16SrRNA高通量测序技...肾移植患者唾液菌群分布特征_姚雅男.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3201肾移植手术的成功开展，挽留了很多患者的生命1。为了保证移植后肾脏的功能，患者必须服用免疫抑制剂2。口腔微生物群是宿主状态的反映，在各种疾病的发生发展中起着重要作用，服用免疫抑制剂可以改变移植患者术后 6 个月以上的口腔微生物组成3，口腔微生物群的变化也可能作为一个危险因素影响着疾病的进展4。此前研究已经使用16S rRNA 测序技术对人类许多口腔疾病微生物群进行分析5,6。然而，仍然有一些与全身因素相关的疾病需要从口腔微生物群落的角度进行探讨7,8。龋病的发生受到机体免疫状态和环境等因素的共同影响9，肾移植后患者身体机能发生改变，免疫抑制类药物的使用可能会改变口腔内唾液菌群的平衡，从而影响龋病的发生及发展。本研究将关注点集中在肾移植患者群体，期望能对肾移植术后 1 年的患者唾液菌群有一定的认识和了解。资料和方法1.研究对象纳入标准：实验 T(Transplantation)组随机选取就诊于内蒙古包钢医院泌尿外科肾移植术后的患者，年龄 20 55 岁，且移植时间 1 年，服用的免疫抑制剂包括他克莫司，入组前 3 个月内无抗生素应用史，无其他严重系统性疾病，无严重术后并发症，无重度牙周病、无重度口腔黏膜病等口内病变；对照 C(Caries)组选择就诊于我科的高龋均（DMFT 6）患者，要求全身无系统性疾病，除龋病外口腔内无其他疾病，且其生活环境、饮食习惯16SrRNA 高通量测序技术分析肾移植患者唾液菌群分布特征姚雅男 梁宏雁 吉俊盈 王靖宇 高静 姜志伟 常秋芳【摘要】目的 以高龋均患者唾液菌群为参照，应用高通量测序技术分析肾移植患者唾液菌群分布情况。方法 选取 9 名肾移植术后 1 年的患者为实验组，9 名高龋均的患者（DMFT 6）为对照组，采集唾液，提取DNA 进行 PCR 扩增、测序，分析两组唾液菌群结构及多样性差异。结果 肾移植组患者与高龋均组患者唾液菌群有相似的多样性指数，指数比较差异无统计学意义（P 0.05）。肾移植组与高龋均组患者唾液菌群均具有特定的优势菌，且保持相对稳定性，在相对丰度上存在差异，其中厚壁菌门（Firmicutes），梭杆菌门（Fusobacteria），纤毛菌属（Leptotrichia spp.），坦纳菌属（Tannerella spp.），梭菌属（Clostridium spp.）在两组间具有显著差异。结论 肾移植患者口腔微生物群落结构与高龋均人群存在差异。【关键词】16SrRNA；肾移植；唾液菌群【中图号】R780.2【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.03.012The distribution of salivary flora in renal transplant patients YAO Ya-nan,LIANG Hong-yan,JI Jun-ying,WANG Jing-yu,GAO Jing,JIANG Zhi-wei,CHANG Qiu-fang.College of Stomatology,Baotou Medical College,Department of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014060,China【Abstract】Objective To determine the distribution of salivary flora in renal transplant patients.Methods Salivary samples were obtained from nine patients with renal transplant and nine patients with high mean DMFT.Saliva samples DNA was extracted,amplified and sequenced.The differences of salivary flora structure and diversity between the two groups were analyzed.Results The diversity index of salivary flora in kidney transplantation group and high caries group was similar,but there was no statistical significance(P 0.05).The salivary flora of kidney transplantation group and high caries group had specific dominant bacteria,and maintained relative stability,and there were differences in relative abundance.Among them,Firmicutes,Fusobacteria,Leptotrichia spp.,Tannerella spp.and Clostridium spp.were significantly different between the two groups.Conclusions The oral microflora structure of kidney transplantation patients is different from that of the people with high caries.【Key words】16SrRNA;Kidney transplantation;Salivary flora 基金项目：包头医学院科学研究基金项目-秦文斌科技教育基金（BYJJ-QWB 201912）作者单位：014060 包头 内蒙古科技大学包头医学院口腔医学院，第一附属医院口腔科通信作者：常秋芳，E-mail：，电话：[phone]北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3202等与实验组基本匹配。排除标准：有口腔出血史或患有口腔感染性疾病，有特殊的口腔不良习惯比如嚼槟榔等，有烟酒嗜好，入组前 3 个月内有抗生素应用史。本研究获得包头医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（伦理编号：20220009），所有志愿者均在取样和收集信息前签署书面知情同意书。2.实验设备和材料核酸电泳仪（北京市六一仪器厂，中国）；Covaris 超声波破碎仪（Massachusetts 公司，美国）；Qubit Fluorometric Quantification（Life Technologies 公 司,加拿大，美国）；安捷伦 Agilent 2100 生物分析仪（Agilent Technologies Co Ltd.公司，美国）；PCR 仪（Bio-Rad 公司,美国）；测序仪（Illumina公司,圣地亚哥，加拿大，美国）。3.唾液样本的采集研究对象 12 h 内未进行口腔清洁，晨起时进行唾液样本采集。采样时，受试者先用无菌蒸馏水漱口，收集其非刺激性唾液 3 ml，然后立即在冰浴下(约-4 )转送至实验室，放置于-20 冰箱保存备用。4.实验方法DNA 抽提和 PCR 扩增：使用 Qiagen 胶回收试剂盒对唾液样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度。341F（5-CCTAYGGGRBGCASCAG-3）和 806R（5-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3)引 物 对V3+V4 可变区进行 PCR 扩增，根据 PCR 产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用 1TAE 浓度 2%的琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物。所有 PCR 反应在 30 l 反应中进行，15 l Phusion 高保真 PCR试剂盒（High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,New England Biolabs）；0.2 mol 的正向和反向引物，约 10 ng 模板 DNA。文库构建和上机测序：使用 Illumina 公司 TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建 库 试 剂盒（Illumina,USA）进行文库构建，合格后，使用NovaSeq 6000 PE250 进行上机测序。信息分析：运用 QIIME2 feature-classifier 插件将代表序列比对到预先训练好的 13_8 版本 99%相似度的GREENGENES数据库，得到物种的分类信息表。结 果1.一般情况本研究纳入高龋均 C 组患者 9 例（34.89.0）岁，其中男性 2 人，女性 7 人；肾移植 T 组患者9 例（44.111.2）岁，其中男性 3 人，女性 6 人，年龄性别比例组间比较无统计学意义（P 0.05）。2.OTUs 聚类分析比较不同菌种丰度18 个样本共得到 1835702 条高质量序列，每一个样本检测得到平均 101983 条序列数，单个样本最少为 80948 条，最高为 111564 条。根据序列的99%相似性进行 OTU 聚类，共得到 2841 个 OTU。其中同时存在于肾移植 T 组和高龋均 C 组的 OTUs为 559，高龋均 C 组独有的菌种高于肾移植 T 组独有的菌种(1430：852)。OTU 通过与 Greengenes 数据库比对，所有样本注释到可被命名的 17 个门、38个纲、67 个目、116 个科、181 个属、114 个种。3.菌群组成和相对丰度在门水平，高龋均组和肾移植组唾液样本中的优势菌门分别为：变形菌门（Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），拟杆菌门（Bacteroidetes），梭杆菌门（Fusobacteria），放线菌门（Actinobacteria），SR1，各优势菌门在两组中的分布情况见图 1。其中，厚壁菌门在高龋均组的丰度显著高于肾移植组，梭杆菌门在肾移植组的丰度显著高于高龋均组，且差异均有统计学意义（P 0.05）（表 1）。在属水平，两个组别检测到的优势菌属如下：链球菌属（Streptococcus spp.），嗜血杆菌属（Haemophilus spp.），普氏菌属（Prevotella spp.），奈瑟氏菌属（Neisseria spp.），韦荣氏球菌属（Veillonella spp.），消化链球菌属（Peptostreptococcus spp.），梭杆菌属（Fusobacterium spp.），罗氏菌属（Rothia spp.），放线菌属（Actinomyces spp.），卟啉单胞菌属（Porphyromonas spp.），颗粒链菌属（Granulicatella spp.），聚杆菌属（Aggregatibacter spp.），乳 杆 菌 属（Lactobacillus spp.），纤 毛 菌 属（Leptotrichia spp.），莫 拉 克 斯 氏 菌 属（Moraxella spp.）。其中纤毛菌属在高龋均组的丰度显著高于肾移植组，差异有统计学意义（P 0.05）（表 3）。讨 论机体全身状态的改变以及长期使用免疫抑制剂可能会使口腔卫生较差的肾移植患者更易发生口腔相关疾病10。发生口腔并发症会影响肾移植患者术后的生活质量，而且还会增加肾移植患者罹患全身并发症的几率，甚至导致移植的失败或造成死亡11。因此，了解肾移植患者唾液菌群的分布对于更好的指导其保健口腔，提高生活质量是有意义的。有研究报道12，唾液的核心菌群在门水平主要包括变形菌门，厚壁菌门，拟杆菌门，梭杆菌门，放线菌门等；在属水平主要包括链球菌属，嗜血杆菌属，普氏菌属，奈瑟氏菌属，韦荣氏球菌属，消化链球菌属，梭杆菌属，罗氏菌属，放线菌属，卟表 1 两组门水平唾液菌群组成和相对丰度分析菌门名称高龋均 C 组 肾移植 T 组P 值Proteobacteria 变形菌门0.28750.31870.684Firmicutes 厚壁菌门0.34710.19400.027*Bacteroidetes 拟杆菌门0.23100.21940.830Fusobacteria 梭杆菌门0.03970.16970.020*Actinobacteria 放线菌门0.08230.07830.922SR10.00330.00820.297TM70.00260.00190.476Spirochaetes 螺旋体门0.00160.00220.565Synergistetes 互养菌门0.00010.00220.119GN020.00000.00210.295Tenericutes 软壁菌门0.00030.00160.267注：*：P 0.05表 2 两组属水平唾液菌群组成和相对丰度分析菌属名称高龋均 C 组肾移植 T 组PStreptococcus spp.链球菌属0.16910.09800.210Neisseria spp.奈瑟氏菌属0.08460.17730.075Prevotella spp.普氏菌属0.12920.12400.881Haemophilus spp.嗜血杆菌属0.14560.06230.093Fusobacterium spp.梭杆菌属0.02930.12520.089Porphyromonas spp.卟啉单胞菌属0.02020.05620.074Rothia spp.罗氏菌属0.02960.04650.290Veillonella spp.韦荣氏球菌属0.04680.02830.340Actinomyces spp.放线菌属0.03370.02650.662Leptotrichia spp.纤毛菌属0.01010.04400.031*Prevotella_1 spp.普氏菌属 _10.02950.02350.443Peptostreptococcus spp.消化链球菌属0.03670.00410.347Granulicatella spp.颗粒链菌属0.01720.01780.917Aggregatibacter spp.杆菌属0.02150.01090.574Lautropia spp.劳特罗普氏菌属0.00730.01550.215Lactobacillus spp.乳酸菌0.02030.00080.323Moraxella spp.莫拉克斯氏菌属0.00100.01860.171Tannerella spp.坦纳菌属0.00010.00070.023*Clostridium spp.梭菌属0.00040.00000.044*注：*：P 0.05注：Unspecified-Bacteria 表示此分类水平没有明确的命名；Unclassified 表示未被注释到的菌门图 1 优势菌门在两组唾液样本中的分布情况注：Unspecified_Clostridiales、Unspecified_Gemellaceae 为数据库未完全匹配的菌；other 为相对丰度较低的菌属图 2 优势菌属在两组唾液样本中的分布情况表 3 高龋均 C 组和肾移植 T 组的多样性指数（sx）组别Chao1 Faith_ pdObserved_ otusShannonSimpson高龋均 C 组 344.1692.95 25.478.60 343.0093.11 5.600.88 0.930.05肾移植 T 组 315.0074.24 19.774.99 313.2273.25 5.580.68 0.930.05P 值0.670.110.690.931.00北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3204啉单胞菌属，颗粒链菌属，聚杆菌属，乳酸菌属，纤毛菌属等，这与本研究的结果是相符的。根据本研究的结果，肾移植组患者及高龋均组患者唾液菌群与正常青少年唾液的菌群结构相似13，与之前关于口腔菌群结构的研究类似14，这表明两组患者口腔内细菌群落结构都是相对稳定的。正常人口腔的微生物体系建立后，在几个月甚至几年都可以保持稳定15，说明核心的优势微生物维持着口腔内菌群的稳定及平衡。厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、梭杆菌门 5 个主要优势菌门在不同程度龋病组菌斑中都占有 97%以上的序列数且随着年龄的改变这些种群的转换在不同患龋儿童患者中基本上未发生有差异的改变16。本研究中肾移植组和高龋均组中都为前 5 位的优势菌与上述研究相符，说明这 5 种优势菌是唾液微生物中的核心微生物，肾移植组患者整体的唾液菌群结构并没有受到明显影响，且核心微生物的组成与高龋均组保持一致。本研究中，肾移植组（19%），高龋均组（35%），厚壁菌门丰度在高龋均组较高证明厚壁菌门是和患龋有相关性的17，同时，梭杆菌门在肾移植患者唾液中具有显著优势。有研究表明18在龋病个体菌斑中，链球菌属、韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属的相对丰度较高；Jiang 等19发现：嗜血杆菌属、乳酸菌属和纤毛菌属在龋病中较为常见。本研究中高龋均组中链球菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、乳酸菌属的相对丰度高于肾移植组，没有统计学意义，而纤毛菌属在两组之间具有统计学意义，这说明两组菌群结构虽然相似，但在组成丰度上存在差异，且各具优势菌。本研究中肾移植患者虽然唾液菌群构成与高龋均组相似，但是患龋率较低，可能是因为免疫抑制剂的使用对唾液中最丰富的细菌相对丰度及种类并没有显著影响，也许只是增加了在免疫受损宿主中机会性致病菌致病的风险。本研究中两组的变形菌相对丰度均较高，肾移植组变形菌门（32%），高龋均 C 组（29%），一些器官移植的研究表明，变形菌的相对丰度较高与不良的口腔健康状态有关14。本研究中肾移植患者和高龋均患者口腔卫生均一般，所以变形菌的相对丰度均较高。综上所述，肾移植患者的唾液菌群保持相对的稳定，核心微生物的组成与非肾移植患者保持相似的结构，与高龋均患者的唾液菌群丰度存在差异性，临床工作中应强调肾移植患者增强口腔保健意识。由于样本有限，未来还需要从不同时间段进行进一步的分析和研究。参 考 文 献 1 Campbell PM,Humphreys GJ,Summers AM,et al.Does the microbiome affect the outcome of renal transplantation?J Front Cell Infect Microbiol,2020,23(10):558-644.2 Colombo D,Ammirati E.Cyclosporine in transplantation-a history of converging timelines.J Biol Regul Homeost Agents,2011,25(4):493-504.3 Fricke WF,Maddox C,Song Y,et al.Human microbiota characterization in the course of renal transplantation.Am J Transplant,2014,14(2):416-427.4 Li H,Sun J,Wang X,et al.Oral microbial diversity analysis among atrophic glossitis patients and healthy individuals.J Oral Micrbiol,2021;13(1):1984063.5 由林,周瑞平,郭丽.16SrRNA基因检测技术在牙周病患者的口腔微环境研究的应用及诊断探索.口腔医学研究,2021,37(6):574-578.6 刘馨彤,胡亮,杨彬,等.口腔癌患者唾液菌群变化与口腔癌相关性的初步研究.北京口腔医学,2019,27(6):317-320.7 Baker JL,Morton JT,Dinis M,et al.Deep metagenomics examines the 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