大蒜多糖脂质体制备及结构表征_孙艺.pdf

孙艺，乔旭光，郑振佳，等.大蒜多糖脂质体制备及结构表征 J.食品工业科技，2023，44（14）：915.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120050SUN Yi,QIAO Xuguang,ZHENG Zhenjia,et al.Preparation and Structural Characterization of Garlic Polysaccharide LiposomesJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):915.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120050 青年编委专栏食品营养素包埋与递送（客座主编：黄强、蔡杰、陈帅）大蒜多糖脂质体制备及结构表征大蒜多糖脂质体制备及结构表征孙艺1，乔旭光1,2，郑振佳1,2，邱志常1，赵人杰1，齐永秋1，卢晓明1,2,*（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018；2.山东省高等学校食品营养与健康重点实验室，山东泰安 271018）摘要：本研究利用大蒜多糖、大豆卵磷脂和胆固醇制备了一种新型多糖脂质体并对其进行结构表征。以膜材比、脂药比和超声时间为因素，包封率为响应值，采用单因素和响应面试验确定了大蒜多糖脂质体最优制备条件，并对其微观形态、粒径、紫外扫描光谱、红外扫描光谱及稳定性进行了研究。结果表明，大蒜多糖脂质体的最优制备条件为膜材比 4:1，脂药比 24:1，超声时间 14 min，最大包封率为 61.00%0.73%；所得脂质体为球状小囊泡结构、分散均匀、稳定性较好，粒径为 213.501.85 nm、聚合物分散性指数（Polymer Dispersity Index，PDI）为0.1870.005、Zeta 电位为21.071.27 mV；紫外和红外光谱表明大蒜多糖被成功包埋进脂质材料中，并且包埋过程不形成新化学键，仅产生静电相互作用；稳定性试验显示 4 保存 28 d 后，大蒜多糖脂质体粒径由 211.130.54 nm 增至 225.700.65 nm，PDI 由 0.1870.003 增至 0.2360.001，包封率由 60.96%0.32%降至 56.97%0.74%，体系仍较为稳定。因此，本研究制备的大蒜多糖脂质体包封率较高、粒径小、分散性好、稳定性高，可为开发大蒜多糖衍生产品提供参考依据。关键词：大蒜多糖，脂质体，响应面法，结构表征，包封率本文网刊:中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14000907DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120050PreparationandStructuralCharacterizationofGarlicPolysaccharideLiposomesSUNYi1，QIAOXuguang1,2，ZHENGZhenjia1,2，QIUZhichang1，ZHAORenjie1，QIYongqiu1，LUXiaoming1,2,*（1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Healthy in Shandong Province,Taian 271018,China）Abstract：In this study,a novel polysaccharide liposome was prepared using garlic polysaccharides,soybean lecithin andcholesterol and structurally characterized.The optimal preparation conditions of garlic polysaccharide liposomes weredetermined by single-factor and response surface tests using the film-material ratio,lipid-drug ratio and ultrasonic time asfactors and the encapsulation efficiency as response values.The obtained liposomes were characterized in terms ofmicromorphology,particle size,UV spectrum,IR spectrum and stability.The results showed that the optimal preparationconditions of garlic polysaccharide liposomes were as follows:Film-material ratio of 4:1,lipid-drug ratio of 24:1,ultrasonic time of 14 min,with the maximum encapsulation efficiency of 61.00%0.73%.The obtained liposomes appearedas spherical vesicles with uniform dispersion and good stability.Their particle size,polymer dispersity index and zetapotential were 213.501.85 nm,0.1870.005 and 21.071.27 mV,respectively.UV and IR spectra confirmed that garlicpolysaccharides were successfully encapsulated into the lipid material through electrostatic interactions,without theformation of new chemical bonds.After 28 days of storage at 4,the particle size of garlic polysaccharide liposomesincreased from 211.130.54 nm to 225.700.65 nm,the PDI increased from 0.1870.003 to 0.2360.001,and theencapsulation efficiency decreased from 60.96%0.32%to 56.97%0.74%,exhibiting a relative stability.Therefore,the 收稿日期：20221208 基金项目：山东省泰山产业领军人才工程高效生态农业创新类计划项目（tscy20200121）；菏泽市科技创新突破计划项目（2022KJTP10）。作者简介：孙艺（1998），女，硕士研究生，研究方向：园产品加工，E-mail：。*通信作者：卢晓明（1986），女，博士，讲师，研究方向：园产品加工，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 garlic polysaccharide liposomes prepared in this study had high encapsulation efficiency,small particle size,gooddispersion and high stability,which could provide a reference for the development of garlic polysaccharide derivatives.Keywords：garlic polysaccharides；liposomes；response surface methodology；structural characterization；encapsulationefficiency 大蒜（Allium sativum L.）属百合科葱属植物，药食两用1。大蒜多糖作为大蒜中的主要功能成分，占干重 70%以上，具有抗氧化、降血脂、免疫调节、抗凝血、抑菌、抗癌、抗炎和增强矿物质吸收等诸多生物活性25。大蒜多糖易溶于水，主要消化部位在结肠，但大蒜多糖易被酸水解，在到达结肠前易于被分解，导致其口服生物利用度降低67。功能成分递送系统可以改善有效成分在机体内的利用度，脂质体便是该系统中重要的纳米颗粒8。脂质体主要由排列有序的磷脂双分子层包埋有效成分构成，直径在 251000 nm 范围内，可通过口服、注射、透皮给药等多种方式作用于机体910。脂质体因其可提高有效成分稳定性、减缓药物不良反应、缓释及靶向输送药物且具备高生物相容性等诸多优势1115，迅速成为各界研究热点，更是被美国食品药品管理局批准为可用于市场营销的纳米药物制剂之一。植物多糖脂质体的研究已成为当下热点。Gao等16通过薄膜分散法制备得到淫羊藿多糖脂质体并作用于注射 ND 疫苗的鸡，发现 1 mg mL1脂质体在第 7、14、21、28 d 淋巴细胞增殖较同剂量多糖分别增加了 31.02%、17.76%、21.80%、26.69%，说明淫羊藿多糖制备成脂质体后可显著提高其佐剂活性。此外，脂质体还可以提高枸杞多糖和麦冬多糖的免疫增强活性1718。Zhang 等19证实了黄芪多糖脂质体和黄芪多糖均可提高大黄鱼血清超氧化物歧化酶的活性，并降低过氧化产物丙二醛的含量，且黄芪多糖剂量为脂质体的 5 倍时，脂质体抗氧化能力优于多糖。阚晓月20发现葛根多糖 PLR1 脂质体组急性高脂血症小鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量较多糖组分别降低 16.86%、22.73%、6.05%，表现出了更强的降血脂活性。大量研究表明，植物多糖制备成脂质体后，其生物活性和生物利用度均可得到明显提高。然而，目前关于制备大蒜多糖脂质体的报道较少。本研究采用反相蒸发法结合微孔滤膜挤压法制备大蒜多糖脂质体，以大豆卵磷脂、胆固醇和大蒜多糖为原料，利用响应面优化制备工艺并对其进行结构表征，旨在提供一种稳定高效的大蒜多糖脂质体制备方法，以提高大蒜多糖的生物利用度、开阔其应用领域，为大蒜多糖的开发利用及相关功能性产品的研发提供一定技术支撑。1材料与方法 1.1材料与仪器大蒜购于莱芜；大豆卵磷脂（纯度98%）、胆固醇（纯度95%）上海麦克林生化科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、乙酸乙酯天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚天津市巴斯夫化工贸易有限公司；浓硫酸天津市科密欧化学试剂有限公司；所有试剂均为分析纯。旋转蒸发器、SHB-型循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司；SCIENTZ-12N 型冷冻离心机艾本德生命科学公司；AX224ZH 型万分之一天平常州奥豪斯仪器有限公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；酶标仪、Nicolet Is10 型傅里叶红外光谱仪赛默飞世尔科技公司；JY92-型超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer-Nano-ZS 型激光纳米粒度分析仪英国马尔文公司；UV-2450 型全波长紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；JEM-1400PLUS 型透射式电子显微镜日本电子株式会社（JEOL）。1.2实验方法 1.2.1 大蒜多糖的制备通过水提醇沉法从新鲜大蒜中提取大蒜多糖21。新鲜去皮大蒜按照料液比1:6 打浆，80 浸提约 2.5 h 后使用纱布滤去蒜渣，5000 r/min 下离心 10 min，上清液浓缩，除去浸提液中的果胶和蛋白质，醇沉，透析，冻干，得到纯度为91.63%的大蒜多糖。1.2.2 大蒜多糖脂质体的制备通过反相蒸发结合膜挤压法制备大蒜多糖脂质体22。将一定比例大豆卵磷脂和胆固醇溶于 15 mL 乙酸乙酯中制为油相，一定质量的大蒜多糖溶于 5 mL pH 7.4 磷酸缓冲液中制为水相，两相室温下超声混匀 10 min，超声功率为 400 W；旋蒸至凝胶状，加 20 mL 磷酸盐缓冲液水化 20 min，使用超声细胞破碎仪进行超声破碎，分别使用 0.45 m 和 0.22 m 滤膜处理三次，得脂质体悬浮液，放入冰箱 4 下保存备用。空白脂质体同样采取上述方法制备，整个过程不加入大蒜多糖。1.2.3 大蒜多糖脂质体包封率的测定通过超速离心法测定包封率23。吸取 1 mL 脂质体至离心管中，13000 r/min 冷冻离心 30 min，吸取上清液，定容至10 mL，以空白脂质体为对照，采用苯酚-浓硫酸法测定其多糖含量24，计算其上清液中游离多糖质量，进而可得包封率。包封率的计算公式为：包封率(%)=W投W游W投100式中，W投为投入的大蒜多糖质量，mg；W游为游离的大蒜多糖质量，mg。10 食品工业科技2023 年 7 月 1.2.4 单因素实验 1.2.4.1 大豆卵磷脂与胆固醇质量比（膜材比）对大蒜多糖脂质体包封率的影响固定大豆卵磷脂质量为 180 mg，大豆卵磷脂与大蒜多糖质量比（脂药比）为 25:1，超声时间 15 min，考察膜材比在 3:1、4:1、5:1、6:1 和 7:1 时对大蒜多糖脂质体包封率的影响。1.2.4.2 脂药比对大蒜多糖脂质体包封率的影响固定大豆卵磷脂质量为 180 mg，膜材比为 4:1，超声时间 15 min，考察脂药比在 15:1、20:1、25:1、30:1和 35:1 时对大蒜多糖脂质体包封率的影响。1.2.4.3 超声时间对大蒜多糖脂质体包封率的影响固定大豆卵磷脂质量为 180 mg，脂药比为 4:1，膜材比为 25:1，考察超声时间在 5、10、15、20 和 25 min时对大蒜多糖脂质体包封率的影响。1.2.5 响应面法设计根据上述单因素实验结果，选择膜材比（A）、脂药比（B）和超声时间（C）为自变量，每个因素设置三个水平，以包封率为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6 选择 Box-Behnken 模型软件进行响应面设计，具体见表 1。根据响应面试验结果预测最佳工艺，按照预测的最佳制备工艺，制备大蒜多糖脂质体 3 组，测定其包封率并与预测值进行比较。表 1 响应面试验的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology水平因素A 膜材比（w/w）B 脂药比（w/w）C 超声时间（min）13:120:11004:125:11515:130:120 1.2.6 微观形态观察吸取少量 PBS 稀释十倍的大蒜多糖脂质体悬浮液，通过磷酸钨-负染色法25进行处理。具体来说，吸取适量样品滴至铜网上，5 min后吸去多余样液，滴加 2%磷酸钨溶液，染色 5 min，吸取多余液体，室温晾干，使用透射电镜观察大蒜多糖脂质体微观形态。1.2.7 粒径分布、PDI 及 Zeta 电位吸取少量 PBS稀释十倍的大蒜多糖脂质体悬浮液，室温下置于激光粒度仪样品池中，检测其粒径、PDI 及 Zeta 电位26。1.2.8 紫外吸收光谱测定吸取大蒜多糖溶液、大蒜多糖脂质体和空白脂质体，以去离子水为对照，在200400 nm 范围内进行紫外扫描27。1.2.9 红外吸收光谱测定使用红外光谱仪在 5004000 cm1范围内对大蒜多糖和大蒜多糖脂质体进行红外光谱扫描28。1.2.10 稳定性试验将大蒜多糖脂质体分装密封好，分别置于 4 和室温环境下，在 0、7、14、21 和28 d 取样，测其包封率、粒径及 PDI。1.3数据处理利用 SPSS 19.0 软件中的 LSD 和 Duncan 检验对各数据进行统计学分析，P0.05 或 P0.05 不显著，说明该模型适用于该工艺的筛选。2.2.2 响应面分析结果各因素两两相互作用对大蒜多糖脂质体包封率的影响见图 2A图 2C。从图中可以看出，随着各交互因素水平的提升，大蒜多糖脂质体包封率呈先升高再下降的趋势。其中图 2C固定膜材比编码水平为 0，考察脂药比和超声时间对包封率的影响，包封率随着脂药比和超声时间的增加逐步增大而后减小，与回归模型分析结果一致。通过比较三组响应面陡峭度变化，图 2C 响应面曲面陡峭度最大，表明在以下两因素相互作用的三组中，脂药比和超声时间交互作用对大蒜多糖脂质体包封率影响更明显。表 3 响应面模型的方差分析Table 3 ANOVA of the response surface model类型平方和自由度均方F值P值显著性模型860.64995.6321.870.0003*A-膜材比46.37146.3710.610.0139*B-脂药比80.9180.918.50.0036*C-超声时间211214.80.0645AB6161.370.2796AC13.25113.253.030.1253BC15.6115.63.570.1008A2162.091162.0937.070.0005*B2206.291206.2947.180.0002*C2238.391238.3954.530.0002*残差30.6074.37失拟项25.4538.486.580.0502纯误差5.1641.29总和891.2516注*表示差异极显著，P0.01；*表示差异显著，P0.05。65AB60555045403.0:13.5:14.0:14.5:15.0:13.0:13.5:14.0:14.5:15.0:120:122:124:126:128:1B:脂药比C:超声时间(min)A:膜材比A:膜材比包封率(%)65605550454035包封率(%)30:1101214161820 12 食品工业科技2023 年 7 月 2.2.3 模型预测结果的验证响应面试验优化得到的大蒜多糖脂质体最优制备条件为膜材比 4.25:1，脂药比 23.63:1，超声时间 14.13 min，所得大蒜多糖脂质体包封率为 61.30%。结合实际操作情况，将最终制备工艺修正为膜材比 4:1，脂药比 24:1，超声时间14 min，在此条件下进行 3 组平行验证试验，得到大蒜多糖脂质体包封率为 61.00%0.73%，与预测值的相对偏差仅 0.30%，无显著性差异。2.3微观形态观察如图 3 所示，大蒜多糖脂质体为球形或类球形的小囊泡结构；粒径在 200 nm 左右，体系稳定、无破裂、粒径均一、分布均匀且外观圆整规范，与玉屏风多糖脂质体33和枸杞多糖脂质体34等形态相似。TEM(100000)TEM(40000)200 nm1 m图 3 大蒜多糖脂质体透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscope of garlicpolysaccharide liposomes 2.4粒径分布、PDI 及 Zeta 电位图 4 展示了大蒜多糖脂质体的粒径分布情况，大蒜多糖脂质体的平均粒径为 213.501.85 nm，其粒径分布较窄且呈正态分布；PDI 为 0.1870.005，Zeta 电位为21.071.27 mV，说明所制脂质体分散性和稳定性良好。2.5紫外吸收光谱测定大蒜多糖、大蒜多糖脂质体及空白脂质体的紫外吸收光谱如图 5 所示。大蒜多糖在 200400 nm范围内无较明显紫外吸收峰，表明大蒜多糖纯度较高且其中不含蛋白质和核酸等杂质；大蒜多糖脂质体紫外图谱与大蒜多糖趋势基本相同；而卵磷脂和胆固醇在紫外波长区内吸收相对较弱35，使得空白脂质体较前两者在 200400 nm 范围内整体吸光度极低；以上说明大蒜多糖与脂质体膜材料之间没有形成新的化学键，大蒜多糖被成功地包埋于脂质材料中。2.6红外吸收光谱测定大蒜多糖和大蒜多糖脂质体的红外光谱吸收情况见图 6，两者在 3277、2932、1465 和 1144 cm1等处出现了较为接近的吸收峰，说明大蒜多糖脂质体中含有大蒜多糖；2850、1740、1220 和 1060 cm1吸收峰为两者的差异峰。其中，2850 cm1为卵磷脂脂肪酸酯部分的亚甲基（-CH2-）对称伸缩振动引起，1740 cm1为磷脂头基酯链上羰基（C=O）的伸缩振动 CC:超声时间(min)65605550454035包封率(%)20:122:124:126:128:1B:脂药比30:1101214161820图 2 两因素交互作用对大蒜多糖脂质体包封率的影响Fig.2 Effect of interaction of two factors on encapsulationefficiency of garlic polysaccharide liposomes注：A：膜材比和脂药比；B：膜材比和超声时间；C：脂药比和超声时间。12108642010100粒径(nm)强度(%)1000图 4 大蒜多糖脂质体的粒径分布Fig.4 Particle size distribution of garlic polysaccharideliposomes 1.51.20.90.60.30.0200300波长(nm)吸光度(Abs)400大蒜多糖多糖脂质体空白脂质体图 5 大蒜多糖、大蒜多糖脂质体与空白脂质体的紫外光谱扫描图Fig.5 UV spectra of garlic polysaccharides,polysaccharideliposomes and non-polysaccharide liposome 4000 3500 3000327729321646146511441013927815292432672850174014661220114510609338502500 2000波数(cm1)透过率(%)1500 1000 500大蒜多糖多糖脂质体图 6 大蒜多糖与大蒜多糖脂质体的红外光谱图Fig.6 Infrared spectra of garlic polysaccharides andpolysaccharide liposomes 第 44 卷 第 14 期孙艺，等：大蒜多糖脂质体制备及结构表征 13 峰，1220 cm1为磷酸基团磷酰基（P=O）伸缩振动峰，1060 cm1为磷酸基团磷酸酯键（P-O-C）的伸缩振动峰3637。经过比较亦证明大蒜多糖经过脂质体包埋后并没有产生新的化学键，而是通过静电相互作用连接。2.7稳定性试验大蒜多糖脂质体在 4 和室温下放置 28 d 过程中的稳定性变化情况见表 4，其中，大蒜多糖脂质体初始粒径为 211.130.54 nm，PDI 为 0.1870.003，包封率为 60.96%0.32%；4 环境放置下 28 d，大蒜多糖脂质体粒径和 PDI 分别增至 225.700.65 nm和 0.2360.001、包封率则降至 56.97%0.74%；室温下放置 28 d 的大蒜多糖脂质体粒径、PDI 分别增至252.431.39 nm 和0.3300.003、包封率降至42.55%1.18%；两种环境下的多糖脂质体虽与初始状态相比均有明显差异（P0.05），但 4 环境下各个指标相对变化量明显较小，说明大蒜多糖脂质体在 4 下体系更趋于稳定，有利于大蒜多糖脂质体的保存。表 4 大蒜多糖脂质体稳定性结果Table 4 Stability of garlic polysaccharide liposome suspension因素0 d7 d14 d21 d28 d4 25 4 25 4 25 4 25 粒径（nm）211.130.54Ee214.170.50D222.900.43d217.400.36C231.601.51c222.830.33B243.471.07b225.700.65A252.431.39aPDI0.1870.003Ee0.1970.004D0.2150.003d0.2050.003C0.2860.004c0.2130.002B0.3120.003b0.2360.001A0.3300.003a包封率（%）60.960.32Aa60.110.31A57.150.52b59.560.56AB53.220.31c58.200.92BC47.920.53d56.970.74C42.551.18e注：AE：4 下，大蒜多糖脂质体各个时间段下粒径、PDI及包封率差异显著（P0.05）；ae：25 下，大蒜多糖脂质体各个时间段下粒径、PDI及包封率差异显著（P0.05）。3结论本研究构建了大蒜多糖脂质体运载体系，获得了一种粒径较小、包埋率较高、分散性较好、稳定性较好的大蒜多糖脂质体，可为亲水性功能因子输送体系的构建提供理论支持，为大蒜多糖产品开发提供参考依据。试验以大蒜多糖脂质体包封率为主要评价指标，通过单因素及响应面试验确定了大蒜多糖脂质体最优制备工艺为膜材比 4:1，脂药比 24:1，超声时间14 min，所得的大蒜多糖脂质体包封率为 61.00%0.73%，其形态规则且均一，平均粒径为 213.501.85 nm，分散均匀；紫外扫描光谱、红外扫描光谱证实了大蒜多糖脂质体的形成仅与静电相互作用相关；稳定性试验证实了大蒜多糖脂质体在 4 下保存28 d，其粒径、PDI 及包封率变化较小，脂质体体系依旧保持着相对稳定的状态。参考文献 1 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