超声造影技术在肾移植术后急性排斥反应中的应用进展_冷强华.pdf

第 14 卷 第 4 期2023 年 7 月Vol.14 No.4Jul.2023器官移植Organ Transplantation移植前沿超声造影技术在肾移植术后急性排斥反应中的应用进展冷强华韩飞黄正宇【摘要】急性排斥反应的早期诊断对于移植肾功能保护具有重要意义。病理穿刺活组织检查是诊断移植肾急性排斥反应的金标准，但随之可能出现的出血、感染、肾实质损伤等并发症限制了其应用。近年来，超声造影技术诊断急性排斥反应的灵敏度不断提升，其中靶向超声微泡技术更是进一步提升了超声造影技术诊断的特异度，使其替代病理穿刺活组织检查成为可能。此外，在急性排斥反应治疗领域，空化的超声微泡可以通过诱发声孔效应，促进免疫抑制药局部传递而发挥其抗排斥反应作用。本文对超声造影技术在肾移植术后急性排斥反应的诊断及治疗中的应用进行总结，为超声造影技术在肾移植中进一步应用提供参考。【关键词】肾移植；急性排斥反应；超声造影；超声微泡；炎症细胞浸润；小干扰RNA；T细胞介导的排斥反应；肾实质损伤【中图分类号】R617，R445.1【文献标志码】A 【文章编号】1674-7445（2023）04-0007-07【Abstract】Early diagnosis of acute rejection is of significance for the protection of renal allograft function.Pathological puncture biopsy is the gold standard for the diagnosis of acute rejection of renal allografts.Nevertheless,it may provoke multiple complications,such as bleeding,infection and renal parenchymal injury,which limit its widespread application.In recent years,the sensitivity of contrast-enhanced ultrasound in the diagnosis of acute rejection has been constantly improved.Ultrasound-targeted microbubble technique has further enhanced the diagnostic specificity of contrast-enhanced ultrasound,making it possible to replace pathological puncture biopsy.Besides,in the field of acute rejection treatment,microbubble ultrasonic cavitation may promote local delivery of immunosuppressants by inducing sonoporation and exhibit anti-rejection effect.In this article,the application of contrast-enhanced ultrasound in the diagnosis and treatment of acute rejection after kidney transplantation was reviewed,aiming to provide reference for widespread application of contrast-enhanced ultrasound in kidney transplantation.【Key words】Kidney transplantation;Acute rejection;Contrast-enhanced ultrasound;Ultrasound microbubble;Inflammatory cell infiltration;Small interfering RNA;T cell-mediated rejection;Renal parenchymal injuryDOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023.04.007 基金项目：国家自然科学基金（81970649）；国家自然科学基金青年基金（82200847）；中国博士后科学基金（2020M683083）作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院肾移植科 作者简介：冷强华（ORCID：0009-0006-0818-4774），硕士研究生，研究方向为移植肾排斥反应的诊断与治疗，Email：通信作者：黄正宇（ORCID：0009-0008-1388-8391），博士，主任医师，研究方向为抗体介导的排斥反应和肾脏缺血-再灌注损伤的机制研究，Email：Application progress on contrast-enhanced ultrasound in acute rejection after kidney transplantation Leng Qianghua,Han Fei,Huang Zhengyu.Department of Kidney Transplantation,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,ChinaCorresponding author:Huang Zhengyu,Email:冷强华等超声造影技术在肾移植术后急性排斥反应中的应用进展第 4 期515肾移植是目前针对终末期肾病最有效的治疗手段。随着新型免疫抑制药不断出现以及术后免疫抑制治疗方案不断完善，肾移植排斥反应发生率较前下降，移植肾的存活时间也随之延长。尽管如此，排斥反应仍然是肾移植受者术后常见且严重的并发症1。临床上对移植物排斥反应的诊断通常是以病理学作为“金标准”，然而穿刺活组织检查（活检）作为侵入性检查手段存在较多缺点，如引起出血、感染、肾实质损伤等的风险增高，病变部位分布的不均匀导致穿刺假阴性结果，部分患者需要暂停服用长期使用的抗凝药物，从而导致穿刺不及时而耽误诊断和治疗2。因此，迫切需要一种无创、高效的方法来协助临床排斥反应的诊治。超声技术有着便捷、无创、无放射等优点，是肾移植术后监测移植肾功能最常用的一种检查方法。随着超声技术的发展，超声弹性成像、超声造影等也逐渐应用到临床工作中，为疾病的诊断及治疗提供了强有力的支持。2017 年欧洲超声医学和生物学联合大会强烈推荐超声造影技术用于诊断肾移植术后缺血及微血管病变（炎症、血栓形成等）等并发症3。多针超声微泡技术在肿瘤领域的最新研究发现，其在高频超声下破裂时产生的空化效应，可以促进药物局部的传递与渗透4。因此，理论上如果能将携带免疫抑制药的超声微泡在移植肾的病变区域实施定点投放，将使得此项技术在肾移植领域有着极大的应用前景。本文将聚焦于超声造影技术，对其在肾移植术后急性排斥反应（acute rejection，AR）的诊断及治疗相关研究进行分析和总结，因肾移植动物模型的建立难度较高，部分学者通过心脏移植模型来分析超声在排斥反应中的作用，为充分阐述最新相关研究的进展，本文也涵盖了部分心脏移植相关的研究。1 普通超声造影在肾移植术后急性排斥反应诊断中的应用1.1 普通超声造影下移植肾病变的图像特点超声造影技术通过外源导入较高密度的微泡增强反向散射回声，从而提高微细血流显示的分辨力和敏感性，是一种良好的血池示踪剂，可以对实质器官从动脉早期到静脉晚期的微循环进行连续、实时、动态评估5。超声造影剂可通过呼吸排出体外，且不能穿过毛细血管壁，因而具有良好的安全性能6。SonoVue 是目前国内应用最广泛的一种超声造影剂。静脉注射造影剂后，由肾动脉主干到小叶间动脉逐级在超声下显影成像；随后肾皮质在 2040 s 由内向外快速显影，肾髓质则在 45120 s 之间由每个锥体的周边向中央“扩散”式显影；最后整个移植肾实质在超声下形成分布均匀对称图像7。当移植肾发生 AR 时，肾实质在超声造影成像下表现为包膜下皮质不能完全呈强回声充填，髓质内也可见散在的、大小不等、边界不清的低回声区8，其相较于普通二维超声能更加敏感地提示病变。这是由于 AR 可引发血栓性微血管病以及动脉炎，表现为动脉内膜增厚且常伴有泡沫巨噬细胞、淋巴细胞等积聚，从而造成移植肾动脉血流灌注阻力增加，病变局部微循环血流灌注量减低，甚至缺血梗死，因此移植肾实质内造影剂充填始终较功能正常移植肾稀疏。2020 年，Hai 等9对超声造影诊断肾移植术后并发症的 12 篇临床研究文章进行了荟萃分析，结果显示超声造影诊断肾移植术后并发症的灵敏度为 0.86，特异度为 0.90，曲线下面积（area under the curve，AUC）为 0.94。2022 年，Lerchbaumer 等10的回顾性临床研究以病理活检、增强 MRI、增强 CT 的诊断作为参照标准，对78例肾移植受者同时进行了超声造影检查，结果显示超声造影诊断肾移植术后 AR 或急性肾小管坏死（acute tubular necrosis，ATN）灵敏度高达 0.952，而特异度仅为 0.500。由此可见，超声造影在肾移植术后可以迅速发现 AR 造成的肾损伤，但由于部分肾脏病变（糖尿病肾病、肾小球硬化症等）也可导致肾脏小动脉的阻塞及血流量减少，从而在超声造影下与AR 有相似的表现，在进行诊断时，需要将 AR 与其它疾病相鉴别。1.2 普通超声造影对急性排斥反应诊断的定量分析超声造影的定量分析技术可通过软件动态分析感兴趣区域（region of interest，ROI）内各像素及造影剂微泡回声量的变化，生成时间-强度曲线（time-intensity curve，TIC）。常使用的参数还有达峰时间（time to peak，TTP）、峰值强度（peak enhancement，PE）、上升时间（rising time，RT）、AUC 等11。AR 发生时，血管内膜发生纤维素样坏死伴炎症细胞浸润，导致血管腔狭窄或闭塞，故超声造影常表现为低灌注及灌注时间延长，相较于正常移植肾，RT、TTP 值更高。定量分析相较于图像分析，减少了人为因素导致的主观误差，其结果更客观、准确。2020 年 Goyal 等12将 105 例移植肾受者分为移516第 14 卷器官移植植物功能正常恢复（immediate graft function，IGF）组（对照组）和移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）组，DGF 组 19 例受者再进一步分为 AR 组（5 例）和 ATN 组（12 例），术后 310 d内超声造影结果显示，DGF 组与对照组皮质区及髓质区 TTP、PE、RT、AUC 差异均无统计学意义，而AR 组 RT 明显低于 ATN 组，进一步分析认为 DGF组与对照组差异无统计学意义，可能是由于在移植肾早期并未出现严重血管病变以及样本量偏小。2021 年 Vii 等13对 64 例肾移植受者进行了平均随访时间为12 个月的一项观察性研究，其中 12 例受者发生临床排斥反应，28 例受者仅发生微小病变，处于亚临床状 态，统计学分析发现排斥反应组的髓质 TTP 以及髓质-皮质瞬时 TTP 差均明显小于微小病变组。2022 年 Kim 等14针对 57 例肾移植术后 312 个月受者的一项临床研究中纳入了更多的参数，发现 AR 组的平均信号强度、PE、流入相 AUC（WiAUC）、流出相AUC（WoAUC）、流入相灌注指数均明显小于未出现排斥反应组。以上研究均说明移植术后超声造影的定量分析指标在 AR 组和对照组之间存在差异，只是不同的研究所使用的指标参数略有不同。可以明确的是目前的临床研究中对于 TIC 的参数分析仍未形成统一标准，也尚未对ROI提出一个明确、标准的选取办法，包括大小、形状、部位等。2022 年 Friedl 等15评估了 TIC 不同的分析方法以及比较影响测量参数质量的不同因素后，建议选用多个 5 mm2大小的 ROI，因为此时 AR 组与对照组之间表现出的统计学差异最大，且最能充分体现出皮质区与髓质区 TIC 参数的差异。超声造影定量分析技术可以客观、准确地评估移植肾微循环血流灌注，虽然相关参数分析尚未形成统一标准，但是其定量诊断的能力适用于肾移植术后肾功能常规监测，能够早期提示 AR 的发生。1.3 普通超声造影在急性排斥反应诊断中的优势超声造影能够实时、动态观测造影剂的流入及流出像，并以录像的方式记录下来进行反复观看16。CT 和 MRI 虽然能够全景、多时像观察移植肾的状态，但仅能静态观测已经发生的肾脏局部损伤病灶，且在受者血清肌酐水平较高时不能进行增强造影检查；而超声造影能够动态观察并记录造影剂流入、流出时间以及回声强度，构建 TIC，实时反映肾脏血供状态及血管功能17。近期也有研究报道，在二维超声以及多普勒超声均显示正常的情况下，超声造影在肾移植术后感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）患者中表现出“快进快出”的影像学特征，此类移植肾在 10 个月后均出现严重的移植物功能障碍18。此外，超声造影具备安全可重复、快速便捷的优点，还能够引导靶向穿刺活检，因此其在临床应用中有着巨大的意义。2 靶向超声造影在急性排斥反应诊断 与治疗中的应用心脏移植与肾移植 AR 的发生机制相同，病理上也相似（表现为免疫损伤性血管炎以及 T 细胞、C4d等在发生部位的浸润和沉积），且由于小鼠肾移植模型存在手术难度大、术后并发症多等因素，目前大部分研究者用心脏移植模型替代肾移植模型进行靶向超声造影在排斥反应领域的研究。2.1 超声微泡的发展与合成在 20 世纪 60 年代曾有报道将搅动过的生理盐水注射入大动脉的根部后，在超声下可以发现“主动脉根部出现云状团块样的回声”，这便提示着液体内搅动后产生的气泡也许可作为一种超声下的增强造影剂，随后研究者们合成了一种包裹微量气体的小气泡，成功用于增强超声显像，并将其命名为超声微泡19。从 1994 年第一款上市的由血清白蛋白构成的超声微泡 Albunex，到 1996 年上市的第二款由半乳糖微晶构成的 Levovist，再到如今国内应用最为广泛的由磷脂膜包裹着六氟化硫气核 SonoVue，这些超声微泡的直径均小于 10 m，能在血液内稳定存在几分钟，提高超声显影的灵敏度。随着技术的发展，研究者们又成功通过共价或非共价的连接方法在微泡表面载定了特殊的分子（如抗体、抗体片段、多肽、碳水化合物等），这就意味着可以通过在微泡表面载定特定的配体，使得微泡可以靶向地与相应受体结合，从而在分子层面及细胞层面实现特异性成像。共价与非共价连接均被用于微泡表面分子连接之中，各具特点。非共价连接既可以利用连接剂将适当的活性部分（生物素、羧酸基、硫醇或马来酰亚胺）连接到已经成型的微泡表面，也可以利用金属螯合脂复合物与蛋白质的多个组氨酸残基（His-tag）的相互作用进行连接20；其中亲和素-生物素相互作用是最强的非共价键之一，广泛应用于生物医学研究和分析实践。共价连接则不需要外来蛋白质或 His-tag，通冷强华等超声造影技术在肾移植术后急性排斥反应中的应用进展第 4 期517过化合物之间的反应构建酰胺键与硫醚键将配体锚定在微泡表面21。目前在相关的研究领域中，利用亲和素-生物素的非共价键连接方式仍然是简便且常用的连接方法。2.2 靶向超声造影在排斥反应诊断中的应用靶向超声微泡是指能够与排斥反应及其他疾病所产生的特殊分子结合的超声微泡，利用其在超声下的特异成像，提升诊断能力。靶向超声微泡在肿瘤诊断与治疗领域的研究较多，此外还可用于炎症、血栓的显像。近年来，随着器官移植领域的发展，研究者们逐渐着手于采用靶向超声成像技术对移植后 AR 进行诊断。移植后 AR 的病理机制较复杂，T 细胞反应在这一过程中起着最主要的作用，T 细胞介导的排斥反应（T cell-mediated rejection，TCMR）特点为趋化因子 CXC 趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）12、CC 趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）3、CCL4 等 介导的免疫细胞浸润移植物，这种浸润由多种炎症细胞组成，其中 CD8+T 细胞占大多数，此外补体 C3a、C5a 等也可推动 TCMR 的进展。因此针对 T 细胞及其潜在浸润机制（趋化因子、相关补体等）的分子靶向超声成像是早期检测鉴别 AR 有效且具备良好前景的方法。2016 年，Grabner 等22的大鼠实验中，构建出了CD3+、CD4+、CD8+T 细胞的靶向超声微泡用于肾移植术后 AR 的显像，并采用电脑软件计算超声下显像强度进行量化分析，通过对比术后病理学结果发现在肾移植术后 2 d 即使排斥反应尚不严重的情况下，移植肾靶向超声造影的信号强度约为对照组（未发生排斥反应组）的 5.7 倍；且随着 AR 的进展，超声信号强度也逐渐增强；术后 4 d 移植肾的信号强度为对照组的 10 倍多；此外，与 ATN、环孢素造成的肾损伤相比，排斥反应表现为更强的信号强度。2018 年，Liu 等23将装载有抗 CD3 抗体的靶向 T 细胞的纳米微泡用于心脏移植术后 AR 的诊断，所使用的纳米微泡直径 500 nm，可以穿过血管上皮，进入组织间隙，从而能更好地反映 T 细胞在局部组织的浸润，在大鼠AR 模型体内、体外的实验中均证明其具有良好的靶向 T 细胞以及超声显影的能力。在 2019 年的一项研究中，Xie 等24则另辟蹊径，采用生物素化抗 CD4抗体将 T 细胞与微泡用非共价方式连接制成靶向超声微泡，由于体内趋化因子等对 T 细胞的诱导作用，靶向微泡会向发生 AR 的局部组织聚集，在超声下通过淋巴细胞-内皮细胞黏附级联成像就可以对急性细胞性排斥反应进行监测并评估严重程度。相较于普通微泡，CD4+T 细胞靶向微泡在超声下具有更强的超声回声，且在移植物未出现弥漫炎症细胞浸润及多灶组织损伤时，仍可表现出靶向发生排斥反应局部组织的性能，并产生一定的信号强度。总的来说，TCMR 作为移植后 AR 最主要的过程，特异性靶向浸润 T 细胞的靶向微泡超声成像对提示 AR 乃至评估其严重程度都有着巨大意义。补体途径的激活也是 AR 的重要一环，C4d 目前仍然是病理诊断中观察的最主要的分子之一，是局部补体和抗体活化的较为持久的标志25。因此应用靶向补体的超声微泡成像技术同样具有研究意义。2018 年，Liao 等26在大鼠 AR 模型中，将生物素化的抗 C4d 抗体锚定在载有链霉亲和素的超声微泡表面，构建了靶向C4d的超声微泡，通过与C4d的结合，在超声下实时监测 C4d 在移植肾的沉积情况，使用破坏-再充盈技术计算不同组间超声下归一化强度差（normalized intensity difference，NID），以定量分析各组靶向超声成像的强度差异，其中重度 C4d 沉积组NID为（24.204.61）%、中度组（15.881.72）%、轻度组（10.981.52）%以及无沉积组（6.411.62）%（P0.01），较好地反映了移植肾局部免疫反应的严重程度，这也是第一个获得 C4d 在同种异体肾移植切片中广泛沉积的定性图像研究。同年 Liao 等27还将该靶向微泡应用于大鼠心脏移植排斥反应的诊断，发现各组的NID均与移植肾接近无沉积组（6.31.4）%，轻 度 组（13.22.1）%，中 度 组（27.22.4）%，P0.01，提供了一种无创的、定量且实时监测 C4d这一重要生物标志物的方法。虽然 C4d 被认为是抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）的一个独特的免疫组织学标记物，但后来的研究中发现在没有 AR 形态组织学证据时也可以存在C4d 沉积，且在 AMR 中可能不存在 C4d 且难以检测到供者特异性抗体。2017 年 Banff标准将与 AMR 强烈相关的基因转录产物/分类器的表达增加，作为仅以 C4d 阳性来诊断 AMR 的补充方法28。将来若能够制备出靶向相关基因转录产物的超声微泡，有可能促进分子生物学产物向临床的转化，并且可能替代 C4d作为主要诊断标准之一的地位。2.3 靶向超声微泡在排斥反应治疗中的应用超声微泡有着空化、声孔效应等特殊的声学特性，518第 14 卷器官移植利用其特性可以促进药物传递以及释放控制29-30。在声压较低时，微泡可以进行稳定的空化作用而在液体中稳定存在，随着声压的不断提升，微泡会发生坍缩爆裂并产生微射流、冲击波等冲击周围局部组织，当能量作用于细胞膜时会发生声孔效应，使得细胞膜表面可逆或不可逆地产生微孔，增加细胞膜的通透性4。近年来超声微泡的这一特性被广泛用于肿瘤治疗领域的研究，当运载着化学药物治疗（化疗）药物的微泡到达肿瘤局部组织时，体外低频高振幅超声使得微泡在局部破裂并产生可逆声孔效应，一方面使得化疗药物局部作用于肿瘤组织，这可以最大限度地减轻化疗药物的全身不良反应；另一方面由于微血管及细胞膜的通透性增加，药物渗透及递送效率得到了提升31。另外针对肿瘤标记分子的靶向超声微泡可以让微泡进一步聚集在病灶局部，进一步提升了微泡在肿瘤治疗方面的研究意义。如果能将超声微泡所具备的这种能力应用于 AR的治疗，似乎能够解决排斥反应与感染之间的矛盾，从而使受者获益。目前临床上对于 AR 的治疗方案有糖皮质激素冲击、多克隆抗体、单克隆抗体等疗法，这些传统的治疗手段会进一步抑制全身免疫系统及免疫细胞，导致感染风险增加，且抗感染药物不良反应巨大。靶向超声微泡作为一个平台，不仅可以搭载药物，还可以通过体外超声波的作用控制药物释放以及触发声孔效应，来进一步减少药物的剂量及全身不良反应，同时增强药物局部作用效能。2018年，Liao等32继之前在心脏移植 AMR 模型中的研究，将抗 C4d 抗体和一氧化氮（nitric oxide，NO）分别装载至靶向超声微泡表面（NO-MBC4d），综合抗 C4d 抗体靶向定位排斥反应发生部位及 NO 的抗炎及免疫抑制能力，结果显示相较于对照组，NO-MBC4d治疗组移植物存活时间更长、组织局部免疫细胞的浸润数量更少、调节性 T 细胞浸润更多。2019 年，Liu 等33在大鼠 AR模型中，通过使用薄膜水合法将他克莫司锚定在微泡表面（FK506-MB），然后在体外用 1 MHz 的超声波诱发微泡的空化效应促使他克莫司在移植物局部的释放，并使用超高效液相色谱串联质谱法测定局部他克莫司浓度，结果显示与单纯全身应用他克莫司相比，FK506-MB 组的局部他克莫司浓度更高，且全血中他克莫司的浓度更低、移植物平均存活时间更长；免疫组织化学及病理学结果显示 FK506-MB 组 83%的移植物表现为轻度或中度排斥反应，组织中免疫细胞及相关细胞因子浸润更少，而他克莫司组则有 50%的移植物表现为重度排斥反应。小 干 扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制半乳糖凝集素（galectin）-7 的表达是一种移植后早期诱导免疫耐受的精准治疗策略，具有良好的应用前景34-35。目前研究中采用病毒转染的方法虽然能有效运载 siRNA，但是其生物安全性不佳，需要一种更加安全的运载方式36-37。2020 年，Wang 等38将galectin-7-siRNA 载定于微泡表面，利用微泡的空化效应使 siRNA 高效转运并释放进而抑制 galectin-7 的表达，结果显示 60%的 galectin-7 基因能够被抑制，且在未使用免疫抑制药的情况下，仅表现出中度以下的排斥反应，提示微泡在基因层面预防、治疗移植后排斥反应并诱导免疫耐受的潜力。超声微泡的靶向能力和空化效应均能够有效地减轻 AR 的严重程度。口服免疫抑制药仍是目前最能被受者接受的长期治疗方案，然而当出现移植后排斥反应并发病原体感染时，若采用超声微泡来增加免疫抑制药在移植物局部的分布而不影响全身免疫系统的功能，似乎是一种比较理想的治疗方案。3 小 结超声造影作为一种安全可重复、快速便捷的非侵入性诊断技术，在定量分析技术的赋能下变得更为客观、准确，且进一步展现出其动态实时评估移植肾功能的优势，能够早期迅速发现 AR。靶向超声微泡则为超声诊断替代病理诊断提供了可能性，具有特异度及灵敏度高的特点，为解决 AR 与常规冲击治疗后引发机会性感染之间的矛盾提供了良好的方法。总而言之，超声造影技术中靶向超声微泡的使用可能将成为肾移植术后 AR 诊断及治疗的理想手段，但是需要进一步的研究来促进其向临床的转化。参考文献：1 BECKER JU,SERON D,RABANT M,et al.Evolution of the definition of rejection in kidney transplantation and its use as an endpoint in clinical trialsJ.Transpl Int,2022,35:10141.DOI:10.3389/ti.2022.10141.2 FATTHY M,SALEH A,AHMED RA,et 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