腹腔注射α-半乳糖苷神经酰...自然杀伤T细胞及亚群的影响_彭楠.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺对小鼠肺恒定自然杀伤T细胞及亚群的影响彭楠1，张景楠2，陈俊玉1，滕景芳2，孟明2，曹彩霞3，王彦1作者单位：1河北大学临床医学院、河北大学附属医院检验科，河北 保定071000；2河北大学基础医学院，河北 保定071000；3保定市中心血站，河北 保定071000通信作者：王彦，男，主任技师，硕士生导师，研究方向为临床检验诊断学，Email：基金项目：国家自然科学基金面上项目（81771755）摘要：目的 探讨腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺（-GalCer）对小鼠肺恒定自然杀伤 T细胞（iNKT）、细胞亚群及外周血细胞因子的影响，从而为治疗相关肺部疾病提供基础研究数据。方法 60只68周龄雄性C57BL/6 小鼠，采用随机数字表法分为-GalCer干预组和正常对照组，每组30只，选择不同时间点观察干预组与对照组小鼠肺iNKT 细胞、亚群及外周血细胞因子的变化。结果 组间比较发现，与对照组（3.490.25）%相比，腹腔注射-GalCer可引起肺脏iNKT细胞频率及亚群的变化，差异有统计学意义（P0.05）。-GalCer 干预组肺 iNKT 细胞频率前 2 d（6.560.05）%明显升高而后 d6（2.560.08）%、d8（2.640.14）%、d10（2.370.24）%降低（P0.05）。iNKT 1细胞频率低于对照组且呈降低的趋势（P0.05）。iNKT 2细胞频率高于对照组在第4天肺部iNKT2细胞频率达到峰值，随后降低（P0.05），与第2天相比，第4、6、8、10天iNKT17细胞频率均显著升高（P0.05）。组间比较发现，干预组与对照组外周血血清IFN-、IL-4、IL-17A浓度比较，差异有统计学意义，-GalCer干预组在不同时间点IFN-、IL-4、IL-17A 浓度比较，差异有统计学意义，与第2天相比，IFN-、IL-4水平于第6天、第8天均降低（P0.05）；IL-17A 水平于第6天降低（P0.05）。-GalCer干预组的IFN-水平与对照组相比均有明显升高，差异有统计学意义（P0.05）；除第8天外，-GalCer干预组的IL-4水平与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）；第2天、第8天-GalCer干预组的IL-17A水平均低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 腹腔注射-GalCer对小鼠肺组织 iNKT细胞和亚群有不同的激活效应；iNKT细胞激活后，会由脉管系统迁入间质；腹腔注射-GalCer可诱导血清细胞因子的变化，提示-GalCer注射可影响机体免疫功能。关键词：半乳糖神经酰胺类；腹腔注射；恒定自然杀伤T细胞；恒定自然杀伤T细胞亚群Effects of intraperitoneal injection of-GalCer on pulmonary iNKT cells and subsetsPENG Nan1,ZHANG Jingnan2,CHEN Junyu 1,TENG Jingfang 2,MENG Ming2,CAO Caixia3,WANG Yan1Author Affiliations:1Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Hebei University,Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;2College of Basic Medicine,Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;3Baoding Center Blood Bank,Baoding,Hebei 071000,ChinaAbstract：Objective To explore the effects of-galactosylceramide(-GalCer)treatment at different time on iNKT cells,cell subsets and peripheral blood cytokines of mouse lung,so as to provide basic research data for the treatment of related lung diseases.Methods Sixty C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were randomly divided into-GalCer intervention group and control group,with 30 mice in each group.Changes of iNKT cells,cell subsets and cytokines in peripheral blood of mice in-GalCer intervention group and control group were observed at different time.Results Comparison between groups found that intraperitoneal injection-GalCer could cause changes of lung iNKT cells frequency and subsets compared with the control group(3.490.25)%,and the difference was statistically significant(P0.05).The frequency of lung iNKT cells increased significantly in the first 2 days(6.560.05)%and then decreased d6(2.560.08)%,d8(2.640.14)%,d10(2.370.24)%(P0.05).The frequency of lung iNKT 1 cells in-GalCer intervention group was lower than that in the control group(P0.05).The iNKT 2 cell frequency was higher than the control lung,iNKT2 cell frequency peaked on day 4 and subsequently decreased(P0.05),and the iNKT17 cell frequency was significantly higher on days 4,6,8,and 10 compared to day 2(P0.05).Comparison between groups found that peripheral serum IFN-,IL-4 and IL-17A showed IFN-,IL-4 and IL-17A concentrations at different time points,IFN-and IL-4 levels decreased on day 6 and 8(P0.05)and I L-17A levels 药学研究引用本文：彭楠，张景楠，陈俊玉，等.腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺对小鼠肺恒定自然杀伤T细胞及亚群的影响J.安徽医药，2023，27（8）：1492-1496.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.08.003.1492网络首发时间：2023-07-06 13:10:19网络首发地址：https:/ 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）decreased on day 6(P0.05).IFN-levels in-GalCer intervention compared with the control group(P0.05),IL-4 levels except day 8 in-GalCer ntervention(P0.05),and IL-17A was lower than the control group(P0.05).Conclusions Intraperitoneal injection of-GalCer has different activation effects on iNKT1 cells and subsets in mouse lung tissue.iNKT cells migrate from the vasculature to the interstitium after activation.The intraperitoneal injection of-GalCer can induce changes in serum cytokines,suggesting that-GalCer injection can affect the bodys immune function.Key words：Galactosylceramides;Intraperitoneal injection;Invariant nature kiler T cell;Invariant nature kiler T cell subsets恒定自然杀伤 T 细胞（invariant nature kiler T cell，iNKT）是 T淋巴细胞中一个独特的亚群，可识别 CD1d分子呈递的脂类抗原。活化后分泌多种细胞因子，直接或间接参与各项机体免疫反应1。iNKT细胞在胸腺中分化成不同的亚群，包括iNKT1主要分泌干扰素-（IFN-）、iNKT2 主要分泌白细胞介素-4（IL-4）、iNKT17 主要分泌白细胞介素-17A（IL-17A）2。最新研究证明，特异性激活iNKT 细胞亚群，可以更有效地发挥其免疫调节和治疗的作用，在感染、肿瘤等疾病中，我们希望iNKT细胞产生促炎性因子的作用，而在自身免疫性疾病时，我们更希望激活 iNKT 细胞的抗炎性免疫反应3-4。-半乳糖苷神经酰胺（-GalCer）是iNKT细胞特异性激活剂，是已知的最有效的iNKT细胞选择性抗原5。但是大剂量的-GalCer刺激，会使iNKT细胞在数月内进入免疫失能状态，对后续的抗原刺激反应减弱或无应答6。在小鼠肺中，iNKT细胞在肺脉管系统和间质组织间建立了非循环群体7。大多数 iNKT1 和iNKT2细胞存在于脉管系统中，iNKT17 细胞主要存在于组织间质8-9。呼吸系统的免疫系统承受着巨大的负荷和种类繁多的外来抗原，引发多种免疫反应10。因此研究腹腔注射-GalCer对小鼠肺iNKT细胞、细胞亚群及外周血细胞因子的影响，观察其动态变化，从而为后续获得临床免疫细胞治疗提供基础研究数据，同时也可为疫苗的研发提供新的思路。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物68周龄的雄性C57BL/6J小鼠，引入SPF 级动物室后，进行1周适应性饲养，随后进行实验。该实验已通过河北大学动物福利伦理委员会的批准且在操作过程中严格遵守 实验动物保护条例。1.1.2主要试剂与仪器-GalCer（北京 AdipoGen）；戊巴比妥钠、小鼠组织淋巴细胞分离液、0.5 mol/L EDTA（北京索莱宝）；Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer（美国 Invitrogen）；FITC Hamster Anti-Mouse TCR-Chain、AlexaFluor647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORt、PE-Cy7 Mouse Anti-T-bet（美国 BD）；T-selected-CD1d tetramer-PE（日本 MBL）；Mouse-IFN-ELISA、Mouse-IL-4 ELISA、Mouse-IL-17A ELISA（联科生物，杭州）。Olympus-光学显微镜（日本，Olympus）；流式细胞仪FACSCantoII（美国，BD Pharmingen）；酶标仪（美国，Bio-tek EPOCH）；低温高速离心机（美国，Beckman公司）。1.2实验方法1.2.1小鼠模型制备及干预C57BL/6小鼠，雄性，每只体质量（202）g，采用随机数字表法分为正常对照组和-GalCer 干预组，每组30只，-GalCer 干预组每克体质量注射-GalCer 100 ng，正常对照组注射同等体积的生理盐水。于小鼠腹腔注射-Galcer 2、4、6、8、10 d后，检测各组小鼠肺内iNKT细胞及亚群的变化；在2、6、8 d后检测小鼠外周血细胞因子的变化。1.2.2标本的获取与处理腹腔注射1%的苯巴比妥钠盐（50 mg/kg）对小鼠麻醉后进行眼球取血，12 000 r/min，4 离心 8 min，收集上清转至 EP 管中，80 冰箱低温保存用于ELISA检测。随后脱颈椎处死小鼠，用外科剪及镊子获取小鼠的肺组织，小鼠肺脏于浸润冰PBS缓冲液的细胞筛上剪碎、研磨获取单细胞悬液。细胞经PBS洗涤离心2次，1 000 r/min，4 离心5 min获取细胞沉淀。重悬后过淋巴细胞分离液，再次经PBS洗涤离心2次，弃上清后获取单细胞悬液。1.2.3小鼠外周血血清细胞因子的检测提前将试剂及样本平衡至室温并确定所需的酶标板孔数，按照ELISA试剂盒说明书规范操作，检测小鼠血清IFN-、IL-4和IL-17A 的表达水平。1.2.4肺淋巴细胞中iNKT频率检测收集“1.2.2”获取的单细胞悬液于流式管中，每管106个细胞，加入 1 L FITC Hamster Anti-Mouse TCR-Chain 和 1 L PE 标记的负载-GalCer 的 CD1d 四聚体（PE-GalCer/CD1d-tetramer），涡旋混匀 4 避光孵育 30 min，PBS清洗2次后用500 L 4 的PBS重悬细胞，吹打混匀经流式细胞仪检测iNKT（TCR-+-GalCer/CD1d-tetramer+）细胞频率。-GalCer/CD1d-tetramer为本实验室配制：采用体积分数为 0.5%的吐温 1493安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）20和质量分数为0.9%的生理盐水将浓度为1 g/L的-GalCer贮存液稀释至200 mg/L，随后将5 L稀释液加入到100 L CD1d-tetramer中，混匀，室温过夜负载1820 h后于4 储存备用。1.2.5肺iNKT1、iNKT2、iNKT17亚群频率检测同上述1.2.4小节所述，加入FITC Hamster Anti-Mouse TCR-Chain 和 PE-GalCer/CD1d-tetramer 对分离的淋巴细胞进行表染，PBS清洗2次后，按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 试剂盒说明书对细胞进行透化固定处理，进行亚群检测。每支流式管中加入1 mL透化固定液于4 避光透化固定45 min；加入1 mL 1破膜缓冲液使偶联荧光素的抗体充分进入细胞，500 g，4 离心5 min；弃上清后加入AlexaFluor647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORt、PE/Cyanine7 Mouse Anti-T-bet 各 1 L，吹打混匀后 4 避光孵育 30 min，每管加入 1破膜缓冲液1 mL，500 g，4 离心5 min。弃上清后用500 L 4 的PBS重悬细胞，吹打混匀后上机检测iNKT细胞亚群频率。在淋巴细胞群中以TCR-+-GalCer/CD1d-tetramer+双阳性细胞群为 iNKT 细胞。在 iNKT 细胞群中，以 T-bet+PLZF-为 iNKT1 亚群，T-bet-PLZF+为 iNKT2 亚 群，RORt+PLZF-为iNKT17亚群。1.3统计学方法所有数据应用SPSS 24.0进行统计学分析，计量数据以x s表示，两组不同时间点之间比较采用重复测量数据方差分析，同组内不同时间点的两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠肺脏iNKT细胞频率及亚群的变化2.1.1iNKT细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=12.61，P0.001）和时间因素（F=233.41，P0.001）对iNKT细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=195.53，P0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT细胞频率在各时间点差异无统计学意义；-GalCer干预组iNKT细胞频率在第4、6、8、10天明显时明显低于第2天（P0.05）；组间分析结果显示，-GalCer干预组iNKT细胞频率在第2天时高于对照组，第6、8、10天时低于对照组（P0.05）。见表1。2.1.2iNKT1亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=176.04，P0.001）和时间因素（F=16.41，P0.001）对 iNKT1亚群细胞频率均有影响，且两者之间存在交互作用（F=19.70，P0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT1亚群细胞频率在各时间点差异无统计学意义；-GalCer干预组iNKT1细胞频率在第4、6、8、10天明显时明显低于第2天（P0.05）；组间分析结果显示，-GalCer干预组iNKT1亚群细胞频率在第2、4、6、8、10天时均低于对照组（P0.05）。见表2。2.1.3iNKT2亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=108.13，P0.001）和时间因素（F=92.97，P0.001）对 iNKT2细胞频率均有影 响，且 两 者 之 间 存 在 交 互 作 用（F=92.93，P0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT2细胞频率在各时间点差异无统计学意义；-GalCer干预组iNKT细胞频率在第4、6、8、10天明显时明显高于第2天（P0.05）；组间分析结果显示，-GalCer干预组iNKT细胞频率在第2、4、6、8、10天时均高于对照组（P0.05）。见表3。2.1.4iNKT17亚群细胞频率重复测量数据的方差分析结果显示，组别因素（F=8.21，P=0.001）和时间因素（F=43.29，P0.001）对iNKT17细胞频率均有影 响，且 两 者 之 间 存 在 交 互 作 用（F=38.72，P0.001）。组内分析结果显示，对照组iNKT17细胞频率在各时间点的差异不大；-GalCer干预组iNKT细胞频率在第 4、6、8、10 天明显时明显高第 2 天（P0.05）；组间分析结果显示-GalCer干预组iNKT细胞频率在第2天时均低于对照组，第4、8天高于对照组（P0.05）。见表4。表2小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞1亚群细胞频率变化/（%，x s）组别/时间对照组-GalCer干预组重复次数66第2天60.577.1825.031.05第4天61.475.6323.331.42第6天61.136.2111.580.94第8天62.473.911.880.25第10天61.805.0623.371.27注：与第2天相比，P0.05。与对照组相比，P0.05。表1小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞频率变化/（%，x s）组别对照组-GalCer干预组重复次数66第2天3.490.256.560.05第4天3.380.273.620.19第6天3.290.212.560.08第8天3.310.292.640.14第10天3.330.212.370.24注：与第2天相比，P0.05。与对照组相比，P0.05。1494安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）2.2腹腔注射-GalCer后不同时间引发血清中细胞因子的变化重复测量数据的方差分析结果显示，组 别 因 素（F=95.95、10.29、64.29，P0.001、0.003、0.001）和时间因素（F=546.35、6.33、14.87，P0.001、0.006、0.001）对IFN-、IL-4、IL-17A水平均有影响，且两者之间存在交互作用（F=5.87、26.68、3.43，P=0.007、0.001、0.046）。组内分析结果显示，对照组第6天和第8天的IFN-水平低于第2天，第6天的IL-4水平高于第2天，第6天的IL-17A水平低于第2天；-GalCer干预组第6天和第8天的IFN-和IL-4水平低于第2天，第6天的IL-17A水平低于第2天；均差异有统计学意义（P0.05）。组间分析结果显示-GalCer干预组在第2天时IFN-和IL-4水平高于对照组，IL-17A水平低于对照组；在第6天时IFN-水平高于对照组，IL-4和IL-17A水平低于对照组；在第8天时IFN-水平高于对照组，IL-17A水平低于对照组；上述均差异有统计学意义（P0.05）。见表5。3讨论iNKT细胞是连接先天性与适应性免疫反应的桥梁，其恒定的 T 细胞受体识别 MHC-类分子 CD1d 呈递的糖脂类抗原，从而导致细胞因子达到“爆炸性”效应反应11。微环境的改变也可以调节肺中 iNKT 细胞稳态12。iNKT 细胞活化后可分泌Th1型促炎（如IFN-）或Th2型抑炎细胞因子（IL-4）13。iNKT细胞在肺组织中虽远不如在肝脏中丰富，但其确实对于某些肺部疾病产生了深远影响。例如iNKT 细胞反应迅速，因此在对呼吸道感染的反应中发挥关键作用12；有研究14表明iNKT细胞在介导气道高反应性（AHR）中发挥作用。-GalCer能够与抗原提呈细胞表面CD1d分子结合，提呈给iNKT细胞表面的TCR受体，从而激活iNKT细胞，发挥致炎或抑炎作用，有文章15-16报道，腹腔注射抗原最容易被巨噬细胞所提呈。研究16表明不同的组织中富含不同的 iNKT 细胞亚群，例如，在小鼠肝脏中iNKT1细胞亚群占主导地位，而 iNKT17 细胞主要位于肺、淋巴结和皮肤中。iNKT2 细胞分布在肺和脾几个部位，但它们在肠系膜淋巴结中的含量更为丰富2。本项研究数据中显示，小鼠肺脏iNKT1多于iNKT2，推测原因可能是由于腹腔注射过程中，药物导致小鼠肺脏中微生物群发生改变12，具体原因还有待进一步探查。有研究17表明，在基础条件下的肺中，iNKT 细胞主要存在于脉管系统中，而一小部分存在于间质中，我们与其所得结果结论一致，腹腔注射-GalCer后，间质中iNKT17亚群频率随时间而升高，脉管系统中的iNKT1亚群频率明显降低，说明在注入激活剂后，肺iNKT细胞迁出脉管系统而进入间质，这种行为有着有着很强的特异性。通过对小鼠不同时间的动态观察，我们可以发现，小鼠肺脏中iNKT细胞频率呈现前期（2 d）升高，后期降低的趋势，我们推测是由于注射-GalCer 2 d后再取材检测，已经错过了小鼠体内肺iNKT细表3小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞2亚群细胞频率变化/（%，x s）组别对照组-GalCer干预组重复次数66第2天2.410.149.440.05第4天2.450.1721.830.61第6天2.460.053.900.75第8天2.390.0912.863.46第10天2.450.1714.491.04注：与第2天相比，P0.05。与对照组相比，P0.05。表4小鼠肺脏恒定自然杀伤T细胞17亚群细胞频率变化/（%，x s）组别对照组-GalCer干预组重复次数66第2天15.502.993.360.90第4天16.501.3122.671.36第6天16.131.9114.771.79第8天15.802.4724.904.16第10天14.702.1616.182.03注：与第2天相比，P0.05。与对照组相比，P0.05。表5小鼠腹腔注射-GalCer后血清中细胞因子变化统计/（ng/L，x s）组别IFN-对照组 -GalCer 干预组IL-4 对照组 -GalCer 干预组IL-17A 对照组 -GalCer 干预组重复次数666666第2天403.566.18500.457.6832.380.4539.550.1447.251.6735.860.48第6天84.746.41110.192.6543.500.5631.491.9233.642.0930.580.84第8天52.790.96121.040.6432.890.7833.490.3952.780.4635.591.44注：-GalCer为-半乳糖苷神经酰胺，IFN-为干扰素-，IL-4为白细胞介素-4，IL-17A为白细胞介素-17A。与第2天相比，P0.05。与对照组相比，P0.05。1495安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）胞频率达到最大的时间，从而后续时间内，iNKT细胞频率一直降低；小鼠肺脏中iNKT1亚群频率在腹腔注射-GalCer后一直处于下降的趋势，其中第8天达到最低值（1.880.25）%，这可能是由于肺部的微环境限制了iNKT1细胞亚群的增殖，或者已经增殖的 iNKT1 细胞迁至外周所致11；小鼠肺脏中iNKT2亚群频率一直处于上升的趋势，其中第4天达到最高值（21.830.61）%，这可能是由于正常机体内iNKT1与iNKT2是一种平衡关系，二者此消彼长，当iNKT1亚群频率受到明显抑制时，在-GalCer的刺激下，iNKT2增长，维持机体的健康；小鼠肺脏中iNKT17亚群频率升高，文章表明-连环蛋白调节 iNKT 细胞分化为 iNKT2 和 iNKT1718。因此，可以在一定程度上说明两种亚群有一定的相关性，对肺部炎症可以产生一定的影响。iNKT细胞的免疫调节作用依赖于细胞因子的分泌，因此我们也做了相应小鼠外周血细胞因子的变化统计试验，腹腔注射-GalCer后，IFN-浓度一直处于上升的趋势，其中，第 2 天升高最明显（500.457.68）ng/L，IFN-主要是由iNKT1细胞产生的Th1型细胞因子，因此我们推测，腹腔注射-Galcer 以升高小鼠体内 iNKT1 亚群为主，已有研究报道，IFN-会抑制外周血IL-4的释放16，但本研究显示，第2天IFN-与IL-2均呈升高趋势，推测原因可能与腹腔注射-GalCer可以导致小鼠外周血中IL-10水平增高有关19。IL-17A 被认为是炎症反应的重要调节因子，研究表明小鼠注射-GalCer后会导致IL-17A快速而稳定地释放到血液中20，而研究数据显示IL-17A含量下降，其原因有待进一步研究。综上所述，腹腔注射-GalCer可以对肺部iNKT细胞及亚群的激活可以产生不同影响。iNKT细胞不同亚群发挥的免疫调节与免疫治疗作用是不同的，做此项研究可以为日后肺部相关疾病的细胞治疗提供基础性研究数据。同时外周血细胞因子的变化也进一步提示了腹腔注射-GalCer会影响机体的免疫功能。参考文献1 GUILLAUME J，PAUWELS N，ASPESLAGH S，et al.Synthesis of C-5 and C-6-modified-GalCer analogues as iNKT-cell agonists J.Bioorg Med Chem，2015，23（13）：3175-3182.2 CROSBY CM，KRONENBERG M.Tissue-specific functions of invariant natural killer T cells J.Nat Rev Immunol，2018，18（9）：559-574.3 CHEN D，LIU H，WANG Y，et al.Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer TcellsJ.International Immunopharmacology 2019，67：427-4404 ZHANG Y，SPRINGFIELD R，CHEN S，et al.alpha-GalCer and iNKT cell-based cancer immunotherapy：realizi ng the therapeutic potentials J.Front Immunol，2019，10：1126.5 BAUER S，KIRSCHNING CJ，HACKER H，et al.Human TLR9 confers respon-siveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognitionJ.J Proc 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