流感嗜血杆菌多位点序列分型及同源性分析.pdf

传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 248流感嗜血杆菌多位点序列分型及同源性分析张 静，王姣贤，董 蓉，丁赔赔，李艳君 摘要 目的 了解流感嗜血杆菌耐药率变化及多位点序列分型，进行同源性分析，减少医院感染和多重耐药菌株的发生。方法 收集解放军总医院第六医学中心 20152022 年临床分离的 108 株流感嗜血杆菌，使用 K-B 法进行药物敏感性试验；采用多位点序列分析进行序列分型（sequence typing,ST）；采用 MEGA 7.0 软件的 Neighbor-Joining 法和Phyloviz 8.0 软件的 goeBURST 算法构建系统发育树和最小生成树分析菌株同源性。结果 近几年流感嗜血杆菌对氨苄西林、复方新诺明耐药率 60%；108 株菌中，5 株未能与数据库匹配，103 株菌有 20 种 ST 型别，主要为 ST-487（58 株，占 53.70%）和 ST-147（19 株，占 17.59%）；系统发育树分为 2 组，除 ST-834 和 ST-1242 2 种型别分布在组外，其余型别在组；最小发育树提示 2 大分支 ST-487 和 ST-147 都与 ST-103 有相关性。结论 院内分离的流感嗜血杆菌多数菌株存在亲缘进化关系；多重耐药的流感嗜血杆菌在我院不同科室相继检出，提示编码耐药基因的质粒在病区间传播。关键词 流感嗜血杆菌；多位点序列分析；同源性；耐药率；氨苄西林；医院感染；系统发育树；最小生成树 中国图书资料分类号 R378.4 文献标志码 A 文章编号 1007-8134(2023)03-0248-05DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2023.03.011Multilocus sequence typing and homology analysis of Haemophilus influenzaeZHANG Jing,WANG Jiaoxian,DONG Rong,DING Peipei,LI Yanjun*Clinical Laboratory,Beijing Mentougou District Hospital,102399,China;Clinical Laboratory,the Sixth Medical Center of PLA General Hospital,Beijing 100048,China*Corresponding author,E-mail:AbstractObjectiveTo investigate the variation in drug resistance rate and multilocus sequence typing of Haemophilus influenzae and analyze homology to reduce hospital-acquired infections and multidrug-resistant strains.Method One hundred and eight strains of H.influenzae clinically isolated from the Sixth Medical Center of Chinese PLA General Hospital between 2015 and 2022.Drug sensitivity tests were conducted using the K-B method,and multilocus sequence analysis was used to sequence typing.We utilized the Neighbor Joining algorithm of MEGA 7.0 software and the goeBURST algorithm of Phyloviz 8.0 software to construct phylogenetic trees and a minimum spanning tree to analyze strain homology.Results In recent years,the resistance rate of H.influenzae to ampicillin and compound sulfamethoxazole has exceeded 60%.Among the 108 strains of bacteria,5 were not matched with the database,and 103 strains showed 20 ST types,mainly ST-487(58 strains,53.70%)and ST-147(19 strains,17.59%).The phylogenetic tree analysis was divided into 2 groups,with ST-834 and ST-1242 types distributed in Group II,and the remaining types in Group I.The minimum developmental tree analysis indicated that both branches ST-487 and ST-147 are correlated with ST-103.Conclusions Most strains of H.influenzae isolated in hospital show phylogenetic relationships.Multidrug-resistant H.influenzae have been detected in different departments,suggesting that the drug resistance genes are being transmission between affected areas.Keywordshaemophilus influenzae;multilocus sequence analysis;homology;drug resistance rate;ampicillin;hospital infections;the phylogenetic tree;the minimum spanning tree 基金项目 国家重点研发计划课题级（2022YFB3204404）作者单位 102399，北京市门头沟区医院检验科（张静）；100048 北京，解放军总医院第六医学中心检验科（张静、王姣贤、董蓉、丁赔赔、李艳君）通信作者 李艳君，E-mail: 流感嗜血杆菌属于嗜血杆菌属，是一类无动力的革兰阴性杆菌1。感染人体不同部位时可出现不同的症状，轻则咳嗽、发热、气促，重则引起肺炎、化脓性脑膜炎等各类疾病2-3。近年来，我院流感嗜血杆菌检出率逐渐上升，菌株对抗菌药物耐药率不断上升。本研究收集临床分离的流感嗜血杆菌，采用多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）方法，确定菌株的序列分型（sequence typing,ST），进一步分析各型别间遗传进化关系，降低耐药菌株检出并减少医院感染的发生。1 材料和方法1.1 菌株来源 收集解放军总医院第六医学中心2015 年 1 月2022 年 2 月临床分离的所有流感嗜血杆菌样本，剔除同一患者同一年份相同标本类型的菌株，20152022 年菌株数量依次为 6 株、7 株、4 株、2 株、16 株、20 株、30 株和 23 株，共 108 株。其中 77 株来自男性，31 株来自女性。菌株-80 保存。1.2 仪器与试剂 使用安图生物的巧克力平板进行菌株分离；使用赛默飞的药物敏感性（药敏）纸片进行药敏试验；使用德国 Bruker Daltonik GmbH 的全自动快速生物质谱检测系统进行菌种鉴定；使用天漠生物的细菌 DNA 提取试剂盒提取菌株 DNA；使 用 NEB 的 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 和ABI 的 Proflex 进行 PCR 检测；使用北京索莱宝科技有限公司提供的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行产物分纯；使用 Bio-Rad 的 Chem Doc 进行化学成像。1.3 方法1.3.1 流感嗜血杆菌的复苏与鉴定 将冻存的流感嗜血杆菌复苏，接种于巧克力琼脂平板。在37，传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 249含有 5%的 CO2的环境中孵育 18 24 h。从培养基中挑取无色、透明、湿润的单个菌落进行质谱鉴定。1.3.2-内酰胺酶检测 使用头孢硝基噻吩纸片，刮取平板上少量形态典型的菌株，若 5 min 内纸片变成红色则为阳性，不变红则为阴性。1.3.3 药敏试验 流感嗜血杆菌采用 K-B 纸片法做常用抗菌药物的药敏试验，试验结果依据 2022年 CLSI 判断标准执行；质控菌株为标准菌株ATCC49247。我院常用的药敏试验药物为：氨苄西林、复方新诺明、克拉霉素、环丙沙星、阿莫西林/棒酸、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、四环素和氯霉素。1.4 流感嗜血杆菌的 MLST 分型1.4.1 DNA 提取 利用细菌 DNA 提取试剂盒提取流感嗜血杆菌的基因组 DNA。1.4.2 引物设计 依据参考文献 4 设计针对流感嗜血杆菌的 7 对引物，分别为 adk、atpG、frdB、fucK、mdh、pgi、recA，引物序列见表 1。表 1 流感嗜血杆菌基因引物Table 1 Details of loci used in MLST scheme引物引物序列(5-3)扩增片段大小(bp)adkup-GGTGCACCGGGTGCAGGTAA477dn-CCTAAGATTTTATCTAACTCatpGup-ATGGCAGGTGCAAAAGAGAT447dn-TTGTACAACAGGCTTTTGCGfrdBup-CTTATCGTTG GTCTTGCCGT489dn-TTGGCACTTTCCACTTTTCCfucKup-ACCACTTTCGGCGTGGATGG345dn-AAGATTTCC CAGGTGCCAGAmdhup-TCATTGTATGATATTGCCCC405dn-ACTTCTGTACCTGCATTTTGpgiup-GGTGAAAAAAT CAATCGTAC468dn-ATTGAAAGACCAATAGCTGArecAup-ATGGCAACTCAAGAAGAAAA426dn-TTACCA AACATCACGCCTAT 注：up.上游引物；dn.下游引物 1.4.3 PCR 扩增 反应体系为 Q5 高保真酶 0.5 l、Q5 Buffer（5 倍稀释）10 l、dNTP（10 mM）2 l、上游引物和下游引物各 2 l、基因组 DNA 1 l，去离子水补充至 50 l。循环参数设置为：98 30 s；98 10 s，53 20 s，72 30 s 进行 5 个循环；98 10 s，55 20 s，72 3 min 进行 30 个循环；72 5 min；2 1 min。1.4.4 电泳 将扩增产物进行电泳，若电泳结果存在非特异性条带，须将目的条带切出，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。1.4.5 测序及 ST 分型 将 108 株流感嗜血杆菌的扩增产物测序，结果上传至网站得出每株菌的 7 个等位基因，等位基因再按照 adk、atpG、frdB、Fuck、mdh、pgi 和 recA 的顺序获得 ST 型别（https:/pubmlst.org/hinfluenzae/）。1.5 系 统 发 育 树 和 最 小 生 成 树 绘 制 采 用MEGA 7.0 软件，将 108 株流感嗜血杆菌的 7个管家基因扩增的序列串联比对，使用邻接法 Neighbor-Joining 绘制系统发育树，参数设为 1000；每株菌的等位基因采用 Phyloviz 8.0软件的 goeBURST 算法进行进化分析，下载流感嗜血杆菌 MLST 分型的等位基因谱（https:/pubmlst.org/）并输入患者信息绘制最小生成树。2 结 果2.1-内酰胺酶结果和耐药性分析 108 株流感嗜血杆菌-内酰胺酶检测阳性率为 62.04%（67/108）。20152022 年 108 株菌的药敏试验显示氨苄西林、复方新诺明、克拉霉素、环丙沙星、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、阿莫西林/棒酸、美罗培南、四环素和氯霉素的耐药率依 次 为 66.67%、60.19%、53.70%、42.59%、41.67%、34.26%、31.48%、25.93%、9.26%、8.33%和 5.56%，结果见表 2，其中氨苄西林、复方新诺明、克拉霉素和环丙沙星耐药率逐年上升。表 2 108 株流感嗜血杆菌药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of 108 strains of H.influenzae2.3 MLST 分型及科室分布 108 株流感嗜血杆菌，5 株未能与网站数据匹配，待移交数据库考虑新的 ST 型别。剩余菌株 ST 型别 20 种，其中 ST-487 型 58 株（占 53.70%）、ST-147 型 19 株（占药物敏感(S)中介(I)耐药(R)株数率(%)株数率(%)株数率(%)氨苄西林3027.7865.567266.66复方新诺明4339.8100.006560.19克拉霉素4945.3710.935853.70环丙沙星6156.4810.934642.59头孢他啶6358.3300.004541.67氨曲南7064.8110.933734.26亚胺培南7468.5200.003431.48阿莫西林/棒酸8074.0700.002825.93美罗培南9890.7400.00109.26四环素6963.893027.7898.33氯霉素9587.9676.4865.56 传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 25017.59%），ST-139、ST-155、ST-321和ST-422各3株，均占 2.78%，其余型别各 1 株，均占 0.93%，各型别科室分布及对应株数详见表 3。主要型别 ST-487和 ST-147 在高压氧科检出最多，分别占此型别的70.69%（41/58）和 94.74%（18/19）。科室株数ST 型别及对应株数高压氧科63ST-487(41)、ST-147(18)、ST-139(2)、ST-408(1)、ST-103(1)神经外科14ST-487(11)、ST-422(1)、ST-139(1)、ST-142(1)呼吸科5ST-487(1)、ST-321(1)、ST-155(1)、ST-84(1)、ST-11(1)胸外科4ST-487(2)、ST-422(1)、ST-245(1)特勤科3ST-487(2)、ST-147(1)神经内科3ST-155(1)、ST-1242(1)、ST-159(1)老年医学3ST-321(2)、ST-1533(1)放疗科3ST-203(1)、ST-834(1)、ST-1324(1)空潜科1ST-422(1)肾脏科1ST-487(1)儿科1ST-155(1)保健科1ST-1529(1)内分泌科1ST-107(1)2.4 最小生成树和系统发育树 108 株流感嗜血杆菌 ST 型别采用 Phyloviz 8.0 软件构建的最小生成树（图 1）显示菌株型别分布较广泛，主干上有较多分支，其中 ST-487 和 ST-147 为 2 个主要分支，2 分支都与 ST-103 有相关性，图中圆圈和数字代表不同 ST 型别，圆圈内不同颜色代表不同样本，连线代表 2 个相邻 ST 型别间等位基因的差异数。序列串联拼接应用 MEGA7.0 软件绘制的系统发育树（图 2）显示，菌株有 2 大分支，图中标为组和组。组 106 株，组 2 株。组有 3 个分支，各型别间存在亲缘进化关系，其中 2 支分别以 ST-487 和 ST-147 为主要型别，另 1 分支为未分型的2 株菌。组包含 ST-834 和 ST-1242 2 种型别，均检出于 2015 年。图 1 108 株流感嗜血杆菌最小生成树Figure 1 The minimum spanning tree of 108 strains of H.influenzae表 3 103 株菌 ST 分型株数和科室分布Table 3 The numbers of ST typing and department distribution of 103 strains图 2 108 株流感嗜血杆菌系统发育树Figure 2 The phylogenetic tree of 108 strains of H.influenzae 传染病信息 2023 年 6 月 30 日 第 36 卷 第 3 期 Infect Dis Info,Vol.36,No.3,June 30,2023 2513 讨 论 MLST 是一种通过扩增多个引物序列，确定等位基因编号，从而分析菌株分型的方法。目前主要应用于细菌流行病学、致病性及遗传进化研究。MLST 更有利于分析菌株的多样性，通过各个亚型之间的联系判断系统发育关系及疾病之间的相互联系。近年来，MLST 广泛应用于细菌的分子流行病学研究，通过已建立的数据库，实现菌株变迁分析和国际间数据比对。本研究显示，男性患者感染率高于女性患者，表明男性呼吸道更易感染流感嗜血杆菌，这与潘芬等6报道一致。近几年流感嗜血杆菌对氨苄西林、复方新诺明耐药率 60%。氨苄西林最早用于治疗流感嗜血杆菌且效果较好，但近年来随着临床的大量使用，菌株耐药性逐渐升高7-10。此外，流感嗜血杆菌产生耐药最常见机制是-内酰胺酶的产生，自 2020 年下半年开始-内酰胺酶检出率增加，是导致菌株对抗菌药物敏感性下降最主要的原因11-12。检验科应提醒临床医生提高感染患者标本的送检率，依据药敏试验结果合理规范使用抗菌药物，降低耐药菌株的产生13。测序结果显示，108 株流感嗜血杆菌，5 株未能与数据库匹配，其余菌株有 20 种 ST 型别。型别具有遗传多样性，主要为 ST-487 和 ST-147，与国内董叶青等14和国外 Carrera-Salinas 等15、Shuel 等16报道的主要检出型别区别较大。分析菌株信息，有 63 株流感嗜血杆菌检出于高压氧科，型别为 ST-103（1 株）、ST-139（2 株）、ST-147（18 株）、ST-487（41 株）和 ST-408（1 株）。各型别检出时间依次为2016年、2016年、2019年、2020 年和 2021 年，首次出现均在该科室且都分布在组，亲缘关系较近。ST-487 和 ST-147 为最小发育树的 2 个较大亚支，且都与主干上 ST-103 存在亲缘关系，重点考虑菌株变异造成型别转化。分析 2018 年我院高压氧科未检出流感嗜血杆菌的原因，一方面该年度全院共检出2株流感嗜血杆菌，考虑该科室本身未有患者感染；另一方面该年度高压氧科微生物标本送检率与前 2 年持平，排除样本未送检的因素，可能与患者感染症状较轻未采集样本有关。结合耐药数据及ST分型发现，型别出现越早，菌株对药物的敏感性越高。2019 年首次发现多重耐药的流感嗜血杆菌，之后逐渐增加。本研究共检出 59 株多重耐药菌，包括 ST-1324、ST-155、ST-245 各 1 株，ST-487 56 株。多重耐药菌对氨苄西林、复方新诺明、克拉霉素、环丙沙星和头孢他啶的耐药率均 60%，与所有菌株的耐药率趋势一致。除此之外，其它型别对药物的敏感性较高。从不同型别菌株出现顺序及耐药率增加和后续流行推测：高压氧科流感嗜血杆菌流行主要来自对药物敏感性较高的 ST-103 型别，随着时间进展加上抗菌药物使用的选择作用，流行株由 ST-147 转变为 ST-487，2022 年检出型别均为 ST-487 且全部为多重耐药菌株，考虑该病区已出现耐药株病区内的传播。其次，除2015年的ST-834和ST-1242外，剩余 18 种型别具有异种同源性，提示同源菌株在不同科室引起传播。此外，研究还发现继高压氧科出现 ST-487 型别后，肾脏科、呼吸科、胸外科、特勤科和神经外科分别在 2020 年 11 月、2020 年12 月、2021 年 1 月、2021 年 2 月和 2021 年 12 月相继出现该型别菌株，分析患者信息发现高压氧科感染流感嗜血杆菌的患者曾在其它科室住院，提示不同病区间可能存在编码耐药基因质粒的传播，存在医院感染的风险。目前医院感染和滥用抗菌药物已成为各大医疗机构面临的主要公共卫生问题，医院感染的发生不仅增加疾病的发生率和病死率，而且增加患者的经济负担。医院感染的预防和控制是保证医疗质量的重要内容17-18。本研究中流感嗜血杆菌对多种抗菌药物的耐药率居于高位，一方面考虑患者主要来自高压氧科，患者长期卧床且病情较重，住院时间长，用药时间久容易产生耐药，另一方面考虑耐药质粒在病房间造成传播。菌株同源性分析显示，多重耐药的流感嗜血杆菌已在病区间传播，医院应立即采取感染控制措施，避免造成更大规模的流行。本研究为后续耐药基因检测提供基础数据，提醒临床合理规范使用抗菌药物，加强重点科室管理降低医院感染的发生，有效避免多重耐药菌株的产生和传播。【参考文献】1 王姜琳，孙杰，杨慧健，等.儿童耐氨苄西林流感嗜血杆菌耐药机制及同源性研究J.检验医学，2020，35(6):513-518.DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2020.06.001.2 李金梅，王长印，李萍，等.流感嗜血杆菌耐药性及分子流行病学调查J.新医学，2019，50(9):676-680.DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2019.09.007.3 Hoshino T,Takeuchi N,Ohkusu M,et al.Identification of Haemophilus influenzae serotype e strains missing the fucK gene in clinical isolates from JapanJ.J Med Microbiol,2019,68(10):1534-1539.DOI:10.1099/jmm.0.001055.4 Emma M,Feil EJ,Stringer S,et al.Characterization of 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