基于RNA-Seq分析茶树新品系‘春绿’生物信息.pdf

DOI：10.20045/ki.issn.2096-0220.2023.02.004引文格式：林郑和，孔祥瑞，陈常颂，等.基于 RNA-Seq 分析茶树新品系春绿生物信息J.茶叶学报，2023，64（2）：2936.基于 RNA-Seq 分析茶树新品系春绿生物信息林郑和1，孔祥瑞1，陈常颂1,2*，李鑫磊1，张亚真1，游小妹1，陈志辉1，单睿阳1，钟秋生1（1.福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心，福建福州350013；2.国家土壤质量福安观测实验站，福建福安355015）摘要：【目的】为加深对茶树新品系春绿分子机制及优异性状的遗传基础的了解。【方法】以茶树品种（系）福云 6 号和春绿叶片为材料，利用第二代测序技术，构建基因转录本。【结果】获得新品系春绿的 Cleanreads 达到 47.37M，比对照福云 6 号少 0.76M；共拼装成 41159 条 unigenes，其中 31706 条 unigenes 能被 GO数据库成功注释，分别涉及到 3651 个 GO 组。差异显著基因有 7042 条，分别为 23 个生物学过程的 GO 组、20 个细胞成分的 GO 组及 21 个基于分子功能的 GO 组。KEGG 富集分析发现，有 8657 个基因注释到 191 个代谢通路中，这些基因中有 1277 个显著差异基因。66 条 DEGs 参与苯丙素的生物合成（ko00940），3 条 DEGs 参与谷胱甘肽代谢（ko00480），40 条 DEGs 参与卵母细胞减数分裂（ko04114），45 条 DEGs 参与 RNA 降解（ko03018），14 条 DEGs 参与角质、亚伯碱和蜡的生物合成（ko00073）。【结论】转录组测序分析结果阐明了春绿新品系生长发育的部分分子信息，对利用其进一步开展分子辅助育种等具有较为重要的意义。关键词：茶树；新品系；转录组；生物信息学中图分类号：S571.1文献标志码：A文章编号：20960220（2023）02002908RNA-Seq Analysis on A New Tea Strain,ChunlvLINZheng-he1,KongXiang-rui1,CHENChang-song1,2*,LIXin-lei1,ZHANGYa-zhen1,YOUXiao-mei1,CHENZhi-hui1,SHANRui-yang1,ZHONGQiu-sheng1(1.Tea Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Branch of National Center for TeaImprovement,Fuzhou,Fujian 350013,China;2.National Agriculcural Experimental Station forSoil Quality,Fuan,Fujian 355015,China)Abstract：【Objective】GenesassociatedwiththemolecularmechanismsandbiologicalcharacteristicsofthenewteastrainChunlvwereanalyzed.【Method】Thesecondgenerationsequencingtechnologywasappliedtodeterminethefull-lengthtranscriptomesofCamellia sinensisChunlvaswellasFuyunNo.6forcomparison.【Result】Leavesfromtheteabusheswerecollectedforthetranscriptconstruction.Therewere47.37McleanreadsfoundinChunlv,0.76MlessthanthatinthecontrolFuyunNo.6.Ofthe41159UniGenessynthesizedonthegenesofChunlv,31706couldbeannotated by the GO database involving 3651 groups.Showing 7042 significantly distinct GO genes,the groupsincludedtheonesof23biologicalprocesses,20cellularcomponents,and21molecularfunction-basedgenes.TheKEGG收稿日期：20230206 初稿；20230323 修改稿基金项目：福建省属公益类科研院所基本科研专项（2020R1029002、2021R1029006）；福建省自然科学基金（2020J011365）；国家茶叶产业技术体系（CARS-19）；“5511”协同创新工程（XTCXGC2021004）；福建省引导性项目（2022N0055）。作者简介：林郑和（1975），男，博士，研究员，研究方向：茶树遗传育种。E-mail:*通信作者：陈常颂（1973），男，研究员，研究方向：茶树资源鉴定与新品种选育。E-mail:茶叶学报2023，64（2）：2936Acta Tea Sinicaanalysisannotated8657genesinto191metabolicpathwayswith1277significantlydifferedfromoneanother.OntheDEGs,66wereinvolvedinthephenylpropylbiosynthesis(ko00940),3inglutathionemetabolism(ko00480),40inoocyte meiosis(ko04114),45 in RNA degradation(ko03018),and 14 in Cutin,suberine,and wax biosynthesis.【Conclusion】ThetranscriptomesequencingelucidatedsomegeneticinformationontheChunlvteacultivarwhichwouldfacilitatefuturestudiesinvolvingandbreedingprogramsutilizingthemolecularmarkers.Key words：Teaplant;newstrain;transcriptome;bioinformatics0引言【研究意义】伴随着高通量测序新技术（RNA-Seq）的广泛应用，越来越多的研究者利用转录组学研究茶树生长发育、抗性、物质代谢的分子调控机制，探索茶树基因表达的转录调控机制，并试图通过基因工程技术培育出优良品种。【前人研究进展】昆明植物研究所的研究团队发布了茶树大叶种云抗 10 号基因组1，开启了茶树基因组学的研究序幕，之后安徽农业大学的茶学团队基于三代 PacBio 测序方法，获得了茶树小叶种舒茶早的基因组序列2；华南农业大学也公布了茶树小叶种碧云的染色体级别基因组序列3；同时中国农业科学院茶叶研究所也公布了龙井 43的染色体级别基因组序列4；之后黄棪与铁观音染色体级别基因组序列的公布5,6，探索茶树基因表达的转录调控机制，并试图通过基因工程技术培育出优良品种，现已成为茶树研究新兴热点之一。李娜娜等7以福鼎大白茶和小雪芽叶片为研究材料，发现小雪芽新梢白化的可能遗传机理存在于蛋白质翻译后的修饰过程，而且这些变异主要发生在细胞内。朱兴正等8采用 PacBio 平台进行云茶 1 号全长转录组测，发现云茶 1 号中216 个代谢途径分支，包括茶叶品质、活性物质代谢以及抗逆等相关基因。然而，茶树庞大的 3Gb大小基因组、超过 70%的重复序列含量以及自交不亲和导致的高度杂合特性7，遗传结构十分复杂，遗传分析很困难。【本研究切入点】春绿茶树新品系由福建省农业科学院茶叶研究所于 20122022 年，以福云 6 号为母本、早春毫为父本杂交选育而成，小乔木型，树姿直立，生长势中等。一芽一叶期 3 月 7 日；一芽二叶期 3 月 10 日；芽叶绿色，芽叶茸毛中等或较多，一芽三叶长 8.2cm，发芽较密，一芽三叶百芽重 88.6g。叶片为长椭圆形，叶面微隆，叶片质地软，叶尖渐尖，叶基楔形，叶缘微波，叶齿锐，叶齿密度中。春茶一芽二叶蒸青样水浸出物含量 49.9%、茶多酚含量22.4%、游离氨基酸总量 3.4%、咖啡碱含量 4.0%。适制绿茶和白茶，在福建、湖北等多地有种植示范，是一个适制性广、高香且特早生优良茶树品系。【拟解决的关键问题】本研究利用转录组测序技术，分析春绿与福云 6 号的转录组测序，通过序列分析、基因功能注释、基因功能分类、差异表达基因筛选等，旨在为进一步挖掘春绿茶树新品系次生代谢相关功能基因和抗逆基因奠定基础，为新品种的选育提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料供试茶树品种福云 6 号与新品系春绿，种植于福建省农业科学院茶叶研究所二号山同一地块，树龄均为 5 年，施肥、喷药等茶园管理均一致。春季统一采摘新梢第一轮一芽二叶，迅速用液氮固样，送上海欧易生物医学科技有限公司测序。1.2表观性状观测及绿茶制作与审评表观性状按陈亮等9的标准观测。采摘 2022年春茶第一批新梢（达到一芽一叶标准），绿茶制作参照传统烘青绿茶加工工艺：鲜叶萎凋杀青揉捻烘干。详细工艺参数为：采用自然萎凋方式（水筛摊凉，1.5 斤/个水筛），萎凋时间约6h；采用滚筒杀青，温度为 280，投叶量为 3斤/锅（2 个水筛的鲜叶），时间约 90s。出锅后摊凉 1015min（待热气散发后），放入 6CR-15 的揉捻机揉捻 1012min，迅速解块，毛火 120约 10min，足火 80 烘箱中烘干至含水率低于 5%。样品感官审评参照 GB/T237762018茶叶感官审评方法，审评项目有外形、香气、汤色、滋味和叶底五项。审评结果采用加权评分法，汤色 10%、外形占 20%、滋味 30%、香气 30%、叶底 10%。再结合记录的评审术语，综合评定品质。30茶叶学报第64卷由 4 名专业审评人员进行密码审评。1.3RNA 的提取与文库构建茶树叶片总 RNA 的提取参考本实验室改良的Tri-2Reagent 法，凝胶电泳检测 RNA 完整性；测定 260nm 和 280nm 波长下的 OD 值，合格后进行混匀。RNA 混匀后使用 DNase 消化 DNA，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA（去除rRNA）；加入打断试剂将 mRNA 打断成短片段，用六碱基随机引物合成一链 cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链 cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行 PCR 扩增；构建好的文库用 Agilent2100Bioanalyzer 质检合格后，使用 IlluminaHiSeqTM2500 测序仪进行测序，产生 125bp 或 150bp 的双端数据。具体参照林郑和等10的方法。1.4Illumina 测序、数据质检和参考基因组比对通过 IlluminaHiSeq测序平台，对文库片段进行双末端（Paired-end，PE）测序，得到原始下机数据 fastq文件。使用 FastQC软件的默认参数对fastq文件进行测序质量统计，使用 Cutadapt软件进行 reads 的过滤和去除低质量序列（overlap10bp，20%的碱基错误率），最终得到高质量的 cleanreads。再通过 Bowtie2和 Tophat2将 cleanreads比对至茶树参考基因组2，得到 SAM/BAM比对结果文件，具体方法参照文献 11。1.5差异表达基因筛选及富集分析分别以各测序样本的总表达量为内标，对 2个测序样本的 RPKM 进行 Fisher-test 差异检验。以 FDR（错误发现率）0.05 及 Fold-Change（表达差异倍数）2 为条件进行差异基因筛选，并进行差异转录组的 GO 和 KEGG 富集分析，以判定差异转录组主要影响的生物学功能或者通路。1.6差异表达基因的实时荧光定量 PCR（qPCR）检测为了验证 RNA-Seq 数据的结果，随机选取14 个 ungene 进行 RT-qPCR 分析。RT-qPCR 引物对采用 primerPremier5.0（PremierBiosoft，PaloAlto，CA，USA）设 计，内 参 基 因 为 GAPDH（CSA024857.1），见表 1。用 RNA 纯化试剂盒（中国天根）纯化总 RNA，按照说明书使用TaKaRa（中国大连）的 PrimeScriptII1stStrandcDNAsynthesiskit 进行第一链 cDNA 的合成。使用 SYBRPremixExTaqII（TliRnaseHPlus）试剂盒（TaKaRa，日本）在 Lightcycler480Real-TimePCR 检测系统（Roche，德国）中进行反应。采用表 1引物序列及特征Table 1Primer pair used for RT-qPCR analysis基因GeneID正向引物序列Forwardprimer(5-3)反向引物序列Reverseprimer(5-3)产物长度Productlength（bp）LOC114318002GTGCCTGGGTCATAAGTTCCTAGCAACACCACCAAATCC92LOC114313427GGCCACAAATCCAACACACTAGATGGTGGTGATTTGGGTTC102LOC114312604ACTCTCTATGACTTTGGGACCACCATAAGCATTGCTAGTGTAA129LOC114277243AAAGTAGGCTGGAGAGTCAGCATTATCAGCCACCTCG103LOC114256700TGGTCGCCTTGCTTCTAATTTGTCATCTTGTGTCACATACG105LOC114312679CCAACCCAATCCAAATCCATAAAAAGAATGTGCTGTTTGTGAAG98LOC114312790GAGATTTGCCGGAAGATTGTAGATTAGCATCAACGCCAT80LOC114315044CTCCTTCTCACCTCCTCGGTTGGTTTGCTTGGATCGG111LOC114302706CTTCATCACCTCCAAGCTATGGCCAGTGTATCAGAAACAG120LOC114312621CTCACACAATCAAAGCCCTGGATAGCCATAGAGTCAACGG91LOC114302721CTGTTGTCCTTGAGAGGTTTGGACCCACACTATGAGCACCTA81LOC114283749AACCGTCTCTTTACCAAAGTCCCTTGATTGAACTGGAAGTGA83LOC114312612CCAAATTGGACACTCACTAGCTGGAAGTGGTAGGCGAGATA93LOC114312518CAATCAACTTTCTGGGTCCATCCTGAATGAGTAGAATGACCTCG120CSA024857TTGGCATCGTTGAGGGTCTCAGTGGGAACACGGAAAGC96第2期林郑和等：基于 RNA-Seq 分析茶树新品系春绿生物信息313L 模板 cDNA、1L 正向引物（5pmol）、1L反向引物（5pmol）和 5LSYBRGreen 混合物（Qiagen，Hilden，Germany）进 行Real-timeqPCR。PCR 过程包括 95 预热 5min，9510s，6020s，45 个循环，然后生成解离曲线（9515s，6060s，9515s）。每个实验设 3 个重复，用 2Ct 法计算各基因的相对表达量。对不同样品进行归一化处理，以 GAPDH 基因（accessionnumber：CSA024857.1）为内标，以福云6 号（CK）的叶片为参比样本，设置其基因表达量为 1。具体的方法参照文献10。1.7数据处理利用软件 SIMCA-P11.5 对所测定的数据进行分析，筛选出差异基因，并对两组样本进行主成分分析（PCA）。2结果与分析2.1表观性状与品质差异分析从表 2 可以发现，春绿叶片呈稍上斜，福云6 号的呈水平或者稍下垂，二者有明显的区别；叶身内折也较福云 6 号大，叶齿锐深与福云 6 号的钝浅有明显区别，嫩梢茸毛较福云 6 号少，萌发期大约晚 3d。从表 3 可看出，新品系春绿香气与滋味得分明显高于福云 6 号。春绿品质明显优于福云 6 号。表 2表观性状分析Table 2Apparent trait analysis品种（系）Variety(strain)叶片形状Leafshape叶身形状Bladeshape叶齿Leaftooth叶缘Leafmargin茸毛Fuzz一芽二叶萌发期Germinationperiodofonebudandtwoleaves福云 6 号 FY6H呈水平或稍下垂状叶身稍内折或平稍钝浅密平或微波特多3 月 7 日春绿CL呈稍上斜状叶身内折度较大锐深中平较多3 月 10 日表 3感官品质审评表Table 3Sensory evaluation form品种（系）Variety(strain)外形（20%）Shape汤色（10%）Souphue香气（30%）Aroma滋味（30%）Taste叶底（10%）Foliagefundus总分（100）评语Comment得分Score评语Comment得分Score评语Comment得分Score评语Comment得分Score评语Comment得分Score福云 6 号FY6H条尚紧细90浅绿、明亮90香气较清纯91较醇、带涩90较软匀8589.8春绿 CL条形稍松90黄绿、明亮92嫩香、清纯94较醇爽、微涩94软、青绿8892.42.2测序原始序列数量及质量测序共得到春绿与福云 6 号品种（系）叶片转录组原始序列，通过计算每千个碱基的转录每百万映射 RPKM（ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads）的读取量来分析 RNA-Seq 数据的转录谱。构建了 12 个 cDNA 文库，包括福云 6 号叶片（FY6H1-6）与春绿（CL1-6）各6 个生物重复，共获得 81.51G 的 Cleandata，各样本的有效数据量分布在 6.597.2G，Q30碱基分布在 89.6%90.86%，从每个库生成的原始读取数从 47385674 到 51271456。Clean reads 和 Q20（测序错误率低于 1%）的百分比分别超过 97%和 95%（表 4），碱基 G 和 C 数占总碱基数的 44%以上，平均 GC 含量为 45.00%。通过将 reads 比对到参考基因组上，得到各个样本的基因组比对情况，比对率为 90.91%91.52%，不能测序的核苷酸 N 为 0，说明转录组测序质量整体较高。2.3样本的 PCA 分析与差异基因分析从图 1-A 可以看出，该组原始试验数据所得在两个主成分 PC1、PC2 中良好地呈现，第一主成分的贡献率为 99.26%，第二主成分的贡献率为0.22%，两种贡献率和为 99.46%。通过样品分布散点图发现，2 个品种的信息可以得到很好的区分，说明拟合性良好，能够直观地反映样本间的差异性。通过对 2 个品种的基因测序，以福云 6 号为对照，在错误发现率（falsediscoveryrate，FDR）32茶叶学报第64卷0.05 且|log2foldchange（FC）|1 的筛选条件下，发现春绿中有 7042 个差异基因（DEGs），其中3273 个表达上调，3769 个表达下调，见图 1-B。2.4GO 功能富集分析春绿与福云 6 号样本的 DEGs 主要分为三类，包括 23 个基于生物过程的 GO 组、20 个基于细胞成分的GO 组和21 个基于分子功能的GO 组（图2）。通过 GO（GeneOntology）富集分析表明，差异显著的生物过程功能基因中（前 10）有 68 条基因显著上调、268 条显著下调；参与细胞功能组成基因中有 67 条显著差异基因上调、1444 条显著差异下调；参与分子功能基因中发现 220 条显著差异基因上调、623 显著差异基因下调。以上发现，参与细胞功能组成差异基因最多。GO 项富集分析显示，20 个 DEGs 在生物碱代谢过程（GO：0009820）富集，26 个 DEGs 在营养活动（GO：0045735）表 4测序数据统计结果Table 4Summary of RNA-Seq data on Fuyun No.6(FY6H)and Chunlv(CL)样品名称Sample原始数据Rawreads待分析数据Cleanreads（%）GC（%）Q20（%）Q30（%）春绿 1（CL1）4851536547457494（97.8）44.9497.2889.66春绿 2（CL2）4940234848280118（97.73）44.8295.3089.78春绿 3（CL3）4763147846543824（97.71）44.9896.0889.81春绿 4（CL4）4758472346541832（97.81）44.9595.6889.98春绿 5（CL5）4805346547081964（97.98）45.0297.1489.60春绿 6（CL6）4944541848297148（97.69）44.9695.5489.70平均值 Average（CL）4843879947367063.33（97.79）44.9596.1789.76福云 6 号 1（FY6H1）4774258746763352（97.95）45.0396.7889.77福云 6 号 2（FY6H2）4738567446320180（97.75）44.9695.8889.99福云 6 号 3（FY6H3）5062547149958424（98.68）44.9696.7989.63福云 6 号 4（FY6H4）5127145650502424（98.50）45.1195.8890.86福云 6 号 5（FY6H5）4920158748401734（98.37）45.1295.8990.47福云 6 号 6（FY6H6）4751268946834148（98.57）45.1196.1990.82平均值 Average（FY6H）4895657748130043.67（98.30）45.0596.2490.26202001 0002 0003 0001001020A1001020PC1:99.26%variancePC2:0.22%variance第一主成分春绿与福云 6 号第二主成分CL 春绿FY6H 福云 6 号CL1CL6FY6H2FY6H4FY6H3FY6H5FY6H6FY6H1CL4CL3CL5CL2差异基因个数DEG numberCL_VS_FU6H3 273Up 上调Down 下调3 769B图 1春绿与福云 6 号 PCA 分析（A）与差异基因分析（B）Fig.1Principal component and differential gene analyses on CL and FY6H第2期林郑和等：基于 RNA-Seq 分析茶树新品系春绿生物信息33中富集，393 个 DEGs 在 ATP 结合中富集（GO：0005524），13 个 DEGs 富集在次生代谢过程（GO：0019748），3 个 DEGs 富集在精胺酸分解过程(GO：0046208)，28 个 DEGs 富集在葡糖基转移酶活性（GO：0035251），3 个 DEGs 富集在苯甲酸葡萄糖基转移酶活性(GO：0052641)，8 个 DEGs 富集在 水 杨 酸 糖 苷 转 移酶(GO：0052640)。28 个DEGs 富集在葡糖基转移酶活性。0.1110100百分比 percentage of genes基因个数 gene number2 1352 415213241212422biological adhesionbiological regulationcell killingcellular component organization or biogenesiscellular processdevelopmental processestablishment of localizationgrowthimmune system processlocalizationlocomotionmetabolic processmulti-organism processmulticellular organismal processnegative regulation of biological processpositive regulation of biological processregulation of biological processreproductionreproductive processresponse to stimulusrhythmic processsignalingsingle-organism processcellcell junctioncell partextracellular matrixextracellular matrix partextracellular regionextaracellular region partmacromolecular complexmembrabcemembrane partmembrane-enclosed lumenmitochondrion-associated adherens complexnucleoidorganelleorganelle partsymplastsynapsesynapse partvirionvirion partD-alanyl carrier activityantioxidant activitybindingcatalytic activitychannel regulator activitychemoattractant activitychemorepellent activityelectron carrier activityenzyme regulator activitymetallochaperone activitymolecular transducer activitymorphogen activitynucleic acid binding transcription factor activitynutrient reservoir activityprotein binding transcription factor activityprotein tagreceptor activityreceptor regulator activitystructral molecule activitytranslation regulator activitytransporter activityBiological process生物学过程Cellular component细胞组分Molecular function分子功能基因本体分类 Gene ontology classification(CL-vs-FY6H)Up 上调Down 下调图 2春绿与福云 6 号差异显著富集 GO 分类Fig.2Significantly enriched GO groups in CL and FY6H2.5KEGG 代谢通路分析对春绿与福云 6 号样本进行 KEGG 代谢通路分析（图 3），有 8657 个基因注释到 191 个代谢通路中，这些基因中有1277 个显著差异基因。其中Unigenes 排名前 20 代谢通路有：40 条 DEGs 参与卵母细胞减数分裂（ko04114），45 条 DEGs 参与RNA 降解（ko03018），29 条 DEGs 参与脂肪酸代谢（ko01212），17 条 DEGs 参与不饱和脂肪酸的生物合成（ko01040），40 条 DEGs 参与药物代谢细胞色素 P450（ko00982），40 条 DEGs 参与细胞色素 P450 外源生物代谢（ko00980），27 条 DEGs参与氨酰基-tRNA 生物合成（ko00970），66 条DEGs 参与苯丙素的生物合成（ko00940），13 条DEGs 参与氮代谢（ko00910），13 条 DEGs 参与类胡萝卜素生物合成（ko00906），11 条 DEGs 参与油菜素甾醇生物合成（ko00905），10 条 DEGs 参与生物素代谢（ko00780），37 条 DEGs 参与光合作用生物的碳固定（ko00710），27 条 DEGs 参与甲烷代谢（ko00680），8 条 DEGs 参与苯乙烯退化（ko00643），5 条 DEGs 参与氨基苯甲酸酯退化代谢（ko00627），53 条 DEGs 参与谷胱甘肽代谢（ko00480），14 条DEGs 参与氨酸代谢（ko00380），23 条 DEGs 参与精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330），14 条 DEGs 参与角质、亚伯碱和蜡的生物合成（ko00073）。2.6差异表达基因的 qPCR 检测为验证转录组测序结果的可靠性，从转录组数据鉴定到的差异基因中选取了 14 个基因进行实时荧光定量 PCR 分析。其将 RT-qPCR 得到的基因表达趋势与转录组测序结果进行比较，发现基因的表达趋势基本是一致的（图 4），说明转录组数据是可靠的。3讨论与结论近年来，随着基因组测序技术的进步，茶树研究已经步入基因组时代。首先是大叶种茶树云抗 10 号的基因组序列，拉开了茶树基因组学研究的帷幕1，之后基于三代测序补洞的方法测序获得了茶树小叶种品种舒茶早的基因组序列2，接着乌龙茶品种黄棪5和铁观音6的染色体级别基因组发布等。传统的茶树育种和改良方式（新品种选育需1520 年）已很难满足目前市场多元化的需求12，34茶叶学报第64卷分子生物学技术介入茶树育种，能加速理想性状的茶树种质的分子育种。本研究通过对茶树（春绿与福云 6 号）进行转录组测序，获得了大量转录因子 Unigene，可为后期茶树新品系（春绿）抗性研究、次生代谢研究、新品种选育等提供理论依据。本研究通过测序分别获得春绿为47367063.33条 Cleanreads，福云 6 号为 48130043.67 条 Cleanreads，福云 6 号比春绿有着更长的序列，通过将reads比对到参考基因组上，得到各个样本的基因组比对情况，比对率为 90.91%91.52%，说明转录组测序质量整体较高。通过对差异表达基因的GO 富集分析表明，新品系春绿与福云 6 号在生物过程、细胞组分和分子功能三大类别上均分布有差异基因。其中 393 个 DEGs 在 ATP 结合中富集（GO：0005524），28 个 DEGs 富集在葡糖基转移酶活性（GO：0035251），26 个 DEGs 在营养活动(GO：0045735)中富集，20 个 DEGs 在生物碱代谢ko04114:Oocyte meiosis软细胞减数分裂春绿与福云 6 号 KEGG 富集CL-vs-FY6H(Total):KEGG enrichment top 20ko03018:RNA degradationRNA 降解ko01212:Fatty acid metabolism脂肪酸代谢ko01040:Biosynthesis of unsaturated fatty acids不饱和脂肪酸合成ko00982:Drug metabolism-cytochrome P450细胞色素 P450ko00980:Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450细胞色素 P450 外源代谢ko00970:Aminoacvl-tRNA biosvnthesis氨酰基 t-RNA 合成ko00940:Phenylpropanid biosynthesis苯丙氨酸合成ko00910:Nitrogen metabolism氨代谢ko00906:Carotenoid biosynthesis类胡萝卜素合成ko00905:Brassinosteroid biosynthesis油菜素甾醇合成ko00780:Biotin metabolism生物素代谢ko00710:Carbon fixation in photosynthetic organisms光合作用生物炭固定ko00680:Methane metabolism甲烷代谢ko00643:Styene degradation苯乙烯退化ko00627:Aminobenzoate dearadation氨基苯甲酸退化ko00480:Glutathione metabolism谷胱甘肽代谢ko00380:Tryptophan metabolism氨酸代谢ko00330:Arginine and proline metabolism精氨酸与脯氨酸代谢ko00073:Cutin,suberine and wax biosynthesis角质、蜡与亚伯碱合成23富集分数 Enrichment score数量NumberpValue2040600.0200.0150.0100.005图 3春绿与福云 6 号 KEGG 代谢通路富集显著差异基因表达模式Fig.3Top enriched KEGG pathways of DEGs in CL and FY6H1210864202468差异倍数 Different timesRNA-seqRT-PCRLOC114256700LOC114277243LOC114312604LOC114318002LOC114313427LOC114312679LOC114312790LOC114315044LOC114302706LOC114312621LOC114302721LOC114283749LOC114312612LOC114312518图 4差异基因的表达验证Fig.4Expression verification of differential genes第2期林郑和等：基于 RNA-Seq 分析茶树新品系春绿生物信息35过程（GO：0009820）富集。进一步分析发现，新品系春绿中 66 条 DEGs 参与苯丙素的生物合成（ko00940），其中参与苯丙氨酸与酪氨酸代谢中的大部分基因表达都增加，其中苯基丙酸合成基因（LOC114255969）上调 2.49 倍、甘露醇脱氢酶（LOC114256196）上 调 3.2 倍、-葡 萄 糖 苷 酶（LOC114256477）上调 4.1 倍。说明新品系春绿在氨基酸合成、香气合成等方面明显强于福云6 号。这也进一步说明了新品系春绿制绿茶品质明显优于福云 6 号。脂肪酸代谢由涉及脂肪酸或与脂肪酸密切相关的各种代谢过程组成，脂肪酸是属于脂质常量营养素类别的分子家族。这些过程主要可分为：（1）产生能量的分解代谢过程；（2）合成代谢过程，它们作为其他化合物的构建块。本研究发现，29 条 DEGs 参 与 脂 肪 酸 代 谢（ko01212），大部分都显著上调，其中酰基辅酶 A 氧化酶（LOC114262883）上 调 3.1 倍；ACP 脱 氢 酶（LOC114265912）上调 3.6 倍。结合 GO 富集分析，发现 393 个 DEGs 在 AT