子水，堵住注射器口进行抽气）以抽出细胞间隙的空气，当级缓放入全气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。将以上试管置室温下保持 1 h，其间要多次摇动试管，或者将试管放在振荡器中振荡 1 h。1 h 后将各试管充分摇匀，用电导仪（DDSJ-308A）测其初电导值（S1），测定完毕，将各试管封口，置沸水浴中 10 min，以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡 10 min，摇匀，用电导仪测其终电导值（S2）。按公式（A.1）计算相对电导率：RC（%）?100%(A.1)式中：RC 相对电导率（）；S1 初电导值；S2 终电导值。DB34/T 37372020 6 附录B （资料性）相对含水量检测分析 首先对胁迫处理后与对照样本叶片称鲜重（叶片鲜重 FW），之后将其放入盛水的培养皿中（水量占培养皿 2/3），浸泡 24 h 后用吸水纸将其叶面水擦干，称其饱和鲜重（SFW），FW 与 SFW 均在室温下测定，温度 25，湿度 6070，之后将所有样品放入烘箱，105杀青 30 min，再置于 80烘干 24 h（烘干至恒重），冷却至室温后称其干重（DW）。按公式（B.1）计算相对含水量：RWC（%）?（FW?DW）?（SFW?DW）?100%(B.1)式中：RWC 相对含水量（）；FW 叶片鲜重（g）；SFW 饱和鲜重（g）；DW 干重（g）。DB34/T 37372020 7 附录C （资料性）超氧化物歧化酶（SOD）活性 按每克（叶片鲜重 FW）大豆新鲜叶片加入 3 mL 0.05 mol/L pH 7.8 磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容至 5 mL 刻度离心管中，于 8500 r/min（10000 g）冷冻离心 30 min，上清液即为 SOD 酶粗提液。每个处理取 8 个洗净干燥好的微烧杯编号，按计算好的量加入各试剂及酶液，反应系统总体积为 3 mL。其中 4-8 号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取 1 号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余 7 个微烧杯均放在温度为 25。光强为 4500 Lux 的光照箱内（安装有 3 根 20 W 的日光灯管）照光 15 min。然后立即遮光终止反应。在 560 nm 波长下以 1 号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以 2、3 号杯液光密度的平均值作为抑制 NBT 光还原率 100，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制 NBT 光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制 NBT 光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。按公式（C.1）计算超氧化物歧化酶活性：A?U/（g（FW）/h）?（V?1000?60）?（B?W?t）(C.1)式中：A 酶活力（酶活力单位：U/（g（FW）/h）；V 酶提取液总体积（mL）；B 一个酶活力单位的酶液量（uL）；W 样品鲜重（g）；t 反应时间（min）；1000 换算系数，即 1 ml=1000 uL；60 换算系数，即 1 h=60 min。DB34/T 37372020 8 附录D （资料性）过氧化物酶（POD）活性 取处理组与对照组大豆植株叶片 1 g（叶片鲜重 FW），剪碎置于研钵中，加 5 mL 0.1 ml/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5），研磨成匀浆，以 4000 r/min 离心 5 min，倒出上清液，必要时残渣再用 5 mL 缓冲液提取一次，合并两次上清液备用。取光径 1 cm 比色杯 2 个，向其中之一加入上述酶液 1 mL（如酶活性过高可稀释），再加入反应混合液 3 mL，立即开启秒表记录时间：而向另一比色杯中加人 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）作为零对照。用分光光度计在 470 nm 波长下测定反应 5 min 时的光密度值。按公式（D.1）计算过氧化物酶活性：P=U/（gmin）=（A470nmVT）（0.01V1tFW）(D.1)式中：P=过氧化物酶（POD）活性（U/（gmin）；A470nm 反应时间内吸光度的变化；VT 粗酶提取液总体积（mL）；V1 测定用粗酶液体积（mL）；FW 样品鲜重（g）；0.01 A470nm 每下降 0.01 为 1 个酶活单位（U）；t 反应时间（min）。采集浆，转移4000 r/m为样品测磷酸缓冲立即计时待 3 支按公 其中A2式中C=As0 As1、VT V1 FW 0.1t 集处理组与对移至 25 mL 容min，离心 1测定管（S1，S冲液 1.5 mL 时，并迅速倒管全部测定完公式（E.1）计中：240nm=As0中：过氧化氢酶 加入煮、As2 样 粗酶提 测定用 样品鲜 A240nm 加过氧化对照组植株叶容量瓶中，用15 min，上清S2），1 支为 和蒸馏水 1倒入石英比色完，计算酶活计算过氧化氢C U/（g（As1+As2）酶（CAT）活性煮死酶液的对样品管吸光度提取液总体积用粗酶液体积鲜重（g）；每下降 0.1 化氢到最后一过氧叶片 2.5 g（用该缓冲液冲清液即为过氧为空白管（S0）.0 mL，25色杯中，240 活性。氢酶活性：gmin）=（2 性（U/（gm对照管吸光度度；（mL）；（mL）；为 1 个酶活一次的读数时附录E（资料性）氧化氢酶（CA（叶片鲜重 F冲洗研钵，并氧化氢酶的粗）（将酶液煮预热后，逐管 nm 下测定吸（A240nmVmin）；度；活单位（U）时间（min）E ）AT）活性 FW）加入 pH 并将冲洗液转粗酶液。分别煮死），按顺管加入 0.3 吸光度，每隔VT）（0.1；。7.8 的磷酸转入容量瓶中取 3 支 10 序分别加入 ml 0.1 mol/L隔 1 min 读数V1tFW）DB34/T 酸缓冲液少量中，用同一缓 mL 试管中，0.2 mL 粗酶L 的 H2O2，每数 1 次，共 373720209 量，研磨成匀缓冲液定容，其中 2 支酶液、pH 7.8每加完 1 管共测 4 min，(E.1)0 匀支8 管